电脉冲作用将外源基因导入稀有(鱼句)鲫精子的研究

将稀有鲫 (Gobiocyprisrarus)精子与重组质粒pCAhLFc线性DNA混合温育 ,经电脉冲处理后与卵子受精 ,孵化出苗。从鱼苗中提取DNA ,经PCR检测 ,2 5 .5 %～ 6 6 .7%鱼苗带有外源基因。在显微镜下观察经电脉冲处理过的精子 ,发现其活力有不同程度下降 ,受精率也有不同程度下降 ,说明不同的电脉冲条件对精子有不同程度的损害作用。精子与外源DNA混合温育 ,经电脉冲处理后 ,用DNA外切酶消化后 ,提取精子DNA ,经PCR检测 ,仍有阳性电泳带 ,证明电脉冲可以促使稀有鲫精子摄入外源基因     

电脉冲作用将外源基因导入稀有ju鲫精子的研究

将稀有ju鲫（Gobiocypris rarus）精子与重组质粒pGAhLFc线性DNA混合温育,经电脉冲处理后与卵子受精,孵化出苗。从鱼苗中提取DNA,经PCR检测,25.5%～66.7%鱼苗带有外源基因。在显微镜下观察经电脉冲处理过的精子,发现其活力有不同程度下降,受精率也有不同程度下降,说明不同的电脉冲条件对精子有不同程度的损害作用。精子与外源DNA混合温育,经电脉冲处理后,用DNA外切酶消化后,提取精子DNA,经PCR检测,仍有阳性电泳带,证明电脉冲可以促使稀有ju鲫精子摄入外源基因。     

山羊精子结合外源DNA能力的年龄及品种依赖性

本文应用正交设计L16(44),优化精子和外源DNA处理条件;用建立的方法转染1-4岁川东白山羊和波南F1公羊、2岁波尔山羊和南江黄羊公羊共149只,用原位杂交法检测精子结合外源DNA的效率,比较不同品种、年龄的山羊(Capra hircus)精子结合外源DNA的能力。结果显示川东白山羊1岁时的阳性精子率为39.34%±13.76%,4岁时降为23.40%±19.37%,与1岁和2岁时相比,差异显著;南江黄羊的阳性精子率最高,波尔山羊最低;并筛选到一种山羊精子和外源DNA处理方法。表明实验山羊的精子结合外源DNA的能力有随着年龄的增长而减少的趋势,并表现出品种间差异。     

脂质体介导鸡精子与外源DNA的结合

精子充当外源ＤＮＡ的载体提出了一条新的基因转移途径。由于这个构想方法学非常简单,利用人工授精程序就可以生产转基因动物,因而引起人们广泛的注意^[1].精子载体法一出现就引发了一场争论,对于这种方法的可行性人们仍持谨慎态度^[2-3].精子在与外源DNA混合培养后DNA能否进入精子的内部,这是精子载体法是否可行的关键。本文应用Southem杂交技术分析了精子与外源DNA的相互作用。     

流式细胞仪原理及其在奶牛性别控制上的应用

流式细胞仪分离得到的定性奶牛精子,借助人工授精技术或其他相关技术已经生产出许多预知性别的后代奶牛。流式细胞仪分离精子的原理是基于携带有X或Y性染色体精子的DNA含量不同。高性能的流式细胞仪可以达到每小时分离1.5～2×108个精子,并且准确率可达到90%。该项技术的应用使得奶牛的人工授精和低温保存技术更为便利,并且该项技术也可以用于其他养殖动物X、Y精子的分离。     

流式细胞仪分离精子法的研究进展

以X精子和Y精子的DNA含量差别为基础的流式细胞仪分离精子技术是有效的哺乳动物性别控制方法。目前,流式细胞仪分离精子的速度与上世纪90年代初期相比已提高了30多倍,以3000个/秒的常规速度分离X精子或Y精子的准确率可达到85%～90%。迄今,用分离精子人工授精已产下了数万头的动物后代,而分离人的精子也开始应用到了避免X染色体连锁遗传疾病的生殖医学工程中。     

提高精子转染外源DNA效率的山羊精液冷冻方法

目的筛选一种既提高精子转染外源DNA效率,又保持解冻后精子活力的山羊精液冷冻—解冻方法。方法应用正交设计L9(34),因素分别为稀释液种类、稀释比例、降温时间和解冻液,每个因素选择3个水平,检测和比较解冻后精子转染外源DNA效率和精子活力。结果所选冷冻—解冻各因素对精液转染效率影响不显著[F(8,18)=1.032,P=0.449];平衡时间对冷冻—解冻活力影响极显著[F(2,24)=9.972,P=0.001],平衡1h极显著小于平衡2 h和4 h的精液活力(P=0.003,P=0.000),以平衡4 h最好。用筛选的冷冻—解冻方法处理精液,解冻后精子的活力极明显降低(P=0.002);生存指数降低,GOT释放量增加,菌落数减少,与鲜精相比差异显著(P=0.018;P=0.016;P=0.018);精子畸形率增加,顶体完整率降低,与鲜精相比差异不显著(P=0.494;P=0.084)。结论优化了提高精子转染外源DNA效率的山羊精液冷冻—解冻方法。     

LINC00261/miR-182-5p/PFN1对乙肝病毒相关性肝细胞癌HepG2.2.5细胞放疗抵抗的影响

[目的]探讨LINC00261调控miR-182-5p/PFN1轴对乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌HepG2.2.15细胞放疗抵抗的作用机制。[方法]用1 Gy的X射线处理HepG2.2.15细胞得放疗抵抗细胞HepG2.2.15/R,RT-qPCR检测LINC00261和miR-182-5p表达,Western Blot检测PFN1的表达,CCK-8检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,彗星实验检测DNA损伤情况;双荧光素酶报告基因实验验证miR-182-5p和LINC00261或PFN1的靶向关系。[结果]LINC00261在HepG2.2.15细胞中低表达(P<0.01),且在其放疗抵抗细胞HepG2.2.15/R中表达更低(P<0.01)。过表达LINC00261抑制HepG2.2.15/R细胞增殖(P<0.01),诱导细胞凋亡(P<0.05)和DNA双链断裂(P<0.01);6 Gy X射线处理可上调过表达LINC00261对HepG2.2.15/R细胞凋亡(P<0.05)和DNA损伤的促进作用(P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验证实miR-182-5p与LINC00261或PFN1的靶向关系。过表达LINC00261或过表达PFN1可下调过表达miR-182-5p对HepG2.2.15/R细胞增殖的促进作用(P<0.05)以及对凋亡和DNA损伤的抑制作用(P<0.05)。[结论]过表达LINC00261靶向下调miR-182-5p,促进PFN1表达,促进HepG2.2.15细胞放疗抵抗。     

山羊精子结合和内化外源DNA的特征及影响因素

外源DNA与精子相互作用后的定位及内化率是精子载体法制备转基因动物的关键环节.实验以标记的DNA片段为示踪材料,就精子与外源DNA相互作用的基本特征及影响因素进行了研究.结果表明:山羊精子可自发性结合外源DNA,外源DNA最初结合于顶体后区质膜外表面,随后部分内化进入细胞内.精子对外源DNA的结合和内化能力随供体的不同而差异明显,在实验所检查的35只公羊中,结合率(DNaseⅠ消化前)波动于4.6%～62.4%,内化率(DNaseⅠ消化后)波动于2.1%～53.8%,个体间差异显著(P<0.01).对于同一供体的精子而言,阻止DNA结合的最主要因素是精浆,与射出的原精液相比,洗涤后精子的结合率和内化率分别提高了3倍和5倍;其次精子获能也将导致结合率和内化率降低(P<0.01).死精子不能完成外源DNA的内化过程,但反复冻融导致质膜破裂的死精子具有更高的结合率,而且阳性率与动物个体无关.上述结果提示,筛选合适的精子供体,采用优化的转染处理方法是提高精子载体方法效率的前提和保证.     

动物遗传工程

941595将外源基因显微注入牛胚胎并在胚泡期进行检测[英]/Behboodi,E.…∥J.Dairy Sci.-1993,76(11).-3392～3399[译自 DBA,1993,12(26),93-15254] 测定了显微注入DNA并离体培养或培养于绵羊输卵管中的原核期牛受精卵的存活及发育,确定了在胚泡阶段保留外源DNA的胚胎的百分数。与精子共培养后18～20小时,检测离体成熟并受精的     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

931521闭合环状质垃DNA的羽备[专,英3/Hyman,E.…,W09213—963 l 30.01.91-US.647789(20.08.92)22.01.92 as U 00540.92—300048/36(20页)[译自DBA,1992,11(23),92-12897~ 从细胞成细胞器中纯化闭合环状(cc)DNA的新方法是· (1)用溶菌酶酶解细胞或细胞器I(2)用蛋白酶处理DNA, (3)加热使所有非环状DNA变性成单链(ss)形式,(4)用内切酶(I)类处理,消化RNA和染色体DNA, (5)回收ccDNA。最好由大肠杆菌纯化ccDNA,并用蛋白酶一K。当ccDNA是双链时,制备时在用核酸酶处理前用DNA一局部异构酶处理,释放出超螺旋质粒DNA。 (朱遐)93152…     

苯甲基磺酰氟（PMSF）在犬精子4℃保存中的作用

目的探讨4℃保存的条件下,苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF）对犬精子的保护作用。方法犬精子以含不同浓度PMSF的Tris-卵黄液（Tris-egg yolk,EYT）处理后,于4℃低温保存,在24、48、72、96 h分别以伊红、瑞-吉和吖啶橙染色检测精子活率、顶体膜和DNA完整性。结果低温保存24 h后,吖啶橙染色检测DNA断裂率（%）：对照组（5.93±0.32）,实验组：20μg/mL（4.50±0.38）、40μg/mL（4.20±0.25）、80μg/mL（4.21±0.46）、160μg/mL（3.87±0.67）,P〈0.05;各浓度组之间没有明显差异;72 h后,犬精子活率仍〉30%;96 h内,对照组和实验组犬精子在活率、顶体膜完整性上未见明显差异。结论PMSF于4℃低温保存条件下对犬精子具有保护作用,24 h内能有效保护精子DNA双链的完整性,4℃低温保存72 h后,犬精子仍符合人工授精要求。     

精子因素对精子载体法制备转基因山羊的影响

精子具有主动结合、转运、整合外源DNA的能力,并在受精时导入卵母细胞,获得转基因动物.精子介导基因转移(sperm-mediated gene transfer,SMGT)是目前获得转基因动物简单而高效的方法之一.精子因素是影响SMGT方法生产转基因动物的重要方面.本论文结合我们的研究针对转染用山羊(Capra hircus)精液的来源、精子质膜完整性、精液品质及发育阶段等精子因素影响精子结合外源DNA和SMGT方法生产转基因山羊的效率进行了论述,并从这些影响因素入手,提出了筛选精子供体、保持精液品质、调控质膜等措施,提高精子转染外源DNA能力和生产转基因动物的效率.     

大熊猫精液品质的研究Ⅰ.精液质量的动态观察

本文用11只大熊猫作了41次人工采精。其精液质量表明,在6—20岁的雄兽发情季节里,只要采精技术得当,均能采到可用作人工授精的精液。鲜精在0—4℃保存61小时,或冷冻精液超低温(-196℃)保存1—6年,解冻后在37℃培养90分钟,其精子活力仍在30％以上,用作人工授精,仍能达到受孕、产仔效果。 将大熊猫与几种猫科及食草动物的精液质量进行比较,大熊猫的精子畸形率(6—59％,平均29.74％)比其他动物高,这是大熊猫自然交配或人工授精后受孕率仍然很低的重要原因之一。对大熊猫进行科学饲养管理,可以提高大熊猫的性欲和自然交配能力。     

山羊精子介导法转染外源基因影响因素及最适条件的研究

探讨山羊精子与外源DNA共孵育转染外源DNA效率的影响因素,优化精子转染程序.用DIG免疫组化方法检测和比较精子转染效率,因素为精子洗涤程度、转染缓冲液、精予活力、BSA、肝素、异种动物精浆等.离心洗涤3次以内的山羊精子DNase Ⅰ消化前、后阳性率随洗涤次数增加而显著增加(P＜0.05),而离心3次以上的转染效率略有下降;以mDM为共孵育缓冲体系可获得较高的转染效率;活力为0.55的精子转基因阳性率显著低于活力为0.9的精子(消化前、后阳性率分别为35.4±2.9%和21.8±5.3% vs 63.5±7.2%和50.3±2.8%,P＜0.os);共孵育体系中异种动物精浆可显著降低转染效率(P＜0.01),甚至与肝素可置换出已结合和内化转运到精子内的外源DNA,而共孵育体系中的BSA可抑制精子内化外源DNA.山羊共孵育法转染外源基因最适转染条件为mDM缓冲液洗涤3次后上浮收集高活力精子进行转染.     

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯对离体人成熟精子功能的影响

该文研究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]在体外对人成熟精子功能的影响。用0,0.1,1,10,100μmol/L DEHP处理离体人成熟精子后,利用伊红苯胺黑染色、计算机辅助精子分析系统、精子穿甲基纤维素实验、金霉素染色等方法检测精子存活率、运动、超活化、获能、顶体反应等生理功能。结果显示,DEHP在短时间内不影响精子存活率,但是抑制精子运动、超活化以及孕酮诱导的获能和顶体反应。推测DEHP体外急性染毒会抑制人成熟精子功能。     

冷冻—解冻猪精子的超微结构观察

自从50年代初Polge发现甘油有卓越的防冻作用以后,动物精液冷冻技术发展很快。现在,奶牛和羊冷冻精液已广泛应用于人工授精和体外受精中,效果与鲜精接近,而猪冷冻精液在人工授精后虽也能产仔,但妊娠率与每窝产仔数均下降(Johnson等,1981);体外受精率可达85％以上,但精子浓度需用5—6×10_7精子/ml,比鲜精用量提高25—100倍(Wang等,1991)。顶体形态正常精子的减少是造成冷冻精液受精率低的重要原因之一(Pursel,1979),用光镜不能清楚地观察顶体的形态变化,但运用电镜技术对猪冷冻-解冻精子的顶体形态的超微结构研究报道不多(Courtens等,1985;Hashizume,1990)。针对猪冷冻—解冻精子体内/体外受精能力降低的问题,我们用透射电镜对冷冻的猪精子解冻0 h及4 h后精子顶体与头部质膜的超微结构变化进行了观察。     

正常人及不育者精子核DNA的定量研究

用流式细胞术,Feulgen显微分光光度法,荧光显微分光光度法测定正常人精子核DNA相对含量:结果表明,上述方法所测得的精子核DNA相对含量稳定,变化范围小。同时用Feulgen显微分光光度法测定不育者精子核DNA相对含量。显示不育者精子核DNA相对含量高于正常人,提示精子核DNA核蛋白复合物异常可能是某些男性不育症的原因。此项研究为诊断男性不育症提供了新方法,在男性学精子核分子研究方面提供了依据。     

基因工程

960001 用次级脉冲场凝胶电泳分离大分子DNA[英]/Lai,E.…∥Anal. Biochem. -1995,224(1).-68～74[译自DBA,1995,14(7),95-03698] 报道了用次级脉冲场凝胶(SPFG)电泳在不降低分辨率的情况下提高大分子DNA的分离速度。然而,重复SPFG条件的试验却没有成功。于是人们试图精确限定次级脉冲对分离大分子DNA的作用,以确定该技术用于分离分子量最大为1100kb     

乙二醇降低超低温冷冻黄姑鱼精子的DNA损伤

为了解乙二醇(EG)为抗冻剂超低温冻存黄姑鱼(Nibea albiflora)精子的活力及DNA损伤情况,本研究以Hank′s盐溶液(HBSS)为稀释液,5%~30%乙二醇(EG)为抗冻剂,0.5 ml麦细管为冻存管,两步降温法超低温冷冻保存黄姑鱼精子,用显微观察法测定精子活力,用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测精子的DNA损伤,用SPSS 11.5处理实验数据。黄姑鱼鲜精的激活率为85.67%±2.09%、运动时间为(318.67±6.11)s、寿命为(405.67±7.77)s。5%、10%、15%乙二醇(EG)组冻精的运动时间及寿命与鲜精相比差异不显著,其中10%乙二醇(EG)组冻精的激活率为84.67%±1.15%、运动时间为(319.00±12.12)s、寿命为(400.67±4.73)s;20%、25%、30%乙二醇(EG)组冻精的运动时间及寿命与鲜精相比差异显著。5%、10%、15%、20%乙二醇(EG)组冻精核DNA损伤状况与鲜精无显著差异,25%、30%乙二醇(EG)组冻精核DNA损伤状况与鲜精差异显著,且冻精核DNA的损伤程度与乙二醇(EG)浓度成正相关。分析认为,5%~15%乙二醇(EG)适宜作为黄姑鱼精子超低温冷冻保存用抗冻剂。