沙冬青RING型锌指蛋白基因AmRFP1的克隆与功能初步分析

利用RT-PCR方法,从强抗逆植物蒙古沙冬青克隆到1个受寒旱诱导的锌指蛋白基因AmRFP1。预测其编码蛋白由366个氨基酸残基组成,其中含有1个C3H2C3型锌指结构域,故属于RING-H2(C3H2C3)型锌指蛋白。该蛋白还含有2个跨膜区,很可能定位于细胞质膜。半定量RT-PCR分析表明,在不同季节野外生长沙冬青植株嫩叶中,AmRFP1在夏季只有低水平表达,进入秋季后表达量明显增加,尤其在秋末冬初其表达量迅速增加并达到全年最高峰,但在进入最寒冷的隆冬后又回落至秋季水平并维持到翌年春季基本未变。将该基因在拟南芥中超表达,则明显降低了转基因拟南芥的抗冻性。     

沙冬青AmNAC6基因的克隆与功能初步分析

以强抗逆植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.)为材料,克隆获得一个NAC转录因子基因Am NAC6的全长cDNA,并对其序列特征、蛋白质亚细胞定位和表达模式进行了分析。研究结果表明,Am NAC6基因的编码蛋白由304个氨基酸组成,具有NAC家族典型的结构特征,亚细胞定位实验证实该蛋白分布于细胞核内。表达图谱分析结果显示,在室内培养的沙冬青幼苗中,Am NAC6的转录水平受干旱、高盐、低温和高温胁迫的影响,其中在干旱诱导下该基因的转录水平上调较为明显;野外生长植株的嫩叶中,该基因的转录水平在中秋和初冬略低于其他季节,春季则低于其在侧根、嫩枝、花蕾和未成熟果荚中的转录水平。此外,本研究还将Am NAC6基因成功地构建到植物表达载体。     

沙冬青AmFAD7和AmFAD8基因的克隆与转化及其功能初步分析

对强抗逆植物蒙古沙冬青2个脂肪酸去饱和酶基因AmFAD7和AmFAD8的功能进行了初步研究。结果表明:(1)AmFAD7和AmFAD8的编码蛋白分别含455和457个氨基酸残基。(2)半定量RT-PCR分析显示,在野外生长植株的嫩叶中,AmFAD7表达量在夏季很低、冬季较高,春秋两季略低于冬季,而AmFAD8在春秋两季和初冬时表达量高于其他月份;在低温(4℃~-6℃梯度降温)处理2~48h的幼苗中,AmFAD7的表达呈先降低后升高的变化趋势,而AmFAD8的表达比处理前略有上调;在高温(42℃)处理2~48h的幼苗中,2个基因的表达均被抑制,尤其对AmFAD7的抑制较为迅速而且明显;在干燥处理2~48h的幼苗中,AmFAD7的表达量有较明显的升高,而AmFAD8则略有降低。(3)成功构建了2个基因的植物表达载体(p3300-35S-AmFAD7和p3300-35S-AmFAD8)并转化拟南芥,分别获得18和16个转基因株系。RT-PCR检测表明,其中F7-1和F7-2以及F8-1~F8-4转基因株系中目的基因的表达量均较高。(4)相对电导率分析显示,在正常温度下,AmFAD7转基因株系(F7-1和F7-2)的相对电导率与野生型无显著差异;在低温(-1℃)胁迫24h后,F7-1和F7-2的相对电导率(分别为32.8%和36.1%)显著低于野生型(48.5%),而在高温(37℃)胁迫24h后,F7-1和F7-2的相对电导率(分别为44.7%和41.9%)显著高于野生型(33.2%)。研究表明,AmFAD7在转录水平受低温和干燥胁迫的诱导,但被高温胁迫抑制,而AmFAD8的转录受低温诱导但被干燥和高温胁迫抑制;在拟南芥中组成型表达AmFAD7增强了转基因植株在低温胁迫下细胞膜的稳定性及其耐冻性,但却增加了其在高温胁迫下的细胞膜损伤程度和热敏感性。     

沙冬青AmFAD2-1基因的克隆及其功能分析

细胞膜脂的不饱和度主要由脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)决定,二者与植物抵抗低温和高盐等逆境胁迫密切相关。沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是中亚荒漠区唯一的常绿旱生阔叶植物,具有很强的耐寒、耐旱和耐盐碱等特性。该研究利用RT-PCR方法克隆到沙冬青油酸去饱和酶基因AmFAD2-1的cDNA和gDNA,其中后者不含内含子。在AmFAD2-1蛋白(含382个氨基酸残基)序列中含有FAD家族必须的保守组氨酸簇和内质网定位信号及跨膜结构域。进化分析表明,AmFAD2-1与大豆(Glycine max)和柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)等豆科植物的FAD2距离较近,而与玉米(Zea mays)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)等其他植物的FAD2距离较远。qRT-PCR分析表明,在室内培养的沙冬青幼苗中,AmFAD2-1的表达量在低温处理2～24h和干旱处理6～13d期间显著上调,在盐胁迫处理期间则呈现升高、降低、再升高的变化趋势;在野外生长的沙冬青成株嫩叶中,其表达量在秋季和冬季总体上明显高于春季和夏季。成功构建了植物表达载体p3300-35S-AmFAD2-1并通过根癌农杆菌介导法转化野生型拟南芥,获得16株转AmFAD2-1基因植株。耐逆性鉴定表明,转基因株系的耐冻性较野生型拟南芥显著提高,其耐旱性和耐盐性也比后者有较明显的改善。     

沙冬青CBF/DREB1转录因子cDNA的克隆及序列分析

CBF/DREB1(C-repeat binding factor/dehydration resistance element binding protein 1)是一类抗逆相关的转录因子,它们的表达可以激活下游一系列抗逆应答基因的表达,从而提高植株的抗逆性.沙冬青(A mmopiptanthus mongolicus)主要生长在中国西北荒漠和半荒漠地带,是典型的旱生资源植物,具有突出的抗寒、抗旱、耐盐碱特性.本文以沙冬青为实验材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆了沙冬青CBF/DREB1基因cDNA序列,并对其进行了序列分析.结果表明:沙冬青CBF/DREB1转录因子基因序列全长为991 bp,包括624 bp的开放阅读框(ORF),起始密码子ATG,终止密码子TAA,114 bp的5UTR和253 bp的3UTR,以及加尾信号AATAAA及poly(A)_(11).生物信息学预测其演绎的氨基酸序列具有AP2结构域,且AP2结构域的两端拥有CBF家族特有的PKK/PPAGRxKFxETRHP和DSAWR两段短多肽序列,属于CBF家族.沙冬青CBF/DREB1转录因子的克隆为进一步研究植物抗逆和获得抗性基因提供了新的候选基因,也为进一步从分子水平上验证其功能,深入理解植物适应干旱、低温和高盐机制奠定基础.     

沙冬青属的细胞学研究

沙冬青属(Ammopiptanthus)植物仅两个种,即蒙古沙冬青(A.mongolicus)和新疆沙冬青(A.nanus),为第三纪残遗种,是中亚荒漠唯一的常绿阔叶植物,因珍稀,临危而被列为国家重点保护植物”。国内外对该属两个种的染色体数目的记载存在着差异。本文对沙冬青属两种植物的染色体数目和核型进行了分析研究,旨在为探讨该属植物的发生和系统发育,以及开展植物多样性保护和合理开发利用积累资料。     

沙冬青染色体数目及核型的研究

本文首次报道了沙冬青的染色体数目及核型,沙冬青 Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.)Cheng f.染色体基数目为x＝9,其核型公式为 2n=18=4m十14sm(2SAT)。     

蒙古沙冬青AmDREB2C基因的克隆及表达分析

蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是中国西北荒漠区唯一的常绿阔叶灌木,具有很强的抗寒抗旱特性。利用PCR方法从该植物克隆到转录因子Am DREB2C的c DNA和基因组DNA的全长编码区,二者均由1191 bp组成,无内含子序列,编码由396个氨基酸残基组成的蛋白,其中含1个AP2结构域和1个核定位信号。表达分析显示,Am DREB2C的转录受低温和干旱胁迫的诱导。此外,将该基因编码区c DNA成功构建到植物表达载体p CAMBIA3300-35ST上,为后续研究其功能奠定了基础。     

蒙药沙冬青的化学成分研究

从蒙古沙冬青分离得到了7个非生物碱类化合物,通过波谱学方法及与文献对照的方法鉴定为:β-谷甾醇(1)、白藜芦醇(2)、染料木素(3)、芒柄花素(4)、毛异黄酮(5)、maackiain(6)和trifolirhizin(7).其中化合物2、6和7为首次从蒙古沙冬青植物中得到.     

沙冬青淀粉粒及其与叶绿体发育的关系

沙冬青叶绿体中的淀粉粒一般为１－３个,主要有４种类型。第１种外周部分电子密度较高,中央部分较低,但每个部分的电子密度十分均匀。它们近似椭圆形,附近的类囊体形态正常,结构清晰。第２种电子密度由外向内逐渐变低,多为椭圆形,附近的类囊体较清晰。第３种外周部分的电子密度很高,中央部分不均匀,形状多种多样,附近的类囊体有的不清晰。第４种电子密度很低,十分均匀,形状不规则,附近的类囊体已经解体或正在解体。分析表明,淀粉的形态变化明显与叶绿体发育有关。     

沙冬青CBL1蛋白纯化及性质研究

CBL是近年来发现的一类钙信号转导蛋白,CBL-CIPK组成的信号通路在植物应答生物和非生物刺激中发挥重要作用。其中CBL1和相应的CIPK在低钾,渗透压,干旱,机械损伤,及冻伤等环境胁迫中发挥重要作用。通过对沙冬青CBL1表面带电氨基酸定点突变,表面赖氨酸甲基化后电荷消除证明了沙冬青CBL1(AmCBL1)在钙离子存在下的非特异性聚集是由于分子间的电荷相互作用引起,三体蛋白很可能是沙冬青CBL1蛋白发挥功能的单位。通过甲基化可以得到聚合状态均一的蛋白,为CBL1晶体生长奠定了基础。     

Purification and Structure Analysis of Antifreeze Proteins from Ammopiptanthus mongolicus

Abstract

We purified many kinds of antifreeze proteins with high activity from the leaves of Ammopiptanthus mongolicus by several biochemical techniques. The antifreeze activities of these AFPs were measured by both osmometry and differential scanning calorimetry, and the inhibition of growth of ice crystals by the AFPs was obvious. Additionally, the antifreeze proteins were analyzed by sequencing, glycosylation reaction, mass spectroscopy, and circular dichroism spectroscopy. Both samples have some other unique structures different from those of fishes and of insects. It was suggested that plant AFPs might have a particular antifreeze mechanism in comparison with that of fish and insects.     

沙冬青AmLEA5基因的生物信息学分析及非生物胁迫下的表达模式

本文对用固相扣除杂交方法从低温驯化沙冬青克隆得到的AmLEA5基因进行分子特性和表达模式分析,生物信息学分析表明该基因编码一种第5族胚胎晚期发生丰富蛋白（LEA）。AmLEA5基因全长693 bp,含有1个297 bp的开放阅读框,编码98个氨基酸,预测AmLEA5的分子量为10.6 kDa,是一种亲水性蛋白,有多个磷酸化位点。密码子偏好性分析表明该基因略偏好于用A或T结尾的密码子。系统发生分析表明,AmLEA5蛋白与蒺藜苜蓿LEA（ACJ84182.1）亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示AmLEA5的表达量在低温、干旱、盐和热胁迫条件下均有上调,尤其在低温胁迫后期富集量最高。亚细胞定位表明,用YFP标记的AmLEA5位于细胞质和细胞核内。一系列实验结果说明AmLEA5基因在沙冬青抵御非生物胁迫,尤其是在抵御低温胁迫机制中发挥重要作用。     

Purification and Identification of Antifreeze Proteins in Ammopiptanthus mongolicus

The conventional protein chromatography technique was adopted to purify the antifreeze proteins (AFPs) from the leaves of Ammopiptanthus mongolicus ( Maxim. ) Cheng f. Two bands on native PAGE gel showed thermal hysteresis activity, one was band Bi, whose thermal hysteresis was 0.46 cE at 8 g/L, which showed two bands (67 kD, 21 kD) on SDS-PAGE gel; the other was B3, whose thermal hysteresis was 0.45 cE at 10 g/L, and it contained only a single protein (39.8 kD). Both B1 and B3 are not glycoproteins, because neither do they interact with Shift-reagent, nor show ultraviolet characteristics of a typical glycoprotein.     

珍稀濒危植物沙冬青花生物学研究

沙冬青蝶形花冠,柱头具指状突起,分长柱头和短柱头。群落花期约47 d,单花花期约7 d,分为露黄、微开、盛开、凋谢4个时期。TTC法测定4个时期花粉均具活力,可保持70 d左右,苯胺蓝测定柱头可受性3~4 d。沙冬青花一般在开花前一天就开始泌蜜,开花第2~3 d,分泌量达到高峰,花后4~5 d产蜜量减少直至停止,日泌蜜和散粉集中在10:00-14:00。沙冬青开花受环境的影响。     

Study on Chromosome Number and Karyotype of Ammopiptanthus mongolicus

This paper deals with chromosome number and karyotype of Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.) Cheng f., whose karyotype formula is 2n = 18 = 4m+14sm(2SAT), and the basic number of the genus is x = 9.