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1.
【目的】从高产甘油生产菌株产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)基因组中克隆了NAD+依赖3-磷酸甘油脱氢酶编码基因(CgGPD),但是该基因及其上游调控序列具体的功能还是未知的。本文研究了CgGPD基因及其上游调控序列的功能。【方法】本文以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及其渗透压敏感型突变株为宿主,构建3种不同的酵母表达载体导入酵母细胞,研究了不同酵母转化子在渗透压胁迫条件下CgGPD基因表达对细胞的耐高渗透压胁迫应答及其细胞的甘油合成能力的影响。【结果】实验结果表明无论是以来源于S. cerevisiae 的TPI启动子还是来源于CgGPD基因的启动子,过量表达CgGPD基因的转化子均能够显著加速葡萄糖消耗速度和提高甘油合成能力,在gpd1/gpd2突变株中表达CgGPD基因能够消除细胞对外界高渗透压的敏感性,同时转化子胞内甘油大量积累。【结论】CgGPD基因在野生型酵母S. cerevisiae W303-1A表达显著提高细胞的甘油合成能力,在gpd/1gpd2突变株中能够互补GPD1基因的功能,CgGPD基因表达受渗透压诱导 调控。 相似文献
2.
【背景】熊蜂生假丝酵母(Starmerella bombicola)作为一种非常规假丝酵母菌株,因其具备高产槐糖脂生物表面活性剂的能力而受到广泛关注。然而,由于自身的表达系统并不完善,限制了该菌株的代谢工程改造。【目的】克隆、筛选及鉴定新的系列内源启动子表达元件。【方法】通过对比分析熊蜂生假丝酵母全基因组及9种功能已知目的基因信息,并结合启动子预测网站,筛选获得系列启动子候选序列,以SbGFP (密码子优化后的酵母增强型绿色荧光蛋白)为报告基因进行整合表达,通过绿色荧光蛋白强度及转录水平分析鉴定启动子强度。【结果】在分别以葡萄糖和油酸作为唯一碳源的条件下,启动子PTEF1和PGPD在不同碳源培养条件下均显示出较高的转录水平。启动子PCYP52M1、PUGTA1、PUGTB1及PMOB在以油酸为唯一碳源时具有弱转录活性,而在以葡萄糖为唯一碳源时则未检测到它们具有转录活性,推测它们是油酸诱导型启动子。进一步利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)对SbGFP进行转录水平分析,检测结果与绿色荧光表达水平一致。【结论】获得了系列熊蜂生假丝酵母内源性启动子,进一步丰富了该菌株的表达元件,为菌株的代谢工程改造及基因的表达与调控奠定了理论基础。 相似文献
3.
【目的】通过构建转录因子lah-3基因缺失突变体,研究lah-3基因缺失突变体菌株的渗透压表型,进而探究lah-3基因在渗透压调控中的作用。【方法】采用同源基因重组敲除技术构建lah-3基因缺失突变体。用4%NaCl和1 mol/L Sorbitol进行渗透压处理。利用Northern blot检测渗透压应答基因的表达。利用Westhern blot检测LAH-3蛋白磷酸化修饰水平,OS-2蛋白的表达水平及其磷酸化修饰水平。【结果】在转录因子lah-3基因缺失突变体中,渗透压应答基因gcy-1、stl-1以及pck-1的表达水平都明显降低,而且在渗透压刺激下,LAH-3蛋白磷酸化修饰水平升高。LAH-3的磷酸化修饰不受OS-2调控。lah-3基因的缺失既不影响OS-2蛋白的表达水平,也不影响其在渗透压刺激后的磷酸化修饰。【结论】粗糙脉孢菌中转录因子LAH-3参与调控渗透压应答基因的转录,但其响应过程不依赖于OS-2 MAPK信号通路。 相似文献
4.
【目的】bHLH转录因子数量众多,能够广泛参与植物的生长发育和逆境胁迫等过程。本试验以蒺藜苜蓿R108为材料,初步探讨MtbHLH25基因的功能。【方法】通过PCR扩增技术从蒺藜苜蓿中克隆MtbHLH25基因和启动子,构建酵母表达载体并用LiAc转化法转移到Y2H Gold酵母菌株中进行酵母自激活检测,构建亚细胞定位载体并通过冻融法转入农杆菌EHA105,菌液注射到烟草下表皮细胞后利用SP8激光共聚焦显微镜观察,通过实时荧光定量PCR技术研究MtbHLH25基因的时空表达水平。【结果】(1)从蒺藜苜蓿中成功克隆出MtbHLH25基因和启动子,该基因总长882 bp,共编码293个氨基酸。启动子序列分析发现其包含了ABA、MeJA、GA和SA等响应元件。(2)进化树结果表明MtbHLH25蛋白与蚕豆和长柔毛野豌豆中bHLH蛋白高度同源。(3)亚细胞定位结果显示MtbHLH25蛋白定位于细胞核。(4)酵母自激活检测结果显示MtbHLH25蛋白具有自激活活性。(5)表达分析结果显示,MtbHLH25在蒺藜苜蓿根、茎、叶、花和果实中均有表达,其中在根中表达水平最高;外源SA、MeJA、ABA、GA以及盐胁迫使MtbHLH25基因表达量都呈下降趋势,推测SA、MeJA、ABA、GA以及盐胁迫对MtbHLH25基因的表达起到负调控作用。干旱胁迫能够显著诱导MtbHLH25基因表达量的上升,说明该转录因子可能在干旱胁迫中起到正调控作用。【结论】MtbHLH25基因可能对盐胁迫敏感,在干旱胁迫中可能发挥正调控作用。此外,MtbHLH25蛋白具有自激活活性,对下游启动子调控的报告基因可能具有激活作用。 相似文献
5.
胁迫应答基因的转录激活是细胞应答胁迫作用的关键步骤。转录激活因子与启动子顺式作用元件结合是胁迫应答基因转录激活的关键环节。进化保守的Gal4是半乳糖代谢相关基因的转录激活因子。酵母Gal4通过其N端的DNA结合结构域识别并结合启动子UAS,通过其C端的激活结构域与转录因子作用,起始RNA聚合酶Ⅱ复合体的组装和转录。该过程不仅受转录调控因子Gal80和Gal3的调节,还与Gal4二聚体的形成有关。概述了酵母半乳糖代谢相关基因转录激活因子Gal4的研究进展。 相似文献
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利用荧光蛋白研究产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子 总被引:2,自引:0,他引:2
[目的]克隆产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD的启动子(PCggpd),并通过报告基因gfp的差异表达来研究葡萄糖浓度对PCggpd在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的诱导特性.[方法]采用PCR扩增的方法分别从产甘油假丝酵母基因组和pCAMBIA1302载体中克隆出CgGPD的启动序列PCggpd和绿色荧光蛋白基因gfp.将两个基因同时构建到酿酒酵母表达载体pYX212-zeocin中,构建时将绿色荧光蛋白基因gfp置于CgGPD的启动序列下游,获得重组质粒pYX212-zeocin-PCggpd-gfp.通过电击转化酿酒酵母W303-lA.将重组酿酒酵母S.cerevisiae W303-1A-GFP置于不同葡萄糖浓度培养基中进行培养,利用荧光显微技术对其进行荧光检测.[结果]重组酿酒酵母能产生稳定的荧光,当葡萄糖浓度为2%时,重组酿酒酵母在YEPD培养基中产生较弱的荧光,随着葡萄糖浓度的升高,荧光强度有明显的增强.[结论]PCggpd属于环境胁迫诱导型启动子,高浓度的葡萄糖能诱导PCggpd启动绿色荧光蛋白的高水平表达,这对完善产甘油假丝酵母的遗传背景研究,阐明其高产甘油的机理具有重要意义. 相似文献
7.
为揭示小黑杨(Populus simonii×P. nigra)在面对非生物胁迫时,转录因子PsnbZIP1在植物体内发挥的功能,以小黑杨为试验材料,克隆得到PsnbZIP1的ORF区序列长为432 bp,并初步分析PsnbZIP1盐胁迫下的分子机制。采用q-PCR分析PsnbZIP1在150 mmol·L-1 NaCl处理小黑杨组培苗时的表达模式,发现该基因的表达量快速上升;通过生物信息学分析预测PsnbZIP1转录因子为无跨膜结构且具有信号肽的亲水性不稳定蛋白;用农杆菌(Agrobacterium)介导的烟草(Nicotiana)瞬时表达观察该基因的亚细胞定位情况,结果表明该基因为核定位蛋白;用酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内不具有转录激活功能。对PsnbZIP1基因的启动子序列进行分析,结果表明该启动子包含了生长素应答、脱落酸应答元件、光应答元件以及种子特异性调控的顺式作用调控元件,该基因可能在植物的生长发育与响应胁迫过程中发挥了重要作用;启动子还包括参与干旱诱导的MYB结合位点和MYBHv1结合位点,表明该基因有可能与一些干旱诱导相关MYB基因... 相似文献
8.
为了解龙眼DCL基因的功能,该试验对龙眼基因组数据提取的DlDCL1、DlDCL2、DlDCL3和DlDCL4基因序列进行启动子顺式作用元件及其受miRNA调控的分析;并以龙眼胚性愈伤组织为材料,研究了DlDCLs不同基因成员在非生物胁迫和外源激素处理下的表达情况。结果显示:(1)龙眼DCL基因启动子中除了TATA和CAAT外,还具有大量的光反应元件、激素应答元件、胁迫响应元件、组织特异性调控元件及植物生长发育相关的顺式调控元件,提示龙眼DCL基因启动子转录活性可能受到光、激素信号及逆境胁迫因素的诱导。(2)对调控龙眼DCL基因的miRNA进行筛选,结果显示DlDCL1受miR162和miR1024调控,DlDCL4受miR390和miR396调控。(3)实时荧光定量PCR显示,在一定浓度范围内,外源激素GA3、ABA和ETH均能下调DlDCLs基因的表达,而高浓度ETH处理则显著上调DlDCLs的表达。(4)高浓度蔗糖(6%)处理时DlDCL2、DlDCL3和DlDCL4显著上调表达,而低浓度(0.1%)处理时DlDCL1显著上调表达;不同温度处理下,DlDCL1在34℃时显著上升,DlDCL3随着温度的提高相对表达量逐渐减低;而DlDCL2和DlDCL4表达量差异不明显;NaCl胁迫处理下,DlDCLs在1h处理时表达量下调,但在其他不同时间点则上调表达。研究表明,龙眼DCL基因在外源激素及非生物胁迫处理下,并非是简单的一对一响应,而是存在较为复杂的响应机制。 相似文献
9.
【目的】本研究致力于构建一种能够在家蚕Bombyx mori细胞水平稳定表达的简单基础启动子,从而更准确地反映单一转录调控元件对基因启动子活性的影响,为研究家蚕乃至其他昆虫的基因转录调控奠定基础。【方法】本研究在本课题组已报道的能在家蚕细胞中稳定表达且基本不含上游转录调控元件的BmVgP78M启动子的基础上,通过PCR技术在其上游添加一定长度的间隔序列和能够应答20-羟基蜕皮激素(20E)且增强启动子活性的BrC-Z2转录因子结合基序(BrC-Z2 element, BrC-Z2E);通过基因克隆技术构建细胞转染载体;通过细胞转染技术和双荧光素酶报告基因系统检测启动子活性的变化。【结果】通过在BmVgP78M启动子上游添加28 bp间隔序列,成功构建了一个简单基础启动子,命名为VgP78ML,并证明其为可用于研究目标转录调控元件的简单基础启动子。经实验验证表明,该简单基础启动子不仅可以在家蚕细胞中稳定表达,且其本身活性不受20E及转录因子BrC-Z2的影响;当该启动子上游连接BrC-Z2E时,可以显著地应答20E及BrC-Z2转录因子,从而调控报告基因的表达。【结论】VgP78ML能够作为简单基础启动子应用于细胞水平对家蚕基因转录调控进行研究。同时,其构建方法也为其他物种构建研究转录调控的简单基础启动子提供了参考。 相似文献
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【背景】CrgA是三孢布拉霉(Blakesleatrispora,Bt)中调控类胡萝卜素合成的关键负调控因子,其表达水平会影响类胡萝卜素的合成。【目的】克隆三孢布拉霉crgA启动子并分析其活性,为进一步解析CrgA表达调控机制奠定基础。【方法】通过综合微生物基因组(integrated microbial genomes, IMG)数据库提供的基因组序列,克隆crgA翻译起始位点上游2 000 bp序列,分析其顺式调控元件和转录起始区域预测,通过RT-qPCR分析不同光照时间对三孢布拉霉crgA相对转录水平的影响;构建4个不同长度的crgA启动子截短序列驱动的GUS-mGFP5重组表达载体p1303-procrgAF、F1、F2和F3,利用农杆菌侵染整合到三孢布拉霉基因组中,在黑暗和光照条件下测定β-D-葡萄糖苷酸酶(β-D-glucuronidase,GUS)酶活性并观察荧光信号。【结果】crgA启动子不仅包含基础的TATA-box和CAAT-box元件,还包括多个与光响应相关的元件。观察荧光结果显示CaMV35S和构建的4个突变启动子均能在三孢布拉霉体内驱动下游基因表达,检测GUS... 相似文献