酵母菌基因工程载体——pCN系杂种质粒的构建及其特性的研究

pCN系质粒是利用DNA重组技术,以YRp7和pAT153为原始质粒所构建的酵母菌基因工程载体。pCN系质粒由酵母菌TRPL基因的1．4 kb DNA片段和完整的pAT 153分子组成。根据pAT153质粒中所插入的TRPl DNA片段的方向性,pCN质粒有两种不同的构型。在性质上,pCN系质粒保留了 YRp7高转化能力和pAT153高拷贝水平,同时它在酵母受体中的稳定性比’YPp7明显提高。pCN质粒中尤以pCN60可作为酵母基因工程的载体。     

芽孢杆菌高表达质粒的构建及其性质的研究

以B.subtilis质粒pUB110为基础构建了双标记(Km²、cm²),多酶切点接头的表达质粒pNQl22和pNQll3系列。pNQl22的分子量为3．2×10⁶道尔顿,其对cm抗性水平和cat-86基因表达水平与质粒pPL600相同,pNQll3系列质粒分子量为3．1—4．1×10。道尔顿。其对cm抗性水平高于质粒pPL600,它们所携带的cat-86基因的表达水平无论在非诱导和诱导条件下部比pPL600高约5倍。无分解代谢阻遏现象,传代稳定,因而可以用作Bacillus属基因工程的载体。     

双功能质粒pCB33的构建及性质研究

枯草杆菌具有安全性好、产胞外蛋白、产品 中不含内毒素等优点。,14,201,是基因克隆的理想 受体,但也存在某些外源基因不能表达、用鸟枪 法克隆外源基因比较困难等缺点［113,16,181。若能 构建可在大肠杆菌和枯草杆菌中复制和表达的 双功能质粒作为载体,以大肠杆菌为中间寄主, 利用其转化率高,克隆技术比较成熟的优点,先 将DNA片段克隆至大肠杆菌,经过鉴定后再 转至枯草杆菌中表达,则可克服枯草杆菌克隆 系统的以上缺点,有实际应用价值。目前,国外 已利用金黄色葡萄球菌质粒与大肠杆菌质粒重 组构建了一些双功能质粒115,1si,并已通过大肠 杆菌为中间宿主的方法将乙型肝炎病毒核心抗 原、口蹄疫病毒主要抗原117,及人干扰素。0i等基 因转人枯草杆菌中表达。本文描迷了作者之一 等分离的短小芽抱杆菌抗四环素质粒PC J 3121 和大肠杆菌质粒pBR 322分别用Bam HI和 Ava I双酶切,除去部分DNA片段后重组构 建双功能质粒pCB33的实验,并对其性质进行 了研究。     

质粒pAAV-HRE-CD151的构建和鉴定

目的为了增加CD151基因转染大鼠缺血心肌的效率和靶向特异性。方法以质粒pAAV-CD151为模板,采用克隆技术,构建一个含缺氧反应元件(hypoxia response element,HRE)和CD151基因序列的腺相关病毒载体,通过HRE促进CD151在大鼠缺血心肌的表达。结果经过测序鉴定成功构建了含缺氧反应元件的质粒pAAV-HRE-CD151。结论成功构建了pAAV-HRE-CD151质粒,为CD151治疗缺血性心血管病的靶向研究奠定了基础。     

三结构域重组FN多肽表达质粒的构建及其表达产物性质的初步鉴定

为探讨三结构域重组迁连蛋白（ＦＮ）在肿瘤治疗中的作用,构建了两个三结构域重组ＦＮ表达质粒ｐＦ９４－６２和ｐＦ９４－８２,它们分别编码两个重组多肽：ＣＨ６２（ＦＮＰｒｏ１２３９－Ｓｅｒ１５１５经Ｍｅｔ、Ａｌａ １６９０－Ｖａｌ２０４９相连）和ＣＨ８２（从ＣＨ６２中删除了ＨｅｒｐⅡＣ端和ＣｅｌｌⅡ结构域Ｎ端的Ｐｒｏ１９５３－Ｇｌｕ１９７８）。含表达质粒ｐＦ９４－８２的工程菌经３７℃培养,ＣＨ８２得到表     

体外重组质粒pIB2及其性质的初步研究

本文报导了将大肠杆菌抗四环素质粒pSC101及抗卡那霉素、大肠杆菌素E1质粒pCR1,在体外经限制酶ECoR1 和T4DNA 连接酶作用,进行重组,经转化后,筛选得到了重组质粒pIB2。pIB2兼有抗四环素、卡那霉素和对大肠杆菌素E1免疫的特性。对pIB2 DNA 进行电泳和电镜观察,计算分子量证明pIB2 确为pSC101与pCR1的重组。测得pIB2的转化频率为4.0×10~(-6),每微克DNA 转化体数为4.2×10~4。pIB2对四环素和卡那霉素的抗药水平分别为每毫升25～30微克和200微克,并与pSC101和pCR1作了比较。限制酶Bam H1在原pSC101上具有一个切点而在pCR1上无切点,因而预计pIB2与Bam H1配合使用,可作遗传工程研究中双耐药标记的分子运载工具。     

体外重组质粒pIB2及其性质的初步研究

本文报导了将大肠杆菌抗四环素质粒pSC101及抗卡那霉素、大肠杆菌素E1质粒pCR1,在体外经限制酶ECoR1和T4DNA连接酶作用,进行重组,经转化后,筛选得到了重组质粒pIB2。pIB2兼有抗四环素、卡那霉素和对大肠杆菌素E1免疫的特性。对pIB2 DNA进行电泳和电镜观察,计算分子量证明pIB2确为pSC101与pCR1的重组。测得pIB2的转化频率为4.0×10~(-6),每微克DNA转化体数为4.2×10~4。pIB2对四环素和卡那霉素的抗药水平分别为每毫升25～30微克和200微克,并与pSC101和pCR1作了比较。限制酶Bam H1在原pSC101上具有一个切点而在pCR1上无切点,因而预计pIB2与Bam H1配合使用,可作遗传工程研究中双耐药标记的分子运载工具。     

枯草芽孢杆菌中的分子克隆和单体杂种质粒转化的研究

枯草芽孢杆菌感受态细胞的质粒转化与质粒的分子构型有关。用琼脂糖凝胶电泳法分离纯化的pUB110质粒DNA单体是很少或没有转化活性的。在pUB110质粒DNA上插入一段受体菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体可以转化感受态细胞,但受体菌必须是重组型的。转化效率和插入片段的大小有关,片段愈大转化活性愈高,片段小于0.6kb,就和pUB110DNA单体一样,几乎没有转化活性。在pUB110质粒DNA上插入一段解淀粉芽孢杆菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体转化效率都很低。本文还讨论了用鸟枪法在枯草芽孢杆菌中进行分子克隆的一些问题。     

枯草杆菌和大肠杆菌融合转移双复制功能杂种质粒pTZ22的研究

在大肠杆菌C600(pTZ22)(Km~rTc~rAp~r)和枯草杆菌Ki-2-132(Sm~rIle~-Thr~-Val~-)(简称A系统)以及在枯草杆菌Ki-2-132(pTZ22)(Km~r)和大肠杆菌C600(简称B系统)菌株之间,通过细胞融合,从两个方向转移pTZ22。A系统获得一批抗Km Sm融合子,B系统获得一批抗Km Ap和Tc的融合子,融合频率为10~(-4)—10~(-6)。融合子的抗性是稳定的,并且革兰氏染色、产酶和产孢匦与不带质粒的亲本相同。DNA的电泳图证明,除了不带质粒的亲本无质粒带外,其它菌株都有质粒带,A系的电泳相同,B系的则不同,原因尚不清楚。用融合子的质粒DNA转化ki-2-132和C600都获得了转化体,其转化频率因实验条件不同而有差异。以上结果表明,大肠杜菌和枯草杄菌细胞之间能够相互融合,通过融合能从A、B两个方向转移质粒pTZ22,枯草杆菌的蛋白酶不阻碍细胞融合和质粒转移。     

质粒pMM15的构建

以pLJ3和pKO-6质粒DNA为材料,经体外重组构建了质粒pMM15。该质粒带有一个lac UV5启动子片段和一个半乳糖激酶基因。二者之间有单一的EcoRI位点。此外,还有一个Amp~1药物抗性标记。分子量约为3.8kb。该质粒在受体细胞内能够产生有活性的半乳糖激酶。在EcoRI位点插入外源DNA后,则半乳糖激酶基因表达受阻。因而在用于研究外源基因的表达及无性繁殖试验中,可通过遗传互补试验,在麦康凯半乳糖指示剂平板上,根据菌落颜色的改变来检出重组转化子。     

链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体的构建

本文报道了链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体pSE-3的构建;把具有双启动子的大肠杆菌的质粒pGEM-3与新霉素抗性基因启动子缺失的链霉菌的探针质粒pIJ486分别用BamHI和BglⅡ酶切,T4 DNA连接酶连接后转化到E.coli HB101(Amp(?),Neo(?)),所得重组质粒能强启动pIJ486质粒上的氨基糖苷磷酸转移酶基因(aph),并使新霉素抗性基因在大肠杆菌中得到强表达。此重组质粒被命名为pSE-3,当其转化到变青链霉菌TK54(Tsr(?),Neo(?))的原生质体前,新霉素抗性基因亦能得到强表达。酶切结果表明,构建的具有两个启动子的穿梭质粒载体pSE-3上有HindⅢ和EcoRI的单酶位点,拷贝数约为39。经再转化和传代50代等研究表明,穿梭质粒载体pSE-3在链霉菌和大肠杆菌中均是稳定的。为某些有应用价值的目的基因在大肠杆菌和链霉菌中的克隆与表达提供了一个有价值的穿梭质粒载体。     

双歧杆菌质粒聚合酶基因表达系统的构建及其鉴定

目的构建可以在双歧杆菌表达外源性基因的系统。方法PCR扩增双歧杆菌质粒聚合酶基因（BPP）并连接至质粒pBS—T以形成重组质粒pBS—BPP。PCR扩增双歧杆菌内源性阿拉伯糖苷酶的启动子及分泌性信号肽DNA序列（ara）并连接至质粒pBAD—A以形成重组质粒pBAD—ara,然后将增强绿色荧光蛋白（eGFP）基因连接至质粒pBAD—ara以形成重组质粒pBAD—ara—GFP。采用基因重组技术重组含有ara、BPP、eGFP基因序列并可将外源性基因分泌表达于菌体外及锚定表达于细胞壁的质粒pBS—BPP—ara—GFP,激光共聚焦显微镜下观察含有pBS—BPP—ara—GFP质粒及对照质粒的E．coli,验证eGFP定位表达情况。结果所构建的表达系统可以在E．coli中表达eGFP基因。结论通过基因重组方法成功构建了双歧杆菌表达系统,其可将外源基因分泌表达于菌体外。     

gAd重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

为了建立人脂联素球状结构域(gAd)原核高效表达体系,分离纯化gAd并检测其生物活性,从淋巴细胞中提取人基因组DNA,PCR扩增出含有脂联素编码序列的片段,通过T-A克隆的方法克隆入pMD18-T载体中,然后设计适当的引物引入起始密码、终止密码以及相应的酶切位点,把脂联素球状结构域(gAd)基因亚克隆到表达载体pBV220,将序列鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中,用42℃温控诱导目的蛋白的表达;超声破菌,分离纯化包涵体,8mol/L尿素溶解,采用梯度稀释法复性重组蛋白,动物实验测定其活性。结果在大肠杆菌中成功实现了gAd稳定的以包涵体形式的高效表达,表达量约占全菌蛋白的20%,经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定分离得到的包涵体具有较高纯度,复性后具有降低家兔血糖和游离脂肪酸的作用。为进一步研究gAd的生物学活性、作用机制奠定了基础。     

人肝细胞生长因子基因表达质粒的构建及其活性研究

目的 :构建一种携带人肝细胞生长因子 (HGF)基因的表达质粒 (pUDKH) ,并对其体外活性进行研究 ,为其体内应用提供依据。方法 :从人胎盘cDNA文库用PCR方法克隆人HGF基因 ,并将其克隆至自行构建的真核表达载体 pUDK上 ,获得表达质粒 pUDKH。将pUDKH体外转染原代培养的骨骼肌细胞 ,分析其转染效率及表达上清中HGF、血管内皮生长因子 (VEGF)的表达水平 ,并采用MTT法分析不同剂量HGF表达产物对人脐静脉内皮细胞的作用。结果 :所克隆构建的携带人HGF基因的质粒 pUDKH可有效转染原代培养的骨骼肌细胞 (0 .0 5 7% ) ,并表达HGF(16～ 18ng/ 4× 10 5cells)和VEGF ,其表达产物对人脐静脉内皮细胞具有明显的增殖刺激活性 (P <0 .0 5 ) ,而且有剂量效应关系。结论 :初步证实本研究构建的质粒 pUDKH具有体内治疗缺血性疾病的应用潜力     

用于植物基因表达载体构建的质粒改造及其应用

为克服目前常用于植物基因表达载体构建的质粒所具有的酶切位点有限,目的基因片段难于插入和连接,缺少植物基因表达所必须的启动子、终止子、筛选标记等功能元件的缺点,本研究构建了一个用于植物基因表达载体构建的质粒载体pNULPGE200。该质粒载体引入了植物基因表达最常用的CaMV 35S启动子(cauliflower mosaic virus 35S promoter)和NOS终止子(nopaline synthase terminator),以及之间的多克隆酶切位点MCS(multiple cloning site)。利用pNULPGE200构建植物基因表达载体,经PCR等方法克隆得到的目的基因可以直接连接到35S启动子与NOS终止子之间,使目的基因能够在植物体内稳定表达;同时该质粒载体还具有独立表达的卡那霉素NPT Ⅱ(neomycin phosphotransferase Ⅱ)耐性基因和sGFP(synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation)绿色荧光蛋白报告基因,可用于基因转化时的筛选。本研究以假单胞菌(Pseudomonas putida)携带质粒的二甲苯单加氧酶(xylene monooxygenase)编码基因为材料,分别利用本文质粒载体和常规的质粒载体pBI121构建了植物表达载体,验证了文中质粒载体的实用性。     

猪生长激素基因表达质粒的构建及其转基因动物研究

将猪生长激素基因（ＰＧＨ）克隆到质粒ｐＵＣ１９上,经酶切分析,确定其酶切图谱。把ＰＧＨ转录起始位点以前的序列切掉,换上羊ＭＴ－１ａ基因的启动子,构建成可以调控的表达载体ｐＳＭＴＰＧＨ,用于转基因动物的研究。采用微注射法将线状ｐＳＭＴＰＧＨ导入猪、鼠和金鱼的受精卵中,得到了相应的转基因动物。对这些动物鉴定分析表明,外源基因整合率因动物不同而异,但该基因在这３种动物中的整合率均在９％以上,其生长速度都     

猪生长激素基因表达质粒的构建及其转基因动物研究

将猪生长激素基因（ＰＧＨ）克隆到质粒ｐＵＣ１９上,经酶切分析,确定其酶切图谱．把ＰＧＨ转录起始位点以前的序列切掉,换上羊ＭＴ－１ａ基因的启动子,构建成可以调控的表达载体ｐＳＭＴＰＧＨ,用于转基因动物的研究．采用微注射法将线状ｐＳＭＴＰＧＨ导入猪、鼠和金鱼的受精卵中,得到了相应的转基因动物．对这些动物鉴定分析表明,外源基因整合率因动物不同而异,但该基因在这３种动物中的整合率均在９％以上,其生长速度都高于对照组．     

谷氨酸棒杆菌质粒pXZ10145自发缺失突变体的特性及其重组质粒的构建

用谷氨酸棒杆菌质粒pxz10145转化钝齿棒杆菌T 6—13原生质体,得到自发缺失突变体pNAT65,该质粒为2．4kb,仍带有氯霉素抗性,经物理图谱分析表明,质粒pxz10145smaⅠ到claⅠ位点之间的片段已缺失,仍保留EcoRⅠ、XbaⅠ、BclⅠ三个酶的单切点。质粒pNAT65与pBR322用EcoRⅠ酶切连接得到重组质粒pNAR67,这一质粒在E．Coli中复制并表现Ap, Tc抗性,但氯霉素抗性能力大大降低,只能抗2μg／ml。