促红细胞生成素在脑缺血动物模型治疗中的研究进展

促红细胞生成素是一种促进红系造血前体细胞增殖、分化的细胞因子,主要作用为促进红细胞增殖,应用于临床各种贫血治疗。随着研究进展,学者发现促红细胞生成素为一种多功能营养因子及神经保护因子,具有调节中枢神经系统发育、神经营养及神经保护作用。脑缺血性卒中实验研究显示,促红细胞生成素可有效改善中枢神经系统疾病所致的神经功能缺损,本文主要概述促红细胞生成素在脑缺血性卒中动物模型的研究进展,及其发挥神经保护作用所经由的分子机制。相信随着实验研究进展,其在脑缺血性卒中临床治疗方面将拥有更广阔的前景。     

PI3K/AKT通路在红细胞生成素肾保护中的作用

红细胞生成素作为临床上最常用的纠正贫血的药物,近年随着研究的不断深入,其非造血的组织器官保护作用逐渐被认识。PI3K/AKT通路作为介导红细胞生成素生物学作用的通路之一,在红细胞生成素对各种急慢性肾脏疾病的保护过程中占据重要地位。本文就PI3K/AKT通路在红细胞生成素肾保护中的作用方面的研究进展作一综述。     

红细胞生成素基因在大鼠体内的表达及表达产物的生物学效应

红细胞生成素（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ,ＥＰＯ）是一种由胎儿肝脏和成人肾脏产生的多肽类生长因子,在体内的表达具有严格的组织特异性,因此,慢性肾病所引起的贫血常常难以得到有效的治疗．随着基因治疗技术的不断成熟与完善,尤其是近年一些实验室先后发现质粒...     

重组人促红细胞生成素研究成果通过专家鉴定

重组人促红细胞生成素(EPO)是调节和维持红细胞生理循环的重要激素,对慢性肾性贫血有特效,并有可能在癌症、血液系统恶变、AIDS病等疾病所致的贫血治疗中开拓广泛的临床应用领域。目前国内使用的EPO制剂基本上全部从美国Amgen公司进口,为此每年要支付巨额外汇。我国促红细胞生成素的研究起步较晚,第二军医大学分子遗传学教研室在上海市科委的支持下,从1991年开始进行重组人促红细胞生成素高表达CHO细胞株     

人促红细胞生成素cDNA逆转录病毒载体的构建及在NIH3T3和CHO细胞中的表达

贫血是慢性肾衰病人常见的症状,其发生的主要原因之一是由于肾脏表达促红细胞生成素(EPO)的量减少。输入基因工程重组的人EPO可以有效地改善病人的症状。由于在体内只有完全糖基化的EPO才有生理活性,所以目前临床所用EPO均来自工程化的哺乳动物细胞,价格昂贵。随着基因治疗研究的进展,人们设想可以采用基因治疗的方法,在体内表达一些有治疗作用的蛋白质,有可能解决目前蛋白     

促红细胞生成素的抗炎症作用研究进展

促红细胞生成素是一种造血因子,临床中广泛应用于治疗各种原因造成的贫血。近年的研究发现,EPO具有多种非造血生物作用．其中对各组织以及全身炎症反应的保护作用已成为目前的研究热点之一。但目前EPO抗炎症作用相关的机制尚不明确。本文对EPO的抗炎症作用及其可能机制作一综述,并对EPO在临床中的应用前景进行了展望。     

人红细胞生成素基因在小鼠体内的转移与表达

将人的红细胞生成素(EPO)基因克隆在CMV启动子的下游,构建EPO表达质粒,在BHK₂₁细胞中表达成功后,将该质粒经脂质体包埋,再导入到小鼠的骨骼肌内,在体内亦获得了表达,一个月时小鼠血浆中人红细胞生成素的表达量高达1 340 ng/L,这为贫血病人的基因治疗提供了科学依据.     

促红细胞生成素在神经损伤中的作用

促红细胞生成素是控制红细胞生成的细胞因子,促红细胞生成素及受体在中枢和外周神经系统均有表达,发挥神经保护作用,有潜在的临床应用前景.本文对促红细胞生成素在外周神经损伤中的作用及机制作一综述,以求为外周神经损伤治疗提供新思路.     

重组人促红细胞生成素纯化的研究进展

促红素能促进人前体红细胞的增殖和分化,从而使人体内红细胞数量增加。临床上主要用于贫血、组织断离以及癌症患者透析后的恢复。促红细胞生成素自1971年在羊的尿液中被提取出后,近30年以来人们不断对其进行研究。促红素蛋白纯化工艺从Myake的七步法完善到现在的三步纯化法。本文综述了促红细胞生成素蛋白纯化的发展历史以及促红素未来的发展方向。     

重组促红细胞生成素(rHu-EPO)及其应用

19世纪,法国生理学家 Paul Verte 发现低氧可以刺激血红细胞生长。1950年美国 Reissman 证实了体内存在一种能刺激血红细胞的物质,称为红细胞生成素(EPO)。1985年,美国的 Fritsch 等成功地从成百上千的基因中发现了能产生 EPO 的一种,运用遗传工程,得以从动物细胞中产生对人类 EPO 负责的基因,从而使大量生产 rHuEPO 成为可能。EPO 是由肾脏分泌的一种重要激素,它具有促进骨髓中红细胞系列的增殖、分化、成熟和释放作用,以及维持血中细胞数和血红蛋白量的稳定状态慢性肾功能衰竭(CRF)的贫血与许多因素有关,这些因素包括:促红细胞生成素(EPO)生成减少、血中存在红细胞生成抑制因子(Inhibitors of Erythropoicsis,IE)、红细胞寿命缩     

两个不同启动子在COS7细胞中转录效率的比较

 两个不同启动子在ＣＯＳ７细胞中转录效率的比较陈坚刘小萍曹韫旭陆德如（第二军医大学医学生物技术和分子遗传研究所,上海２００４３３）ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＥｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＴｗｏＤｉｆｆｅｒｅｎｔＰｒｏｍｏｔｅｒ...     

白血病细胞系来源的P2X7受体的功能研究

P2X7受体是ATP门控的离子通道。从白血病细胞系J6-1细胞中扩增P2X7受体编码区全序列,克隆到pTARGET真核表达载体,经DNA序列分析后转染Ramos细胞,获得稳定表达细胞株;应用RT-PCR、Westernblot和流式细胞术检测P2X7受体在Ramos中的表达;荧光分光光度计检测P2X7受体介导的胞内钙离子浓度变化。结果显示,J6-1细胞来源的P2X7受体在第559位有一个A→G的有义突变,导致Asn187→Asp187,可在Ramos细胞中表达,在特异性激动剂BzATP作用下可引起胞内钙离子浓度的升高,但所需激动剂浓度高于常规浓度。     

t-PA cDNA在CHO细胞中的高效稳定表达

我们曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr),经过混合加压及筛选,在CHO细胞中高效表达了t-PA,表达水平达到5000～6000 IU/10~6细胞/24hr。重组t-PA具有与天然t-PA相同的分子量及酶活性。经过8个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的,其主要指标均符合工程细胞株的要求。     

DNA对电穿孔转染效率的影响

以外源红细胞生成素cDNA的表达产物为指标,研究了运载DNA和重组表达质粒的构象对电穿孔转染CHO细胞的效率的影响.结果250mg/L的运载DNA可使外源基因表达水平提高3倍;线性化质粒DNA比超螺旋DNA更适合于用电穿孔方法获得永久表达.这一结果提示,运载DNA的存在和质粒DNA的线性化对提高电穿孔转染CHO细胞的效率是必须的.     

痘苗病毒/T7RNA聚合酶辅助的原核基因在真核细胞中的表达

痘苗病毒/T7RNA聚合酶这一瞬时表达系统由于具有很多优于其他表达系统的特点而被广泛地应用于表达外源蛋白.TB-Chen株轮状病毒的VP6 DNA编码片段插入到原核质粒pETL的噬菌体T7启动子和终止子之间,获得重组表达质粒pET-VP6.构建好的重组表达质粒pET-VP6通过脂质体转染到真核细胞MA104中,用携带噬...     

柯萨奇B3病毒基因在重组痘苗病毒中的表达

将编码柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３）衣壳蛋白ＶＰ１和ＶＰ２的基因,分别克隆到具有７．５ｋ启动子的痘苗病毒表达载体ｐＧＪＰ５上;将ＣＶＢ３衣壳蛋白全基因克隆到具有Ｔ７启动子的痘苗表达载体ｐＴＭ１上,并筛先到相应的重组痘苗病毒ＶＶＰ１、ＶＶＰ２和ＶＶＰ／４／２／３／１。ＶＶＰ１和ＶＶＰ２稳定表达产物为ＣＶＢ３衣壳蛋白ＶＰ１和ＶＰ２,而ＶＶＰ４／２／３／１为一无分泌性的多聚蛋白,且这三种表达产物均属无分泌性     

利用盘基网柄菌表达可溶性人Fas配体

用PCR扩增从激活的人中性粒细胞中得到的编码可溶性Fas配体胞外区中第141个到第281个氨基酸的cDNA ,将其与hCG-β信号肽片段融合到质粒MB12neo中,随后导入到盘基网柄菌AX3细胞中,得到分泌性表达hFasL的重组菌AX3-H3。为提高shFasL的表达量,对质粒pMB12neo作了改造,得到衍生质粒pMB74。利用质粒pMB74克隆表达shFasL ,得到高通量表达shFasL的重组菌AX3_pLu8。在复杂培养基HL_5C中,重组菌的细胞密度可达(1.5～2 )×10⁷ mL ,AX3-H3及AX3_pLu8分泌的shFasL浓度分别为23.5 μg/L及206μg/L。利用合成培养基SIH培养重组菌AX3-H3及AX3-pLu8,细胞密度均达到(4～5)×10⁷m/L ,shFasL浓度则分别达到111μg/L和420μg/L。     

In vitro and in vivo transfection and expression of plasmid-based non-viral vector for erythropoietin gene therapy

A non-viral gene therapy vector, pcDNA3-EPO, was constructed by subcloning erythropoietin (EPO) cDNA into plasmid pcDNA3. After liposome-mediated transfection of the NIH 3T3 cells in vitro, EPO expression in the culture medium was detected by ELISA and amounted to 1.25 ± 0.3 IU ml^–1. The biological activity of this EPO in the medium was detected after intramuscular injection of BALB/c mice. PCR of genomic DNA and RT-PCR of total RNA also confirmed that the plasmid pcDNA3-EPO had been transfected into the cells. A pool of pcDNA3-EPO transfectants, which stably expressed EPO, was obtained by G418 selection. When pcDNA3-EPO was combined into liposomes and intramuscularly injected into BALB/c mice, the reticulocyte ratio in the positive mice was three times higher than that in the control mice. In vivo expression was maintained in mice for at least one month.     

Expression of recombinant cytoplasmic yeast pyruvate carboxylase for the improvement of the production of human erythropoietin by recombinant BHK-21 cells.

Recently, a recombinant yeast pyruvate carboxylase expressed in the cytoplasm of BHK-21 cells was shown to reconstitute the missing link between glycolysis and TCA, thus increasing the flux of glucose into the TCA and resulting in a higher intracellular ATP content. Now, these metabolically engineered cells have been additionally transfected with a plasmid bearing the gene for human erythropoietin. EPO yield and substrate-specific productivity of the recombinant BHK-21 cells have been compared to control cells without the PYC2-gene but transfected with the plasmid coding for the expression of the selection genes and EPO. PYC2-expressing clones showed a 2-fold higher glucose-specific productivity and a 2-fold higher product concentration in a continuously perfused bioreactor. Moreover, the PYC2 expression enabled the cells to become more resistant to low glucose concentrations in the culture medium. They could produce at nearly maximum productivity under glucose-limiting conditions of 0.05-1 gl(-1) that guaranteed a reduced accumulation of lactate in fed-batch production systems. Due to the fact that PYC2-expressing cells are characterized by reduced glucose consumption, a prolonged production phase in bioreactors can be maintained. Based on the demand not to fall short of 80% cell viability for the production, EPO could be produced for 2 days (30%) longer compared to the control due to a more economic exploitation of glucose, and the prolonged viability period of the cells using a batch cultivation driven by glutamine limitation.     

原核表达系统T7RNA聚合酶/启动子在真核细胞中表达目的基因的实验研究

将目前高表达水平强大的原核表达系统之一T7 RNA聚合酶/启动子表达系统通过一系列改进引入真核细胞.通过转染真核细胞实验表明,采用真核启动子CMV调控T7 RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入EMCV IRES序列两种解决方案能使该原核表达系统在真核细胞高效表达目的基因,且能适应不同的真核细胞环境,是一良好的细胞类型非依赖的表达体系.