大鼠肝和肝癌DNA酶切片段与标记RNA杂交图谱比较

Southern印迹杂交实验提示,大鼠肝15kbp EcoR Ⅰ片段与~(125)Ⅰ标记核RNA杂交带强度,大于肝癌DNA相应片段;当以5′-~(32)P标记核RNA和3′-~(32)P标记核RNA代替~(125)Ⅰ标记核RNA时,在肝癌相应DNA片段处几无可见的杂交带。大鼠肝2.4kbp EcoR Ⅰ片段与~(125)Ⅰ标记核RNA杂交带明显强于肝癌相应DNA片段。而大鼠肝癌2.0kbp EcoRⅠ片段与~(125)Ⅰ标记核RNA的杂交带明显强于大鼠肝相应DNA片段。大鼠肝2.2kbp和5kbpBamH Ⅰ片段与~(125)Ⅰ标记核RNA或5′-~(32)P标记核RNA或3′-~(32)P标记核RNA的杂交带,均明显高于肝癌相应DNA片段。~(125)Ⅰ标记大鼠肝癌核RNA与大鼠肝和肝癌2.2kbp或1.1kbpEcoR ⅠDNA片段的杂交带,弱于用~(125)Ⅰ标记大鼠肝核RNA为探针得之结果,当以5′-~(32)P标记核RNA代替~(125)Ⅰ标记核RNA为探针时,差异更明显。     

鼠肝色氨酸吡咯酶诱导生成机制的研究 Ⅲ.酶的诱导过程中~(32)P快速标记RNA的变化

本实验观察到在大鼠肝色氨酸吡咯酶的激素和底物诱导过程中都有~(32)P快速标记RNA的出现,它们在氢可地松诱导2小时和在色氨酸诱导3.5小时的比放射性较对照RNA者分别增加100%和60%左右。~(32)P长期标记高聚RNA的变化与快速标记RNA者显然不同,在激素诱导4～6小时和在底物诱导10小时的比放射性始有增高。激素和底物诱导后不同时间提取的~(32)P快速标记RNA的放射性动态变化与其相应RNA诱导TP活性的动态变化呈平行关系,而从~(32)P长期标记活性最高时提取的高聚RNA刺激TP的活力与正常鼠肝RNA刺激TP的活力无显著差别,激素和底物诱导过程中~(32)P快速标记RNA的生成为放线菌素K_2所抑制。去肾上腺大鼠底物诱导2小时和3.5小时也出现~(32)P快速标记RNA,其生成也为放线菌素K_2所抑制。自去肾上腺大鼠底物诱导3.5小时提取的RNA对TP的诱导活性高于相应的正常鼠肝RNA。以上结果说明,在TP的激素和底物诱导过程中所生成的具有体内诱导TP功能的高聚RNA,可能是一种“特异的mRNA”。     

荧光标记法测定核糖核酸片段的核苷酸序列

核糖核酸一级结构的研究,近十几年有了很大进展。继1965年Holley用紫外吸收法,首次测定了酵母丙氨酸tRNA的一级结构之后,Sanger等人用灵敏度更高的放射性同位素体内标记的方法,测定了其它小分子量核糖核酸的一级结构。近几年,Randerath等用高     

大麦条纹花叶病毒(新疆株)中多聚腺苷酰核糖核酸含量、侵染活性及多聚腺苷酸链长分布的测定

1.用Oligo(dT)纤维素亲和层析将新疆大麦条纹花叶病毒(BSMV-XJ)RNA分为poly(A)~+(与Oligo(dT)纤维素结合的)RNA和poly(A)~-(不与Oligo(dT)纤维素结合的)RNA,其相对含量poly(A)~+RNA占75%,poly(A)~-RNA为25%。2.用~(32)P标记法测定了BSMV(XJ)RNA中3′端poly A的链长分布,结果poly(A)~+RNA带有数个至三十几个腺苷酸残基,而poly(A)~-RNA也含十个以下的腺苷酸残基。3.用系统感病寄主大麦进行侵染性试验表明,poly(A)~+RNA与poly(A)~-RNA对大麦具有同等水平的侵染性。4.文中讨论了Oligo(dT)纤维素的分离效果以及所用测定poly(A)链长分布方法的可靠性。     

两种末端标记的寡聚核苷酸探针的比较研究

本文利用[α-³²P]-dATP 和 [γ-³²P]-ATP分别对寡聚核苷酸的3’-末端及5’-末端进行标记,研究这两种标记方法的技术途径,并结合斑点杂交,比较这两种末端标记的探针的灵敏度及特异性。结果表明:[α-³²P]-dATP虽可在寡聚核苷酸的3’-OH末端标上多个[³²P]-dAMP分子,但所得标记探针的杂交灵敏度及杂交体的稳定性均不及[γ-³²P]-ATP标记5’-末端制备的寡聚核苷酸探针。因此,当实验需要极高灵敏度的寡聚核苷酸探针时,以选择[γ-³²P]-ATP标记其5’-末端为宜。     

烟草花叶病毒的核糖核酸5′-端帽子结构在病毒颗粒中的位置与病毒的感染力

兔抗m~7GMP血清与烟草花叶病毒(TMV)制剂反应能产生免疫沉淀、并抑制TMV的感染力达90%以上。~(32)pCp在RNA连接酶作用下与TMV制剂反应,分离~(32)p标记的TMV再经过核糖核酸酶(RNaseT_2)水解,电泳分离得到~(32)pm~7G~(5′)ppp~(5′)Gp,这些结果说明TMV病毒颗粒中的RNA的5′-端帽子结构可能暴露在病毒颗粒的外部,因而容易与抗m~7GMP血清及~(32)pCp反应,同时也说明TMV的RNA5′-端帽子结构与TMV的感染力有密切关系。     

~(35)S-标记与DNA酶解片段核苷酸的顺序测定

末端终止法测定DNA分子内核苷酸排列顺序,常用~(32)P标记,Tris-H_3BO_3-EDTA(TBE)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。在实际工作中都希望从有限的胶板上得到尽可能多的数据。Biggin及Hung等应用~(35)S-αATP标记和缓冲液梯度胶分离,大大改善了凝胶的分离状况,扩大了区带的可读范围。在乙型肝炎病毒(HBV)DNA顺序测定中,我们将~(35)S-dATP标记法用于0.5与2.5×TBE缓冲液梯度-8％聚丙烯酰胺凝胶分离,得到了良好的分离效果,顺序可读长度增加一倍以上,因而使较大片段的顺序测定能在一次克隆的样品中完成。     

DNA5′端~(32)P标记方法

在DNA的结构与功能研究中,其5′端~(32)P标记是常用的有效技术。下面我们从《Methods in Enzymolgy》Vol 65中摘译了DNA 5′端脱磷及~(32)P标记方法,供大家参考。1.用磷酸单酯酶除去DNA链5′末端磷     

长叶车前花叶病毒(HRV_(sh))外壳蛋白赖氨酸残基的修饰

我们曾报道长叶车前花叶病毒上海分离株(简称HRVsh)的外壳蛋白有二个赖氨酸残基,在PH8.5无变性剂存在的条件下,完整病毒颗粒表面的赖氨酸残基可与三硝基苯磺酸(TNPS)起反应,反应后的TNP-HRVsh病毒颗粒的感染力丧失达90％以上。 本文又进行了甲基乙亚胺甲酯(MEI)对HRVsh赖氨酸残基的修饰反应,修饰后的MEI-HRVsh病毒颗粒的感染力也同样丧失90％以上。 从三硝基苯磺酸修饰的病毒颗粒(TNP-HRVsh)中分离得到的RNA能与天然的HRVsh的外壳蛋白重建病毒颗粒,并具有感染力,说明修饰过程中核酸并不受影响。 进一步用同位素~(35)S,~(32)P双标记病毒,再以TNPS修饰标记的病毒,得到(~(35)S,~(32)P)-HRVsh及TNP-(~(35)S,~(32)P)-HRVsh。将两者分别接种于系统寄主青菜(Brassica chinensis)的一片叶片,一天后在非接种叶片上都可测得~(35)S,~(32)P的放射计数。其中,(~(35)S,~(32)P)-HRVsh的~(35)S/~(32)P比值降低了,而TNP-(~(35)S,~(32)P)-HRVsh的~(35)S/~(32)P比值保持不变。说明HRVsh外壳蛋白赖氨酸残基的修饰并不影响病毒颗粒进入寄主细胞,以及在寄主细胞间的转移。同位素双标记的结果表明,其感染力丧失的原因可能是由于上述修饰作用阻止了病毒在感染中所必须的脱壳过程。     

DNA5′端~(32)P标记方法

在DNA的结构与功能研究中,其5′端~(32)P标记是常用的有效技术。下面我们从《Methods in Enzymolgy》Vol 65中摘译了DNA 5′端脱磷及~(32)P标记方法,供大家参考。 1.用磷酸单酯酶除去DNA链5′末端磷     

5′-和3′-末端带双羟基的寡聚核糖核苷酸具有不寻常的聚丙烯酰胺凝胶电泳行为

为了制备核糖核酸酶P的底物——人工合成的tRNA前体,我们用五核苷四磷酸_(HO)U_PC_PC_PA~*_PC_(OH)(~*P代表~(32)P)与天然的酵母丙氨酸tRNA或其5′半分子在T_4RNA连接酶催化下反应,连接产率甚低。但观察到一个很奇特的现象:不管何种反应条件,甚至不加tRNA和不加酶的对照实验中,经聚丙烯酰胺凝胶(PAG)电泳分析反应产物时发现,在约相当于RNA序列分析“梯子”18核苷酸(nt)处总     

蒸腾强度对根-土界面磷浓度的影响及其与吸收的关系

玉米在温室中水培至三叶期,以薄层标记、贴根法转移至~(32)P标记土上培育,并在不同蒸腾强度下进行生长。根据Sinha等的方法测定根AFS的~(32)p量。结果表明,蒸腾强度和介质磷浓度对玉米根内总磷浓度有明显影响,其中根AFS~(32)P强度变化尤为突出。光密度计扫描自显影图像的结果说明,由于蒸腾强度不同影响~(32)P吸收,显示出玉米根际微区磷素分布的差异。     

辣根过氧化物酶标记DNA探针及光增强检测DNA指纹图在法医应用的研究

本文介绍了用辣根过氧化物酶直接标记DNA探针,光增强检测DNA指纹图的技术,所得图谱清晰易读,分辨率高,灵敏度为0.8μg,接近~(32)P同位素标记的水平。就150名无关个体的DNA指纹图分析表明两个个体图谱完全相同的机率是3.7×10~(-14);方法稳定性测定表明,足以取代同位素标记,用作准确的个人识别和亲子鉴定,为侦破强奸、凶杀等案件提供重要科学依据,该法简便,快速,适用于各实验室,易于推广应用。     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究——Ⅳ.寡核糖核苷酸3′-端的显色标记微量测定法

本文报告用甲基橙为原料合成了甲基橙的两种衍生物:4-二甲氨基偶氮苯-4'-磺酰-甘氨酰肼(DABS-Gly-NHNH_2,Ⅰ)和4-二甲氨基偶氮苯-4'-磺酰肼(DABS-NHNH_2,Ⅱ),并用(Ⅰ)成功地标记了高碘酸氧化的核苷二醛。标记产物在聚酰胺薄板上分离得很好,其灵敏度达到10~(-9)～10~(-10)克分子,比紫外吸收法灵敏数十倍。我们用试剂(Ⅰ)标记测定了四种不同的寡核糖核苷酸的3'-端,用量为0.08～0.12A_(260)。     

异羟基洋地黄毒甙元(Digoxigenin)标记的RNA探针在丁型肝炎病毒核酸杂交中的应用

应用异羟基洋地黄毒甙元(Digoxigenin)标记的RNA探针,检测了人和黑猩猩血清及肝脏中丁型肝炎病毒核酸,并与~(32)P标记同一探针做了比较。结果表明,异羟基洋地黄毒甙元标记的RNA探针的杂交效果与同位索探针一致(同源cDNA0.2pg),可用于人和动物血清及肝脏标本内HDV核酸的检测。     

疑难问题解答一例

问:在噬菌体侵染细菌的实验中,怎样知道进入细菌细胞的是噬菌体的DNA而不是蛋白质呢?答:噬菌体是有蛋白质的外壳包裹着DNA的简单结构.它侵染细菌时,进入细胞的是DNA还是蛋白质呢?美国科学家赫尔希(Hersher)和蔡斯(Chase)在1952年做了如下的实验回答了这个问题.他首先将噬菌体培养在含有用~(32)P同位素标记的磷酸盐培养基上,结果DNA被~(32)P标记.而蛋白质一般只是由C、H、O、N、S元素组成,而不含P,故蛋白质不会被标记.他又将噬菌体放在含有~(35)S同位素标记的硫酸盐培养基里培养,结果噬菌体的蛋白质被~(35)S标记上.而DNA没有被标记.     

地高辛素标记的探针快速检测HBV-DNA实验研究

应用核酸分子杂交技术,检测血清中HBV-DNA已成为诊断乙型肝炎病毒感染和判断其复制状态的重要手段。用同位素(~(32)P)标记核酸探针,进行分子杂交,虽然灵敏度高,但是由于具有半衰期短、探针不稳定、价格昂贵、对人体有害等因素,使之推广应用受到限制。目前国内外已有地高辛素(Dig)标记HBV-DNA探针进行斑点杂交实验,敏感性接近同位素探针水平。我们参照BM公司试剂盒方法及有关文献,建立Dig标记HBV基因探针方法,采用随     

多核苷酸合成的研究 Ⅷ.用T_4RNA联结酶酶促合成GpCpm~1ⅠpφpGpGp

本文报导了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子反密码区中GpCpm~1IpψpGpGp的酶促合成。作者发现,当以~(32)pGpGp(2′,3′)为供体,GpCpm~1Ipψ为受体,用T_4RNA联结酶在一般条件下联结时(37℃,2小时),产率只有10%左右;但在10℃条件下,供体与受体比为1:5时,可以得到50～60%的较高产率。将~(32)pGpGp(2′,3′)与GpCpm~1Ipψ用T_4RNA联结酶在pH8.3,10℃下反应48小时后,再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析分离纯化,即可得到GpCpm~1Ipψ~(32)pGpGp(2′,3′)。产物经双向电泳层析图谱分析,抗单酯酶测定,毗邻分析,用牛胰核糖核酸酶水解然后5′端用~(32)p标记,再经双向图谱和核苷酸组成比例等鉴定,证明产物的纯度和排列顺序符合预定要求。     

多核苷酸合成的研究 Ⅷ.用T_4RNA联结酶酶促合成 GpCpmIpΨpGpGp

本文报导了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子反密码区中GpCpm~1IppGpGp的酶促合成。作者发现,当以~(32)pGpGp(2′,3′)为供体,GpCpm~1Ip为受体,用T_4RNA 联结酶在一般条件下联结时(37℃,2小时),产率只有10%左右;但在10℃条件下,供体与受体比为1:5时,可以得到50～60%的较高产率。将~(32)pGpGp(2′,3′)与GpCpm~1lp用T_4RNA 联结酶在pH8.3,10℃下反应48小时后,再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析分离纯化,即可得到GpCpm~1Ip~(32)pGpGp(2′,3′)。产物经双向电泳层析图谱分析,抗单酯酶测定,毗邻分析,用牛胰核糖核酸酶水解然后5′端用~(32)p 标记,再经双向图谱和核苷酸组成比例等鉴定,证明产物的纯度和排列顺序符合预定要求。     

~(125)Ⅰ标记HBV-DNA探检测血清乙型肝炎毒DNA

<正> 近年已能对乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)进行测定。作者用~(125)Ⅰ标记的HBV-DNA探针,检测HBV的DNA聚合酶,并同32P标记法所测结果进行比较,探讨~(125)Ⅰ标记法的准确性,现报告如下: 对象和方法:HBV健康携带者8例,慢性肝炎89例,肝硬变11例,肝癌2例共计110例作为受检对象。所有患者HBsAg均阳性,HBeAg阳性83例,抗HBe抗体阳性17例。 HBy-DNA测定步骤是首先使DNA2条链中的1条变性,然后加入~(125)Ⅰ标记HBV-DNA,使其和血清中的1条DNA链杂交。反应液进行柱层析后,将洗出液用r-计数器检测并定量。 结果:HBV-DNA量和HBV-DNA