重组人白细胞介素-3真核表达质粒直接注射小鼠骨骼肌的体内表达研究

将含有人白细胞介素-3基因(hIL-3)cD-NA的真核表达质粒直接注射小鼠骨骼肌,观察hIL-3基因在小鼠肌肉及体内的分泌表达情况。原位分子杂交及免疫组化结果显示注射重组质粒后,第14大重组质粒全部进入到骨骼肌细胞内并有IL-3的表达。ELISA结果显示,注射重组质粒DNA后,第21天小鼠血液中IL-3的含量最高,约有67ng/ml,第14天次之,约51ng/ml,第28天和第7天相近,约34ng/ml。生物学活性检测结果表明,实验组小鼠血清有维持IL-3依赖的TF-1细胞株生长的作用。表明重组质粒DNA直接注射骨骼肌后进入到肌细胞内并表达IL-3,进入血液,而且表达产物有生物学活性。     

重组人白细胞介素—3真核表达质粒直接注射小鼠骨骼肌的体内表…

将含有人白细胞介素－３基因ｃＤ－ＮＡ的真核表达质粒直接注射小鼠骨骼肌,观察ｈＩＬ－３基因在小鼠肌肉及体内的分泌表达情况。原位分子杂交及免疫组化结果显示注射重组质粒后,第１４天重组质粒全部进入到骨骼肌细胞内并有ＩＬ－３的表达。     

直接注射质粒DNA表达人G—CSF的研究

转基因动物研究发展至今,对于所构建煌表达载体有效性如何,一直缺乏一个验证体系。由于转基因动物的建立较为繁琐复杂,投资大,因而直接用转基因动物去验证所用元件是不明智的。为此,我们采用小鼠乳清酸蛋白（WAP）基因（2．6Kb)为调控序列,人G－CSF基因组基因为目的的自然,将WAP第一内含子置于G－CSF基因5’端,构建成转基因动物乳腺表达载体pINGG（Fig.1）。将表达质粒直接注射到怀孕小鼠乳腺。于分婉第8天取乳汗进行ELISA检测。在泌乳期小鼠乳汁中检测出人G－CSF,表达量达15－32ng/mL(Table1)。具有一定应用前景。实验中发现：增加注射次数可以提供转染效率,但最佳注射次数仍需摸索。另外,如果换用复制型载体,整合与表达效率有可能大大提高。     

利用小鼠骨骼肌细胞持续表达单链胰岛素类似物进行1型糖尿病模型鼠的长效基因治疗

目的探讨Pluronic L64-电脉冲(L/E)体系介导的单链胰岛素类似物基因在骨骼肌组织的传递表达对1型糖尿病小鼠的治疗效果和影响。方法将胰岛素基因中的C肽区域换成(GGGGS)_3,克隆到pcDNA3.1(+)质粒中,构建载体pcDNA-INS。使用链脲佐菌素腹腔注射雄性BALB/c小鼠建立1型糖尿病小鼠模型,并分为L/E联合pcDNA3.1(+)空质粒治疗的L/E-pcDNA3.1(+)组、仅使用pcDNA-INS裸质粒治疗的pcDNA-INS组和L/E联合pcDNA-INS裸质粒治疗的L/E-pcDNA-INS组。模型小鼠在胫骨前肌注射相关质粒进行治疗,且根据治疗方案在注射1 h后进行Pluronic L64-电脉冲处理,并以生理盐水处理的正常小鼠(NC)组作为对照。记录各组小鼠的血糖、体质量、血清胰岛素含量、生存率、免疫组化、外形特征及组织病理等指标。结果 (1)pcDNA-INS质粒通过酶切和测序鉴定无误;(2)与NC组相比,模型小鼠血糖显著上升,体质量显著下降(P0.05),且胰岛遭到严重破坏;(3)L/E-pcDNA-INS组的血糖水平和血清胰岛素含量显著缓解,与NC组较为接近,pcDNA-INS组的血糖缓解和胰岛素补偿远不及L/E-pcDNA-INS组(P0.05),且与NC组之间的差异一直有统计学意义(P0.05)。第4周免疫组化结果显示,L/E-pcDNA-INS组的胰腺胰岛素表达较少,但肌肉胰岛素表达量较高,且该组生存率较高,与NC组均为100%(12/12),L/E-pcDNA-INS组的病理结果和外形特征与NC组小鼠最为接近,L/E-pcDNA3.1(+)组与pcDNA-INS组在不同部位均有不同程度的病变发生,且鼠毛疏少粗糙,体形较小。结论 Pluronic L64-电脉冲体系与单链胰岛素类似物基因联合治疗1型糖尿病的效果较好,且无明显不良影响,可为相关研究提供实验依据。     

ADA-LacZ融合基因直接注射导入小鼠皮肤组织后的表达

将ADA－LacZ融合基因经直接注射导入小鼠皮肤组织,用注射点处的皮肤组织制作冰冻切片,经组织化学方法显示：此融合基因可在皮肤成纤维细胞中表达一种具有腺苷脱氨酶（ADA）和β-半乳糖昔酶（β-gal）双重酶活性的融合蛋白,这种直接将融合基因导入体内进行表达的方式．为在基因治疗和基因疫苗研究中探索一条新的简便可行的外源基因在体内表达的途径,提供了有益的实验依据。     

猪骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因的cDNA克隆与表达分析

从人骨骼肌快肌肌钙蛋白C2（TNNC2）基因出发,在dbEST数据库中进行同源性搜索,找到一个有较高同源性且在猪背最长肌中表达EST（BM083186）。通过电子克隆和进一步RT-PCR实验验证,获得猪TNNC2基因全长cDNA序列,其全长843bp,开放阅读框为201～683bp,编码有160个氨基酸。同源性分析结果表明,与人、鼠的骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因cDNA编码区（CDS）同源性分别为93.6％、90.5％,蛋白序列同源性均为97.5%。多种组织的半定量RT-PCR研究表明,该基因在骨骼肌中表达,并且在杜洛克猪背最长肌中的表达比兰塘猪高。     

低温直接作用于骨骼肌细胞并增加IL-6的表达

在环境温度降低时,骨骼肌可通过寒颤和非寒颤产热维持体温。除了神经体液调节,有研究表明脂肪细胞可直接对低温产生反应而增加产热,提示机体对寒冷刺激存在自身调节。但骨骼肌是否存在不依赖于神经体液调节机制而直接对低温起反应的自身调节还未知。瞬时受体电位通道TRPM8和TRPA1是机体感受寒冷的关键蛋白。本研究通过RT-PCR发现,小鼠骨骼肌组织及离体培养的C2C12肌管细胞可表达TRPM8。将C2C12肌管细胞置于33°C低温环境培养6 h后,转录组学表明低温可改变骨骼肌细胞众多基因表达。通过KEGG-Pathway富集分析发现,低温刺激可改变IL-17、TNFα、MAPK、FoxO、Hedgehog、Hippo、Toll-like receptor、Notch、Wnt等重要信号通路。蛋白网络互作分析显示IL-6基因是骨骼肌细胞受低温直接影响的关键基因。进一步研究发现,33°C低温环境培养可增加C2C12肌管IL-6 mRNA及蛋白质表达。本研究结果表明,骨骼肌细胞对低温刺激存在自身调节,低温可直接上调骨骼肌细胞IL-6的表达。     

腺相关病毒介导的小鼠Ⅸ因子在血友病B小鼠体内表达研究

通过重组HSV/AAV辅助病毒方法制备出高滴度(>10¹²)的重组AAV/mFⅨ病毒颗粒, 并注射到血友病B小鼠的后肢骨骼肌中, 获得了稳定的高水平小鼠Ⅸ因子表达(>370 ng/mL), 持续时间超过350 d. 治疗组小鼠体内的Ⅸ因子活性达到正常值的30%, 而且出血症状得到显著改善. 在小鼠血浆中未发现抗Ⅸ因子的中和抗体, 第1次注射后抗AAV抗体的水平也非常低. 重复注射AAV/mFⅨ病毒后, 不同剂量组的小鼠体内的抗AAV抗体出现了不同的结果. 组织分析结果证实了血浆中有功能的FⅨ因子确实来源于骨骼肌. 以上结果显示, AAV介导的基因转移是血友病B基因治疗的极有前途的方法.     

腺相关病毒介导的小鼠IX因子在血友病B小鼠体内表达研究

通过重组HSV/AAV辅助病毒方法制备出高滴度(>10~(12))的重组AAV/mFⅨ病毒颗粒,并注射到血友病B小鼠的后肢骨骼肌中,获得了稳定的高水平小鼠Ⅸ因子表达(>370ng/mL),持续时间超过350d。治疗组小鼠体内的Ⅸ因子活性达到正常值的30％,而且出血症状得到显著改善。在小鼠血浆中未发现抗Ⅸ因子的中和抗体,第1次注射后抗AAV抗体的水平也非常低。重复注射AAV/mFⅨ病毒后,不同剂量组的小鼠体内的抗AAV抗体出现了不同的结果。组织分析结果证实了血浆中有功能的FⅨ因子确实来源于骨骼肌。以上结果显示,AAV介导的基因转移是血友病B基因治疗的极有前途的方法。     

AAV介导的hFⅨ基因在血友病B小鼠骨骼肌中特异性表达研究

采用重组腺相关病毒(rAAV)介导人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)微基因在Ⅸ因子基因剔除小鼠骨骼肌中有效表达.在构建的质粒中,rAAV两侧反转重复末端顺序中插入肌酸肌酶增强子(MCK)和β肌动蛋白启动子(βA)调控下的hFⅨ微基因(hFⅨm1).直接肌肉注射高滴度rAAV(2.5×1011/mL),血友病B小鼠血浆hFⅨ最高表达量256ng/mL,凝血活性明显改善.从hFⅨ表达时效曲线来看,hFⅨ水平在第15天达到高峰,随后因血循环中抗hFⅨ抗体的出现而渐次下降.该结果提示采用rAAV系统,体内直接途径开展血友病B基因治疗是值得进一步探索的方向.     

绿色荧光蛋白基因在转基因小鼠体内的表达

建立绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠,继而传代建系。采用显微注射法,将GFP基因注入FVB／NJ小鼠受精卵原核内,获得子代鼠。分娩后3周剪取仔鼠尾,提取基因组DNA,应用PCR、Southern印迹技术进行整合检测。结共用雌性小鼠200只,注射受精卵1586枚,移植卵数386枚,受体鼠32只,怀孕鼠4只,子代鼠18只,有4只为阳性：取2只首建鼠的胚胎,在荧光显微镜下观察GFP表达明显,表明初步获得了转绿色荧光蛋白基因小鼠,     

鸡骨骼肌发育过程生肌素的表达

ＭｙｏＤ家族生肌因子ＭｙｏＤ,生肌素（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）ｍｙｆ－５和ｍｙｆ－６／ｈｅｒｃｕｌｉｎ对脊椎动物肌细胞分化和骨骼肌系统的发育成熟具有重要意义,其中生肌素的作用尤为突出,是肌细胞终末分化的关键因素,采用Ｎｏｒｈｔｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹技术检测鸡胚骨骼肌发育过程中生肌素在转录水平的表达动力学,发现在胚胎发育第９ｄ已有鸡肢体骨骼肌生肌素ｍＲＮＡ表达,第１３ｄ达到高峰,第１５ｄ开始下降,第１     

诱导小鼠胚胎干细胞在体外分化为骨骼肌细胞的实验研究

小鼠胚胎干细胞是从胚泡未分化的内部细胞团中得到的干细胞,它在体外培养的环境中具有无限增殖、自我更新以及多向分化的特性。将小鼠胚胎干细胞在体外诱导分化为肌肉细胞,并且利用这些分化得来的肌肉细胞治疗肌肉退行性疾病,是干细胞研究领域的热点。该实验的目的在于筛选小鼠胚胎干细胞向骨骼肌细胞定向分化的实验条件,有效地将体外单层贴壁培养的小鼠胚胎干细胞诱导分化成骨骼肌细胞。最终发现,10-8mol/L维甲酸(retinoid acid,RA)+0.5%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)组诱导小鼠胚胎干细胞在体外分化成骨骼肌前体细胞的效率最高,分化得到的骨骼肌前体细胞经进一步纯化,能分化为多核的肌管。该实验为治疗肌肉退行性疾病提供了细胞来源,也为研究小鼠胚胎干细胞分化为骨骼肌细胞的机制提供了有利的条件。     

生物激素释放因子在动物骨骼肌的表达

生长激素释放因子是由动物和人的下丘脑合成并分泌的多肽,具有促进生长激素合成与分泌的作用,从而提高动物生长速度,向肌肉组织注射质粒DNA,外源基因可以较稳定表达一定的影响,将含生长激素释放因子基因的表达质粒注射动物肌肉组织,可能成为一种刺激动物生长的新方法。     

酪氨酸羟化酶基因载体－pCMVTH 质粒的构建及在大鼠骨骼肌内的表达

为用转基因方法治疗巴金森氏病大鼠模型,本研究采用分子克隆技术,将合成多巴胺的关键酶－酪氨酸羟化酶（ＴＨ）的基因,克隆进入以巨细胞病毒ＣＭＶ为启动子的载体质粒内,经限制性内切酶定位分析证实该重组的ＤＮＡ质粒的可靠性。携带ＴＨ基因的ＰＣＭＶＴＨ质粒以ＬＩＰＯ－ＦＥＣＴＩＮ介导,在培养的原代骨骼肌细胞中高效表达。本研究为进一步用转基因的细胞植入脑内以治疗巴金森氏病打下一定基础。     

AAV-ITR单链DNA微载体在小鼠骨骼肌中的表达

AAV-ITR单链DNA微载体是一种基于腺相关病毒(AAV)倒置末端重复序列(ITR)的基因表达载体(AAV-ITR ss DNA mini vector)。前期研究已证明AAV-ITR单链DNA微载体在HEK 293T细胞中具有较高的转染、表达效率。本文中将相同拷贝数的AAV-ITR单链DNA微载体、3?-ITR末端错配的AAV-ITR单链DNA微载体(AAV-ITRmm ss DNA mutant vector)、AAV-ITR双链DNA和质粒分别用Turbo Fect转入小鼠骨骼肌中,比较检测AAV-ITR单链DNA微载体与其他基因表达载体在小鼠体内1周、1个月及3个月的表达效率。组织切片经荧光显微镜观察及荧光灰度值分析表明,相同分子摩尔数的AAV-ITR单链DNA微载体比AAV-ITR双链DNA和质粒在不同时期表达效率都要高且更稳定。提取注射3个月后的肌肉组织的DNA,用荧光定量PCR分析比较各载体的存留分子数。RT-PCR的结果显示AAV-ITR单链DNA微载体在注射3个月后的存留分子数较其他载体高。综合结果显示AAV-ITR单链DNA微载体在动物体内具有表达效率高和长久稳定的优势,有可能开发为基因治疗的一种高效、稳定的新型载体。     

基因直接注射作疫苗预防传染病

美国加州Vical Inc和新泽西州的Merck & Co.两家公司协作开发对付传染病的疫苗,他们采用的可算是近几十年来防治疾病最具开创性的手段,即直接向病人注射编码疾病抗原的基因。     

运动对骨骼肌基因表达的表观遗传调控作用

DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA表达调控是表观遗传调控的3种重要方式,其在基因表达调控中发挥着关键作用。适当运动有益于身心健康。骨骼肌作为运动的主体组织,运动可以提高其代谢能力,改善其线粒体生物学功能,调控肌纤维类型转化,增加骨骼肌力量。近年来越来越多的研究表明,表观遗传调控在机体适应运动过程中发挥着重要作用,DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA表达调控等表观遗传调控方式通过调控骨骼肌基因表达来改变骨骼肌代谢能力、线粒体生物学功能和肌纤维类型,从而适应运动变化。本文对近年来运动对骨骼肌基因DNA甲基化、组蛋白修饰和相应miRNA表达调控等3种表观遗传调控方式的研究现状进行了综述,以期为进一步研究运动改善机体机能和健康提供参考。     

虾红素对小鼠肌肉组织和骨骼肌细胞中能量代谢相关基因mRNA表达的影响

本试验用高、低浓度虾红素日粮饲喂昆白系小鼠和处理原代培养小鼠骨骼肌细胞,提取总RNA,检测各时段UCP3、LXRα基因mRNA表达量,探讨虾红素对小鼠个体发育、肌肉能量代谢相关基因表达变化规律的影响。结果表明:高浓度组与对照组相比,小鼠体重增长明显减慢,肌肉组织第10天、30天以及骨骼肌细胞作用24h时UCP3mRNA表达量均显著下降(P<0.05),LXRα基因mRNA表达量均显著上升(P<0.05),72h达到极显著水平(P<0.01)。低浓度组与对照组相比,肌肉组织中UCP3、LXRα基因mRNA表达差异均不显著(P>0.05);虾红素作用骨骼肌细胞24hUCP3基因mRNA表达量显著下降(P<0.05),LXRα基因mRNA表达量显著上升(P<0.05)。结果提示虾红素对小鼠肌肉的能量利用有一定的调控作用。     

心肌直接注射转移基因

心肌直接注射转移基因钱虎声,陈诗书,张柏根（上海第二医科大学,上海２０００２５）关键词转移基因,直接注射肌肉内直接注射裸露ＤＮＡ质粒的基因转移技术为１９９０年美国威斯康星大学的Ｗｏｌｆｆ与圣地亚哥Ｖｉｃａｌ等偶然发现,为观察化学方法对大鼠骨胳肌基因转...