绿色木霉耐热β-葡萄糖苷酶分离纯化及酶学性质研究

旨在对绿色木霉-葡萄糖苷酶进行分离纯化并研究其酶学性质。对绿色木霉GIM3.139进行摇瓶发酵,经离心超滤和Sephadex G-200凝胶层析,得到纯化后的β-葡萄糖苷酶,并研究其酶学性质。结果显示,分离纯化组分经PAGE电泳检测达到电泳纯,研究发现,该酶最适反应温度为80℃,热稳定性好,在70-95℃时能长时间保持较高活力,最适p H值为6.5,耐酸碱稳定性好。金属离子中,Fe3+、Mg2+、K+对β-葡萄糖苷酶的活性起抑制作用,其中Fe3+对该酶的抑制作用最为明显,Fe2+、Mn2+对β-葡萄糖苷酶的活性起激活作用,其中Mn2+对β-葡萄糖苷酶的激活作用最为明显。有机溶剂中,甲醇、丙酮对该酶起到激活作用,其中甲醇的激活作用最明显,而乙酸乙酯对该酶具有明显的抑制作用。分离纯化得到了电泳纯的β-葡萄糖苷酶,并掌握了其基本的酶学性质。     

Bacillus sublitis JH-1木聚糖酶的纯化及酶学性质

对枯草芽孢杆菌Bacillus sublitis JH-1胞外木聚糖酶的纯化及酶学性质进行了研究。通过(NH4)2SO4分级沉淀法、透析除盐、DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换层析等方法,从枯草芽孢杆菌Bacillus sublitis JH-1发酵液中分离纯化得到了电泳纯的木聚糖酶,其相对分子质量为3.45×104,比活力为75 899.68 U/mg。酶学性质研究结果表明:该酶的最适p H为6.0,在最适p H条件下保温2 h后仍能保持75%的活力,而p H越高,活力下降越快,表明为酸性木聚糖酶;最适温度为55℃,在50~60℃保温2 h后仍具有70%左右相对较高的活性,说明该酶具有较强的耐高温性;Fe2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ba2+和低浓度(5 mmol/L)的Fe3+对酶的活性有促进作用,而Mn2+和高浓度(10mmol/L)的Fe3+对酶的活性有抑制作用。     

烟草磷酸吡哆醛水解酶的分离纯化与表征

采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤和SP Sephadex C-25阳离子交换柱层析等步骤,对烟草磷酸吡哆醛水解酶进行了分离纯化。结果表明:该酶被纯化了119.6倍,得率为28.49%,经凝胶过滤和SDS-PAGE测得该酶的全分子量为49.6kDa,亚基分子量约为25kDa;该酶最适温度为50℃,最适反应pH为5.5;Mg2+、Ca2+、Mn2+等对该酶有激活作用,金属离子螯合剂EDTA对酶有抑制作用,加入Mg2+后抑制作用得到解除;在最适反应条件下,测得反应底物磷酸吡哆醛(PLP)和磷酸吡哆胺(PMP)的Km值分别为0.23mmol/L和0.56mmol/L。     

樟子松外生菌根中NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶的酶学性质研究

对褐环乳牛肝菌-樟子松菌根组织、樟子松根组织及褐环乳牛肝菌纯培养菌丝的异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)进行纯化和酶学性质鉴定。通过硫酸铵分级沉淀及葡聚糖凝胶层析纯化后的IDH进行SDS-PAGE电泳检测,并进行3种来源酶的酶学性质鉴定。菌根组织、根组织及真菌纯培养菌丝NADP-IDH对NADP+的Km值分别为10.7μmol/L、11.4μmol/L和22.1μmol/L;对异柠檬酸的Km值分别为71.7μmol/L、79.3μmol/L和87.8μmol/L。最适p H分别为8.2、8.0和7.5,略偏碱性。菌根IDH和根IDH的最适反应温度为45℃,真菌IDH的最适反应温度为42℃。3种IDH的活性依赖于不同的二价金属阳离子的存在,Mn2+、Mg2+存在时酶活性最强,Ca2+、Co2+、Cu2+和Zn2+对酶的活性有较强抑制作用。菌根真菌与樟子松形成外生菌根之后异柠檬酸脱氢酶的蛋白含量及酶活力都得到了提高。     

海芋过氧化氢酶的分离纯化及其性质

为了探索海芋(Alocasia macrorrhiza)过氧化氢酶的分子结构和酶学性质,提取海芋新鲜叶片、叶柄和块茎的粗酶进行活力比较和同工酶分析。用Sephadex G 200凝胶过滤层析法将粗酶分离纯化,以PAGE电泳对酶纯度鉴定。结果表明:海芋过氧化氢酶较单一,没有同工酶。经层析法进行分离获得电泳纯的过氧化氢酶,其活力回收率为40.83%,纯化倍数为8.88倍。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果发现:该酶由5条肽链组成,全酶相对分子质量为2.621 1×105。酶学性质研究结果表明:该酶最适反应温度40℃,最适p H为7.5。在25~45℃和p H 6.0~9.0下,该酶能保持较强的催化活力,稳定性较好。在最适条件下,该酶的Km值为16.43mmol/L,对底物的亲和力较好。甲醇、乙醇和异丙醇对此酶活力有显著的抑制作用。     

卡瑞苯西思伯克霍尔德氏菌卤乙酸脱卤酶的分离纯化及性质

从云南西北部土样中分离到一株卡瑞苯西思伯克霍尔德氏菌(Burkholderia caribensis),它在氯乙酸培养基中能产生较高活性的卤乙酸脱卤酶。经硫酸铵盐析、DEAE SephadexA50柱层析、羟基磷灰石柱层析、Sephadex G200 凝胶过滤后,获得电泳纯酶。用SDSPAGE测定酶分子量为46kD。水解氯乙酸的Km值为3.7×10-3mol/L。酶反应的最适温度为40℃,最适pH值为9.5。金属离子及CN-、EDTA对该酶有不同程度的影响,Hg2+和CN-则对该酶有强烈的抑制作用。     

黑蚂蚁纤溶活性蛋白的分离纯化及其性质研究

通过硫酸铵分段盐析、DEAE-52离子交换和Sephacryl S-100分子筛层析从黑蚂蚁(Polyrhachis vicina Roger)中纯化到一种纤溶活性蛋白,再通过SDS-PAGE凝胶电泳测定其分子质量,Braford法测定蛋白浓度,蒽酮硫酸法测定其含糖量,纤维蛋白平板法测定其酶活性。并研究温度、p H改变及不同金属离子对其活性的影响。结果显示,分离得到的活性蛋白具有纤溶活性,其分子质量约为25 k D,蛋白浓度为2.804 1 mg/m L,糖含量为8.171 4%,酶活力为67.455 2 U/g。研究表明,该活性蛋白最适温度为45℃,最适p H为3.0,p H在4.0~8.0基本稳定,Na+、K+对其酶活性影响较小,Mg2+对该酶纤溶活性有强烈的激活作用,而Zn2+、Ba2+、Mn2+、Ca2+等对此酶活力有没明显的抑制作用。     

白腐菌产漆酶的纯化及部分酶学性质

对白腐菌W 1产生的漆酶粗酶液通过超滤浓缩、分子筛和离子交换层析进行纯化 .用SDS PAGE证明该酶的分子量大约为 6 2 4kD .等电聚焦电泳显示该酶的等电点为 3 5 .酶反应的最适温度为 5 0℃ ,最适pH值为 4 5 .此酶氧化DMP的Km 值为 3 84× 10 -5mol L .金属离子对酶活的影响很大 ,其中K+ 、Mn2 + 、Ag+ 对酶活有促进作用 ,Fe2 + 、Fe3 + 、Hg2 + 、Co2 + 、Ba2 + 等对酶活有明显的抑制作用 .酶对部分染料也有一定的脱色效果     

嗜热踝节菌脂肪酶(TTL)的重组表达及催化合成普瑞巴林手性中间体

以催化合成普瑞巴林中间体(3 S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸为目标,通过基因挖掘得到来源为嗜热踝节菌的脂肪酶氨基酸序列,构建了基因工程菌Escherichia coli BL21/p ET28b-TTL,在16℃成功诱导表达了嗜热踝节菌脂肪酶TTL。分离纯化得到TTL电泳纯酶,其最适反应温度为50℃,在50℃的半衰期为14.5 d,表明TTL具有良好的热稳定性;TTL最适p H为8.0,在p H 7.0~8.5时稳定性好。TTL在50℃、p H 8.0条件下,催化100 mmol/L外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解转化率达42%以上,产物的对映体过量值(e.e.值)94%。这表明TTL在化学-酶法合成普瑞巴林中具有较大应用潜力。     

镰刀菌Q7-31T果胶酶PGL1的分离纯化、酶学性质鉴定及结构分析

从镰刀菌Q7-31T中分离纯化和鉴定果胶酶并进行生物信息学分析,旨在探究果胶酶降解植物细胞壁的作用,进一步完善镰刀菌属纤维素降解酶系信息。以0.8%蛋白胨为氮源,0.5%燕麦秸秆为碳源诱导发酵培养镰刀菌Q7-31T;采用Sephacry S-100凝胶柱层析和DEAE琼脂糖弱阴离子交换柱层析对粗酶液进行分离纯化得到果胶酶PGL1;对其进行了酶学性质分析和串联质谱鉴定;最后通过生物信息学分析结构及预测功能。PGL1分子量为36.21 k D,等电点为8.13;PGL1最适反应温度为40℃,最适反应p H为8;在20℃到50℃和p H 8.0到10.0能保持较高稳定性;Na~+、K~+、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Ca~(2+)和Fe~(2+)对PGL1有抑制作用,串联质谱鉴定表明该蛋白为一种新型PL-1家族果胶酶。PGL1的二级结构构成元件中无规则卷曲和延伸链比例较高,分别占37.96%和31.17%;PGL1两端亲水性强而中间部分疏水性强;磷酸化位点共13个(Ser∶9;Thr∶3;Tyr∶1);PGL1存在2个潜在的N-糖基化位点;跨膜结构域预测显示其为分泌酶;功能结构域预测出其降解植物细胞壁的作用。从镰刀菌Q7-31T中分离纯化得到一种新型PL-1家族果胶酶PGL1并对其进行了生物信息学分析。