马铃薯抗晚疫病转基因的研究进展

晚疫病是影响马铃薯最严重的一种真菌性病害,农业技术的综合应用、化学药剂的使用对晚疫病的防治存在种种弊端。因此,寻找新的抗病基因型,获得抗晚疫病的转基因新品种一直是马铃薯抗晚疫病的主要任务。本文简要介绍了马铃薯晚疫病的危害及防治,着重对从Osmotin蛋白诱导抗性、病原诱导葡萄糖氧化酶(GO)基因表达生成H2O2获得抗性、Harpin蛋白基因表达诱导抗性途径对马铃薯抗晚疫病转基因研究进展进行了综述,同时对转基因植物的生物安全性作了评价。     

表达Osmotin蛋白的转基因马铃薯对晚疫病的抗性分析

将缺失C端信号肽序列的Osmotin基因和在第96位氨基酸处发生琥珀突变的Osmotin基因置于CaMV双35S启动子驱动下，转化马铃薯，获得NPTII抗性植株。经对20株NPTII抗性植株的Southern检测和对55株NPTII抗性植株的Nouthern分析，证实了Osmotin基因的插入和转录。对21株转Osmotin基因和17株转琥珀突变Osmotin基因植株的抗病性测定，分别筛选出8株和10株抗病性与非转基因植株有显著差异(α=0.05)的转基因植株。对8株转Osmotin基因植株的Dot blotELISA和Western杂交分析，证明Osmotin蛋白胞外分泌能够赋予转基因植株叶片抗晚疫病的能力，研究结果暗示Osmotin蛋白具有抑菌活性的部位可能位于其N-端。     

马铃薯晚疫病防治的转基因策略

晚疫病是由致病疫霉菌(Phytophthora infestans)引起的病害,是限制马铃薯产业发展最严重的病害之一。采用传统育种和化学农药等方法防治马铃薯晚疫病虽然早有研究,但至今收效甚微。基因工程技术的兴起为防治马铃薯晚疫病提供了新的契机,并已取得了一定成效。但单基因抗性容易丧失、水平抗性应用难度大,要提高抗病基因的持久性,同时释放多个抗病基因,人为提高田间抗病基因的多态性是目前可选途径之一。对各种防治方法进行了综述,通过转基因技术创建抗病基因近等混合系是持久防治马铃薯晚疫病的首选可行方法,概述了其发展前景。     

马铃薯晚疫病研究

马铃薯晚疫病是由疫霉(Phytophthora spp.)引起的严重的真菌病.马铃薯晚疫菌因导致马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂而成为马铃薯疫灾中危害最大的病原菌,目前关于马铃薯晚疫病的研究方兴未艾.通过对马铃薯晚疫病的描述和菌的分离,分析了马铃薯的抗病机制以及基因工程方面研究进展,并提出建议,以便在育种方面参考.     

浅谈马铃薯晚疫病防治技术

马铃薯晚疫病是一种真菌类病害,其危害之重,范围之广。几乎所有马铃薯种植地区都有晚疫病的发生。晚疫病是马铃薯的主要病害之一,每年都有不同程度的发生和流行,其造成的损失严重,在一般年份减产20%左右,流行年份,会造大量成植株提前枯死,如防治措施不当,会造成70-80%的减产,甚至绝产。本文分析了马铃薯晚疫病的发病症状、流行规律,并介绍了防治技术,以供参考。     

影响活体内马铃薯晚疫病菌卵孢子产生因素的研究

研究了不同菌株组合,马铃薯植株茎、叶及接种物中A1和A2菌株孢子囊比例、温度、湿度对卵孢子产生的影响。不同菌株组合产生卵孢子的数量有显著差异;在离体接种情况下,叶片中产生卵孢子数量大于茎中产生卵孢子数量;A1和A2菌株中孢子囊不同比例对卵孢子产生影响很大,当比例为1：1时卵孢子产生量最大;15℃光照条件下培养,并给侵染叶片持续的水分供应才能产生大量卵孢子;寄主的抗性水平对卵孢子产生有明显的影响,中抗品种上产生卵孢子量最多,高抗品种上产生卵孢子量最少,感病品种上产生卵孢子量居中。     

马铃薯种质资源的晚疫病抗性鉴定

采用离体叶片接种法,对43份马铃薯种质资源进行晚疫病抗性鉴定、比较和评价。以接种5 d后的感病品种‘Désirée’和抗病品种‘加湘1号’叶片症状为对照,鉴定出5份表现为高抗的种质资源,其中包含3个Solanum phurejia和2个S. tuberosum ssp. andigena材料。另外,还鉴定出14份中抗材料(No. 7～20)。结果表明,野生种和安第斯山栽培亚种马铃薯资源的抗性材料较为丰富,可作为晚疫病抗病育种的亲本。     

马铃薯晚疫病菌卵孢子萌发的初步研究

描述了马铃薯晚疫病菌卵孢子萌发的方式并研究了菌株组合、卵孢子形成时间、在琼脂培养基上培养时间及光照对卵孢子萌发的影响,结果表明不同菌株组合卵孢子萌发率为0—7.2%,对峙培养20天后形成的卵孢子的萌发率最高达8.7%,在琼脂培养基上培养25-30d 萌发率最高达11.4%,卵孢子形成时黑暗及在琼脂培养基上萌发时光照萌发率最高达11.8%。     

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因在转基因马铃薯中的表达

ＰＶＹ是马铃薯Ｙ病毒组的典型成员,主要感染马铃薯、番茄、辣椒和烟草等。近年来,利用植物基因工程手段获得了不少抗病毒转基因工程植物,为培育抗病毒作物新品种提供了新途径［１］。病毒外壳蛋白基因导入并使之在植物中表达可获得抗相应病毒的转基因植物,已在烟草、番茄、马铃薯、苜蓿、黄瓜和番木瓜等植物中获得成功［１～３］。本室已成功地对在我国流行的ＰＶＹＮ株系外壳蛋白基因进行了克隆及序列测定［４］,在此基础上,我们构建了植物表达中间载体,通过土壤农杆菌介导的叶盘法转化马铃薯,获得了大量转基因植株。分子检测证明…     

马铃薯晚疫病生防木霉菌的筛选及鉴定

采用马铃薯活体筛选法从268株木霉菌中筛选获得两株对致病疫霉有较强抑菌活性的木霉菌株R-5和T-15。这两株木霉菌代谢液可抑制病原菌生长及孢子囊萌发。温室防病试验发现,接种两株木霉菌可以减轻晚疫病的发生。田间试验进一步证明,两株木霉菌对晚疫病具有良好的田间防治效果,防效分别达到了72.4%和70.0%。经分子生物学方法鉴定,两株木霉菌分别为拟康氏木霉和棘孢木霉。实验构建的以活体筛选为基础的生防木霉菌筛选方法是一种可行高效的生防木霉菌筛选方式。     

马铃薯晚疫病抗性基因分子标记检测及抗性评价

马铃薯是重庆优势特色作物之一,但其安全生产受到晚疫病的严重威胁。马铃薯生产中种植抗病品种是防控马铃薯晚疫病最为经济有效和环境友好的途径。为了了解来自国内外不同种质的晚疫病抗性基因组成以及确定在重庆市具有晚疫病抗性的马铃薯品种(系),本研究以218份来自国内外的品种(系)为材料,进行了6个晚疫病抗性(R)基因分子标记检测,同时进行了田间晚疫病抗性评价及室内接种鉴定和筛选。研究结果显示,6个R基因的分子标记在供试材料中均有分布,但分子标记的组成不尽相同,主要分为4大类。第Ⅰ类含有具有广谱抗性基因的RB,晚疫病抗性评价表现为中抗以上;第Ⅲ类缺失R2 family基因标记,绝大部分表现为晚疫病敏感型;第Ⅱ类和第Ⅳ类中分别主要含有3个R基因(R2 Family+R3a+R3b)标记类型和4个R基因(R1+R2 Family+R3a+R3b)标记类型,这两类材料中表现出一定比例的晚疫病抗性水平,但第Ⅳ类中出现抗性表现的比例高于第Ⅱ类。结果说明含有RB基因标记贡献了较高的晚疫病抗性,缺失R2 famlily基因标记的材料可能不利于晚疫病抗性,利用这些基因标记辅助筛选有助于提高重庆地区晚疫病抗性育种效率。本研究评价了218份马铃薯材料6个重要R基因组成,并筛选出重庆地区表现抗性的多个材料,为新品种(系)的推广应用以及抗病育种选育提供了科学依据,同时为发掘新的抗病基因提供了遗传资源。     

影响活体内马铃薯晚疫病菌卵孢子产生因素的研究*

研究了不同菌株组合,马铃薯植株茎、叶及接种物中A1和A2菌株孢子囊比例、温度、湿度对卵孢子产生的影响。不同菌株组合产生卵孢子的数量有显著差异;在离体接种情况下,叶片中产生卵孢子数量大于茎中产生卵孢子数量;A1和A2菌株中孢子囊不同比例对卵孢子产生影响很大,当比值为1∶1时卵孢子产生量最大;15℃光照条件下培养,并给侵染叶片持续的水分供应才能产生大量卵孢子;寄主的抗性水平对卵孢子产生有明显的影响,中抗品种上产生卵孢子量最多,高抗品种上产生卵孢子量最少,感病品种上产生卵孢子量居中。     

培养条件对马铃薯晚晚疫病菌卵孢子产生的影响

马铃薯晚疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）在我国能够进行有性生殖产生卵孢子＾「１」,研究了离体培养时培养基成份、温度、光照及ｐＨ值对卵孢子产生的影响。结果表明：白云豆培养基、小米培养基和大豆培养基均适合卵孢子的产生,产生的数量为１３１．６～１４９．６个／ｃｍ＾２,但冰冻豌豆培养基不适合卵孢子的产生,产生的数量仅为５．８个／ｃｍ＾２。比较不同ｐＨ值、不同温度、不同光照条件对卵孢子     

马铃薯晚疫病菌全基因组分泌蛋白的初步分析

利用马铃薯晚疫病菌全基因组测序结果,结合计算机技术和生物信息学的方法,对马铃薯晚疫病菌的蛋白进行分析,为明确该病原菌与寄主互作的分子机制奠定基础。文章应用信号肽预测软件SignalP v3.0和PSORT,跨膜螺旋结构预测软件TMHMM-2.0和THUMBUP,GPI锚定位点预测软件big-PI Predictor,亚细胞器中蛋白定位分布预测软件TargetP v1.01,对已经公布的马铃薯晚疫病菌全基因组22 658个蛋白质氨基酸序列进行分析。结果发现,晚疫病菌全基因组编码蛋白中有671个为潜在的分泌型蛋白,占编码蛋白总数的3.0%。其中有45个分泌蛋白有功能方面的描述,其功能涉及细胞代谢、信号转导等方面;此外,还有一些与激发子类似的分泌蛋白,它们可能与晚疫病菌的毒性有关。     

抗马铃薯晚疫病质粒的分子克隆及其体外PCR扩增

从一株假单胞菌中分离其质粒DNA,并将其转化到大肠杆菌DH5α中。通过晚疫病抑菌实验证明此菌对马铃薯晚疫病有很强的抑制作用,对该质粒进行纯化和限制性酶切位点分析,将此质粒重组到含有绿色发光蛋白基因的质粒载体中。获得的重组质粒在体外经PCR扩增证明抗晚疫病的重组质粒已克隆到含有绿色光蛋白基因的质粒载体中。     

福建省马铃薯晚疫病菌线粒体DNA单倍型分析

为明确福建省马铃薯晚疫病菌线粒体DNA单倍型组成和分布情况,采用PCR-RFLP方法分析了2010—2012年从福建省7个地区（福州,长乐,漳州,青口,龙海,霞浦,龙岩）分离的526个马铃薯晚疫病菌株的线粒体DNA单倍型及频率分布。结果表明Ⅰa型为主要单倍型,占72．8％,其次是Ⅱb型,占26．42％,最少的Ⅱa型,占0．76％,没有检测到Ⅰb型。与文献报道历史材料相比较,说明福建省马铃薯晚疫病菌线粒体DNA单倍型的组成发生较大变化,而且福建省马铃薯晚疫病菌线粒体单倍型组成比云南、四川和贵州等地区更为复杂。     

马铃薯POTHR-1 cDNA的克隆及晚疫病菌和其他非生物因子诱导表达分析

利用RACE和重叠延伸相结合的方法,从经晚疫病菌接种诱导的马铃薯水平抗性材料叶片中克隆了一个POTHR-I基因(potato Phytophthora infestans-induced hypersensitive response related protein gene)的全长cDNA。序列分析表明,该基因编码225个氨基酸,与烟草harpin诱导蛋白基因hinI有很高的同源性(编码区核苷酸和氨基酸序列分别为83％和81％)。Southern杂交结果显示在马铃薯基因组中有2、3个拷贝。对其诱导表达模式研究表明：晚疫病病原菌接种36h后,该基因表达迅速增加;机械伤害及茉莉酸(JA)处理能够诱导表达;渗透胁迫(NaCI浸泡)能够诱导其微弱表达;但水杨酸(SA)不能诱导表达。该基因可能和病原与寄主互作时寄主产生过敏反应及细胞生理性死亡有关。     

水稻黄单胞细菌Harpin蛋白的遗传多样性及其诱导烟草过敏反应和抗病性功能

利用PCR方法从水稻黄单胞细菌(Xanthomonas oryzae)两个致病变种(pv. oryzae和pv. oryzicola)的12个菌株中, 扩增出了编码诱导植物过敏反应蛋白激发子Harpin的3类hrfA (hypersensitive response functioning factor A)同源基因hrf1, hrf2和hrf3. 同源性分析表明, 这些同源基因推测的编码产物均富含甘氨酸, 缺乏酪氨酸, 在序列的第45位附近的氨基酸都有一个半胱氨酸. Harpin_Xoo由来源于水稻白叶枯病菌的hrfA基因编码, 产物包括两类, 一类代表菌株为JxoⅢ, 其中GGG-GG基序的重复数为3个, 分子量为15.6 kD; 另一类代表菌株为Pxo112, 产物中GGG-GG基序的重复数为4个, 分子量为15.9 kD, 这两个基因分别命名为hrf1和hrf3. Harpin_Xooc由来源于水稻条斑病细菌的hrfA基因编码, 代表菌株为RS105, 其中GGG-GG重复数为2个, 分子量为15.3 kD, 水稻黄单胞菌Harpin分子中的一个半胱氨酸残基是其特有的. 将这3类基因与已报道的hpa1和xop1基因编码的氨基酸序列进行聚类分析, 结果可以将其分为4类, 来源于水稻黄单胞菌的Harpin_Xoo和Harpin_Xooc被分在相邻的两类中. 对3种产物进行比较研究结果, 在相同条件下3个代表菌株JxoⅢ, RS105和Pxo112的hrfA基因(hrf1, hrf2和hrf3)表达蛋白的相对浓度分别为: 0.389, 0.530, 0.083 mg/mL. hrf1, hrf2和hrf3在大肠杆菌(Bl21)中的表达产物(Harpins)在烟草上均能激发过敏反应和诱导抗病性, 其生物活性依次为Hrf2, Hrf1和Hrf3.     

基于高通量测序的福建北部马铃薯晚疫病株根际土壤细菌群落分析

[背景]马铃薯晚疫病是一种由致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont.)de Bary]引起的毁灭性病害,当环境条件适宜时,残留在土壤中的病原菌会侵染马铃薯植株导致病害的发生.[目的]明确健康马铃薯植株与发病植株的根际土壤细菌结构与多样性.[方法]采集马铃薯晚疫病发病地的健康植株根际土壤(M2J...