人白细胞介素-3基因在酿酒酵母中的分泌表达

利用PCR突变方法,改造了人白细胞介素-3(hIL-3)cDNA,在成熟蛋白编码顺序5＇端前突变入了XbaⅠ酶切位点和酵母类胰蛋白酶加工位点Lys-Arg的密码子。改造后的hIL-3cDNA插入大肠杆菌-酵母穿梭质粒pVT102u/α,使其准确融合于α-交配因子前导序列之后,并置于启动子ADH1调控之下。转化入酿酒酵母宿主菌S-78筛选后,30℃培养48h,上清能明显促进hIL-3依赖细胞TF-1生长。上清中分泌表达的hIL-3经ELISA鉴定并定量,其表达量大于1.0mg/L。³H-TdR掺入法测定上清中hIL-3活性为1.8×10³u/ml。     

重组hIL-10质粒构建及其在毕赤酵母SMD1168中的表达和纯化

构建重组hIL-10真核表达载体,探索在毕赤酵母中的表达,为进一步研究hIL-10生物学功能及临床应用奠定基础。PCR扩增目的基因hIL-10cDNA,经EcoRI/XbaI双酶切后,将其亚克隆至同样双酶切的载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-hIL-10;电转化法,将其转入毕赤酵母SMD1168,甲醇诱导Mut+型转化子基因表达;对目的蛋白进行检测及纯化。扩增出了目的基因hIL-10cDNA,重组质粒pPICZaA-hIL-10经酶切鉴定和序列测定正确;表达产物经SDS-PAGE分析在42.0kD处可见较浓染条带,Westernblotting分析可见特异条带;ELISA检测72h上清液中目的蛋白浓度可达1.973mg/L;纯化后目的蛋白纯度达67.0%。实现了重组hIL-10在毕赤酵母SMD1168中的成功表达和初步纯化。     

高温α-淀粉酶基因突变体在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达

对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)高温α-淀粉酶(amyE)基因进行改造获得的基因突变体(amyEM),通过PCR扩增,将此基因分别克隆至大肠杆菌表达载体pBV220和毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并分别转化大肠杆菌DH5α和毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组大肠杆菌和重组毕赤酵母。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE分析,证明突变α-淀粉酶(AmyEM)在大肠杆菌、毕赤酵母中获得有效表达。对重组大肠杆菌产生的α-淀粉酶的粗酶性质分析表明,此酶分子量约为55kDa。其最适反应温度为80℃~90℃,与野生型基因相比,其最适pH均为6.0,但不同的是突变体在pH 5.0~5.5时表现出较高的酶活力;在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外。由于酵母可对蛋白进行糖基化,酶分子量增加到60kDa,最适pH也改变为5.5。此高温α-淀粉酶突变体所具有的在微酸性环境具有较高酶活力的性质,具有重要的潜在工业应用价值。     

表达重组咖啡豆α-半乳糖苷酶的酵母工程菌的高密度发酵

用5 L发酵罐优化了重组咖啡豆α-半乳糖苷酶酵母工程菌pPIC9K-Gal/GS115(本室构建)的高密度发酵工艺.通过对发酵条件的优化,包括甘油补充量及补充时机、甲醇诱导量及诱导时机、溶氧控制、诱导时间等,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中得到了高效表达.利用所确定的最适条件进行发酵,菌体密度最终达到368 g/L以上,每批发酵液离心后可获得3.5 L的发酵上清,上清中的蛋白含量达到3 g/L以上,目的蛋白占上清总蛋白的50%以上,含量约为1.5 g/L,上清中α-半乳糖苷酶的活性维持在80 U/ml左右.确立工艺后又进行了3次发酵试验,证明了工艺的可行性和稳定性.为重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在B→O血型改造和酶解大豆低聚糖方面的应用奠定了基础.     

人α降钙素基因相关肽基因在酵母细胞中的分泌表达与产物的分离纯化

化学合成的人α降钙素基因相关肽(CCRP)基因用PCR法改造后使其能正确融合在酵母分泌型表达载体pVT102U/α中的α交配因子前导肽序列之后,然后进行克隆并转化酵母宿主菌S－78进行表达．培养物的上清用酶标(ELlSA)鉴定为阳性,而对照S－78、pVT102u／α为阴性,表达量用ELISA定量大于2mg／L。表达产物经阳离子交按层析(CM—Sphadex C₂₅)和HPLC纯化得到了HPLC纯产品。纯化后的CGRP能引起小鼠血压的降低,说明表达的目的蛋白既有CGRP的免疫结合活性,又有CGRP的生理活性。测定其N－端10个氨基酸序列,证明人工合成的CGRP基因在酵母细胞中已正确表达。     

人IL-6和TNF突变体重组融合蛋白表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达

本文利用PCR技术,对人肿瘤坏死因子α(hTNFα)基因进行了改造,并将其与人白细胞介素-6(hIL-6)成熟肽编码区cDNA进行融合,构建了5′IL-6-TNF△融合蛋白的表达质粒pBVIL6-TNFA△。DNA序列分析证明,PCR扩增片段核苷酸序列与引物设计序列及相应的cDNA序列完全一致;重组子用限制性内切酶酶切鉴定,含有正确的IL6-TNF△融合cDNA片段;表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量约为37kD,与预计的相符合;生物学活性分析初步表明,该融合蛋白具有抗肿瘤活性。     

具血型转换功能的咖啡α-半乳糖苷酶基因的克隆与表达

从大粒种咖啡(Coffea liberica)和中粒种咖啡(Coffea canephora)中分离克隆到了α-半乳糖苷酶（α-D-galactosidase）cDNA的开放阅读框架即编码区,分别记为Gal-D与Gal-Z,长度与已发表的小粒种咖啡cDNA编码序列相同均为1 089 bp,同源性与已发表的小粒种咖啡cDNA编码序列相比分别为98.7%和99.27%。 将克隆到的Gal-D与Gal-Z用巴斯德毕赤氏酵母Pichia pastoris表达载体pPICZαA（分泌甲醇诱导型）和pGAPZαA（分泌组成型）成功地构建了如下酵母表达载体：pPICZαA/Gal-Z,pPICZαA/Gal-D和pGAPZαA/Gal-D,并转入酵母宿主菌GS115进行了发酵表达研究。实验得出工程菌株pPICZαA/Gal-D / GS115的重组表达产物酶活最高可达48.22（U/mL）,对发酵产物进行了SDS-PAGE电泳,得到一条清晰的主条带。     

人激肽释放酶-1在甲醇酵母中高水平表达、纯化与鉴定

将自肾脏cDNA中获得的人激肽释放酶-1(Human kallikrein 1, hK1)基因插入到pPICZαA载体中, 构建甲醇酵母分泌型表达载体pPICZα-hK1, 该载体转化毕赤酵母(Pichia pastoris)宿主菌X33, 通过提高YPD平板和培养液中抗生素Zeocin的浓度(500~700 μg/mL), 筛选能高水平表达重组人激肽释放酶-1(Recombinant human kallikrein 1, rhK1)的P. pastoris工程菌株。在30 L发酵罐中发酵的表达条件为30oC、pH 6.0, 诱导64 h时, 发酵上清中rhK1产量达到6500 u/L(约1.25 g/L)。表达的rhK1有N-型糖基化程度不同的两种类型, 分别是分子量偏大的rhK1-H和分子量略小的rhK1-L。通过苯基疏水作用、Cu2+螯合以及阴离子交换层析纯化, 从每升发酵上清中可获得0.28 g的rhK1-H和0.62 g的rhK1-L, 纯化的总得率约为72%, 纯度不低于96%。到目前为止, 该研究获得的rhK1产量高于其他研究者的结果。     

人血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区cDNA在毕赤酵母中的表达和鉴定

将编码血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区1-3 loop 316个氨基酸残基的cDNA插入到含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris酵母载体中,构建了重组表达质粒pPIC9K/Flt-1(1-3),转化酵母宿主菌GS115,筛选His⁺Mut^s表型转化子,经摇瓶培养,1%甲醇诱导表达4 d后,SDS-PAGE结果显示,培养上清中Flt1(13)表达量达总蛋白的30%以上。ELISA及Western blot实验表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有结合VEGF的能力和抑制VEGF对HUVEC细胞的促增殖功能。     

肠三叶因子表达载体构建及在酵母菌GS115中的表达

目的:构建肠三叶因子(ITF)的真核表达载体,并在酵母菌GS115中表达,为进一步研究ITF的生理和药理功能奠定基础。方法:通过RT-PCR获得ITF cDNA片断,将目的基因插入pPICZαA酵母表达载体,得到重组载体pPICZαA-ITF。经BspHI线性化后氯化锂转化进入GS115,Zeocin筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因。阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析及Western blot检测表达蛋白。结果:经测序及PCR证实ITF cDNA准确插入酵母表达载体pPICZαA中。Tricille SDS-PAGE分析证明ITF的分子量约为14×10~3,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。结论:成功构建了真核表达载体pPICZαA-ITF,在酵母菌GS115中表达,获得重组ITF蛋白。     

人Mn-SOD cDNA的克隆及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

以人肝细胞株(L02)总RNA为模板,用RT-PCR扩增出人锰超氧化物歧化酶(hMn-SOD)cDNA,将其插入含有AOX1基因启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组质粒pPIC9k-MnSOD,转化毕赤酵母GS115,筛选出整合了多拷贝hMn-SOD基因的Mut^ 表型菌株,摇瓶培养,0．5％甲醇诱导表达。SDS-PAGE分析显示,诱导4d的培养上清中hMn-SOD的表达量约为上清总蛋白的32％,酶比活可达247、7u／mg。hMn-SOD在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌性表达。     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白主要抗原片段的高效表达

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZα-A,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性.在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT-PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据.     

两个蛇毒基因克隆及cDNA序列多态性再分析

α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin)是一种突触后神经毒素,广泛存在于眼镜蛇科蛇类的毒腺中,对于该基因cDNA多态性是否真实一直存有争议。本研究从银环蛇基因组DNA中克隆到α-银环蛇毒素基因序列,并对其中5个克隆进行测序和序列比对分析。作为参照,从同一次反转录得到的cDNA混合物中,克隆了蛇毒神经生长因子cDNA,并对其进行测序、比对和突变情况分析。综合各研究组报道的α-银环蛇毒素cDNA序列、α-银环蛇毒素基因序列和神经生长因子cDNA序列的突变情况,发现α-银环蛇毒素cDNA的多态性在基因组模板上不存在对应的变化,因此推测这种多态性不是从不同的转录本而来,同时考虑到不同研究小组报道的序列突变位点并没有出现相同的情况,因此其多样性也不是RNA编辑的结果。可见这种cDNA序列上的多样性很可能是由反转录过程以及基因克隆过程中人为引入的错误造成的。     

黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母基因组中的整合及其在整合子中的稳定表达

把黑曲霉糖化酶cDNA连同酵母α因子启动子及其分泌序列,通过转化整合到酿酒酵母染色体DNA上,获得了整合型的分解淀粉酵母转化子。Southern印迹分析证明了糖化酶cDNA对酵母染色体DNA的整入。整合型转化子在以可溶性淀粉为碳源的培养基中分泌糖化酶活力达2．5u／m1,在非选择性培养基中连续转移10次．糖化酶分泌活力稳定不变。     

人白细胞介素－2基因在人骨肉瘤细胞系内表达

从pHIG53质粒内切下人白细胞介素-2(IL-2)cDNA基因, 并经中间质粒pSP72转换成与pDOR-neo载体相匹配的酶切位点, 然后将IL-2cDNA定向连接入pDOR-neo载体, 构建成功人IL-2逆转录病毒载体, 经脂质体导入人骨肉瘤细胞系Ma中, 经G418筛选后测转基因肿瘤细胞培养上清中IL-2表达量, 每1×10⁵细胞24hIL-2表达量为50～800U, 为骨肉瘤的基因治疗创造条件.     

两个蛇毒基因克隆及cDNA序列多态性再分析

摘要：α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）是一种突触后神经毒素，广泛存在于眼镜蛇科蛇类的毒腺中，对于该基因cDNA多态性是否真实一直存有争议。本研究从银环蛇基因组DNA中克隆到α-银环蛇毒素基因序列，并对其中5个克隆进行测序和序列比对分析。作为参照，从同一次反转录得到的cDNA混合物中，克隆了蛇毒神经生长因子cDNA，并对其进行测序、比对和突变情况分析。综合各研究组报道的α-银环蛇毒素cDNA序列、α-银环蛇毒素基因序列和神经生长因子cDNA序列的突变情况，发现α-银环蛇毒素cDNA的多态性在基因组模板上不存在对应的变化，因此推测这种多态性不是从不同的转录本而来，同时考虑到不同研究小组报道的序列突变位点并没有出现相同的情况，因此其多样性也不是RNA编辑的结果。可见这种cDNA序列上的多样性很可能是由反转录过程以及基因克隆过程中人为引入的错误造成的。     

鸡α干扰素在毕赤酵母中的表达及糖基化对其表达的影响

目的:实现鸡α干扰素(ChIFNα)在毕赤酵母GS115中的表达,并考察糖基化对其表达的影响。方法:人工合成按照毕赤酵母偏好密码子优化的ChIFNα基因,克隆至分泌表达载体pPIC9,电转到毕赤酵母GS115中进行表达。利用定点突变对ChIFNα基因序列中4个糖基化位点进行缺失,SDS-PAGE分析N-糖基化对毕赤酵母表达ChIFNα的影响。结果:ChIFNα在GS115中获得了表达,在摇瓶发酵条件下,表达量为35.2 mg/L;构建了缺失1~4个糖基化位点的4个突变体,在GS115中实现了表达,分析表达结果显示,与未突变的ChIFNα对照相比,突变体的糖基化程度和表达量都有大幅度下降。结论:N-糖基化对于毕赤酵母表达ChIFNα具有重要影响,无糖基化的ChIFNα在毕赤酵母中表达量极低。     

α-1,6-甘露糖转移酶基因敲除的毕赤酵母菌株构建及其用于融合蛋白HSA/GM-CSF 表达的研究

酵母对蛋白的糖基化修饰过程不同于哺乳动物,其特点为产生高甘露糖型糖基且易发生过度糖基化。本研究通过两步基因重组敲除目标基因的方法成功敲除了毕赤酵母中的α-1,6-甘露糖转移酶(och1p)基因,获得了och1敲除的菌株。以此为基础,构建了高效表达人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白(HSA/GM-CSF)的工程酵母,与野生型毕赤酵母表达的过度糖基化HSA/GM-CSF不同,och1敲除菌表达的该融合蛋白糖基化程度明显降低,这为该融合蛋白的开发提供了重要基础。och1敲除菌株的构建不仅提供了一个对糖蛋白进行低糖基化修饰的毕赤酵母表达系统,而且为进一步的酵母糖基工程改造提供了基础。     

抑癌基因PTEN／MMAC1的cDNA克隆及其表达质粒的构建

为了获得了PTEN/MMAC1的cDNA并构建其酵母双杂交系统中的诱饵质粒和逆转录病毒表达质粒。利用RTPCR方法,从293细胞中扩增出一约12.kb的DNA片段,与pGEMT Easy连接,作全自动测序确证,重组入pLexA载体,构建成pLexA-PTEN/MMAC1,并用醋酸锂法转化酶母菌EGY48（p8op-LacZ）,在选择性培养基上观察pLexA-PTEN/MMAC1在EGY48(p8op-LacZ）中的表达情况;同时,PTEN/MMAC1的cDNA也重组入pLXSN构建pLXSN-PTEN/MMAC1。结果PCR获得1.2kb的DNA序列与献报道的PTEN/MMAC1的cDNA一致,转化的酵母菌在选择性培养上培养3d后,长出约1mm大小的白色菌落;pLXSN-PTEN/MMAC1可酶切出1.2kb的PTEN/MMAC1片段。结果表明获得了PTEN/MMAC1的cDNA,pLexA-PTEN/MMAC1可作为酵母双杂交系统中的诱饵质粒,而pLXSN-PTEN/MMAC1的构建为进一步研究其抑癌作用打下了基础。     

三重表达肺结核DNA疫苗在细胞水平的检测

目的 检测共表达siRNA、抗原基因与hIL-12的新型肺结核DNA疫苗在人胚肾293细胞中表达。方法 在已构建含有靶向抗调亡基因Mcl-1L的siRNA、结核分枝杆菌抗原基因Ag85B-ESAT6 (PVAE)、hIL-12的新型肺结核DNA疫苗pVAX-siRNA-PVAE-IL-12基础之上,将抗原基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合,得到真核表达重组质粒pVAX1-siRNA-PVAE-EGFP-hIL12。并将siRNA单元用靶向EGFP基因的siEGFP代替,得到pVAX1-siEGFP-PVAE-EGFP-hIL12重组表达载体。用重组质粒转染人胚肾细胞293,分别观察融合抗原基因与siEGFP的表达。以ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达。结果 经酶切鉴定和测序证实肺结核DNA疫苗改造成功。转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达。对照组检测到siEGFP的表达。转染48 h后检测出细胞上清中hIL-12的量为1571.63 pg/mL;72 h后检测出细胞上清中hIL-12的量为2392.25pg/mL。结论 已构建的肺结核质粒DNA疫苗能在真核细胞中有效表达siRNA、抗原基因与hIL-12。为进一步研究该DNA疫苗抗肺结核的免疫治疗和基因治疗效果打下基础。