沙葱萤叶甲表皮蛋白基因的鉴定及表达谱分析

【目的】表皮蛋白是昆虫体壁的主要组成部分,在昆虫生长发育中起着重要的作用。本研究旨在鉴定沙葱萤叶甲Galeruca daurica表皮蛋白基因,分析其表达模式,以期为进一步研究其在沙葱萤叶甲生长发育中的作用提供必要的基础。【方法】根据本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用生物信息学方法鉴定表皮蛋白基因全长开放阅读框(ORF);采用RT-qPCR技术测定鉴定的8个表皮蛋白基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和3龄幼虫不同组织(头部、体壁、消化道和脂肪体)中的表达谱。【结果】基于转录组数据鉴定到8条沙葱萤叶甲表皮蛋白基因的开放阅读框(ORF)全长序列,命名为GdauCP1-8(GenBank登录号:MN629000-MN629007),ORF长417～810 bp,编码138～269个氨基酸,预测分子量为15～28 kD,等电点pI为4.45～8.62;具有16～20个氨基酸的信号肽;GdauCP1具有典型的跨膜结构,其余7个GdauCP蛋白无跨膜结构。同源序列比对和系统发育分析表明,GdauCP3与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata CP的氨基酸序列一致性最高,为60.00%;其余的GdauCPs与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera CP的氨基酸序列一致性最高,为58.52%～80.00%。GdauCP1-4属于RR-2亚家族,GdauCP5-7属于RR-1亚家族,GdauCP8的亚家族归属未确定。RT-qPCR分析表明,8个GdauCP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段及3龄幼虫不同组织内均有表达,且表达量存在显著差异。GdauCP2,GdauCP4,GdauCP5和GdauCP6在1龄幼虫期高表达,GdauCP3,GdauCP7和GdauCP8在蛹期高表达,GdauCP1在3龄第3天幼虫期高表达;除GdauCP2在成虫中表达水平较高外,其他GdauCP基因在成虫中的表达水平均很低。GdauCP1在头部和体壁中高表达,GdauCP2和GdauCP8在脂肪体中高表达,GdauCP3,GdauCP4,GdauCP6和GdauCP7在消化道中高表达,而GdauCP5在体壁中高表达。【结论】8个GdauCP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和组织间差异表达,且表达模式不同,意味着不同GdauCP可能具有不同的功能。     

沙葱萤叶甲表皮蛋白基因的鉴定及表达谱分析

【目的】表皮蛋白是昆虫体壁的主要组成部分,在昆虫生长发育中起着重要的作用。本研究旨在鉴定沙葱萤叶甲Galeruca daurica表皮蛋白基因,分析其表达模式,以期为进一步研究其在沙葱萤叶甲生长发育中的作用提供必要的基础。【方法】根据本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用生物信息学方法鉴定表皮蛋白基因全长开放阅读框(ORF);采用RT-qPCR技术测定鉴定的8个表皮蛋白基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和3龄幼虫不同组织(头部、体壁、消化道和脂肪体)中的表达谱。【结果】基于转录组数据鉴定到8条沙葱萤叶甲表皮蛋白基因的开放阅读框(ORF)全长序列,命名为GdauCP1-8(GenBank登录号: MN629000-MN629007),ORF长417~810 bp,编码138~269个氨基酸,预测分子量为15~28 kD,等电点pI为4.45~8.62;具有16~20个氨基酸的信号肽;GdauCP1具有典型的跨膜结构,其余7个GdauCP蛋白无跨膜结构。同源序列比对和系统发育分析表明,GdauCP3与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata CP的氨基酸序列一致性最高,为60.00%;其余的GdauCPs与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera CP的氨基酸序列一致性最高,为58.52%~80.00%。GdauCP1-4属于RR-2亚家族,GdauCP5-7属于RR-1亚家族,GdauCP8的亚家族归属未确定。RT-qPCR分析表明,8个GdauCP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段及3龄幼虫不同组织内均有表达,且表达量存在显著差异。GdauCP2, GdauCP4, GdauCP5和GdauCP6在1龄幼虫期高表达,GdauCP3, GdauCP7和GdauCP8在蛹期高表达,GdauCP1在3龄第3天幼虫期高表达;除GdauCP2在成虫中表达水平较高外,其他GdauCP基因在成虫中的表达水平均很低。GdauCP1在头部和体壁中高表达,GdauCP2和GdauCP8在脂肪体中高表达,GdauCP3, GdauCP4, GdauCP6和GdauCP7在消化道中高表达,而GdauCP5在体壁中高表达。【结论】8个GdauCP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和组织间差异表达,且表达模式不同,意味着不同GdauCP可能具有不同的功能。     

暗黑鳃金龟UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因的克隆、原核表达及功能分析

【目的】本研究旨在阐明暗黑鳃金龟Holotrichia parallela UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因HpUAP的序列特征和功能。【方法】通过PCR方法从暗黑鳃金龟2龄幼虫中扩增HpUAP全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;构建pET30a-HpUAP重组表达载体,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达;利用qRT-PCR检测HpUAP在暗黑鳃金龟幼虫不同发育阶段(1-3龄幼虫)和3龄第2天幼虫不同组织(体壁、中肠、直肠、回肠、马氏管和脂肪体)中的表达量。利用RNAi沉默暗黑鳃金龟2龄幼虫体内HpUAP基因后,观察其生长发育和存活情况,并测定RNAi 72 h后其HpUAP表达量和体壁几丁质含量。【结果】PCR扩增获得暗黑鳃金龟HpUAP 全长cDNA序列(GenBank登录号: MW676788),开放阅读框长1 461 bp,编码486个氨基酸残基,蛋白分子量约为53.9 kD。系统进化分析发现HpUAP与似牛嗡蜣螂Onthophagus taurinus UAP的氨基酸序列以较高的置信度聚为一个分支。经IPTG诱导可表达53.9 kD的HpUAP蛋白,与预期大小一致。发育表达谱结果表明HpUAP在1龄第1天和3龄第1天暗黑鳃金龟幼虫中表达量较高,组织表达谱结果表明HpUAP在暗黑鳃金龟3龄第2天幼虫中肠和体壁中表达量较高。HpUAP RNAi导致暗黑鳃金龟2龄幼虫生长与行动缓慢,体表颜色加深并皱缩;RNAi处理72 h后,与对照组（dsGFP注射组）相比,dsHpUAP注射组HpUAP表达量下降了93.06%,死亡率增加了40%左右,表皮几丁质含量下降了约29%。【结论】结果说明HpUAP参与几丁质代谢,在暗黑鳃金龟幼虫的生长发育过程中起关键作用。     

柞蚕蛹解除滞育过程中海藻糖合成酶基因的表达变化

【目的】克隆柞蚕Antheraea pernyi海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)基因,并对其进行组织表达分析,探讨该基因在柞蚕滞育蛹解除滞育过程中的表达规律,为阐明柞蚕滞育期间碳水化合物代谢规律与蛹滞育解除的关系提供数据支持。【方法】利用PCR及3'RACE技术从柞蚕幼虫脂肪体组织中克隆得到TPS基因,并进行生物信息学分析;RT-PCR检测该基因在柞蚕幼虫各组织中的表达分布,进一步采用Real-time PCR分析柞蚕滞育蛹解除滞育过程中该基因在脂肪体组织和血淋巴中的表达量变化。【结果】克隆获得柞蚕海藻糖合成酶基因并命名为ApTPS。其开放阅读框长2 487 bp,编码828个氨基酸,蛋白预测分子量为93.19 k D,等电点(p I)4.61;无信号肽,无跨膜区。蛋白质亚细胞定位预测该蛋白定位于细胞质中;蛋白质结构域分析表明,ApTPS有两个保守功能区:TPS(第22-497位氨基酸)和TPP(第532-772位氨基酸)。组织特异性分析表明,ApTPS基因在柞蚕幼虫脂肪体中表达量最高;柞蚕解除滞育过程中,ApTPS在脂肪体和血淋巴中的表达量均有所升高,且显著高于对照组(P0.05),但血淋巴中表达量的升高滞后于脂肪体。【结论】结果提示ApTPS参与了柞蚕蛹滞育中碳水化合物代谢调控并在其中发挥重要作用,与柞蚕蛹滞育解除关系密切。     

蜂巢小甲虫气味结合蛋白基因AtOBP1的分子特性及功能研究

【目的】本研究旨在明确蜂巢小甲虫Aethina tumida气味结合蛋白1(odorant binding protein 1, OBP1)的表达模式,分析AtOBP1在蜂巢小甲虫嗅觉识别中的作用。【方法】基于蜂巢小甲虫转录组和基因组数据库扩增AtOBP1的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;利用RT-qPCR检测该基因在蜂巢小甲虫不同发育阶段(卵、幼虫、蛹和雌雄成虫)、羽化后第7天成虫不同组织(头、表皮、翅、足、脂肪体、肠道、马氏管、精巢和卵巢)以及羽化后不同日龄成虫头部的表达量;采用RNA干扰技术和Y型管行为选择实验,解析AtOBP1在蜂巢小甲虫嗅觉识别中的生物学功能。【结果】AtOBP1基因(GenBank登录号：MT211982.1)的cDNA全长序列包含6个外显子,其开放阅读框(ORF)长447 bp,编码148个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.9 kD和4.73,具有PBP＿GOBP亚家族的保守结构域;AtOBP1蛋白是由6个α螺旋组成的二聚体,且有6个保守的半胱氨酸形成3个二硫键;系统发育进化树显示该蛋白与鞘翅目(Coleoptera)黄粉虫Tenebrio...     

桃蛀螟CYP6AE76基因参与对Cry1Ab蛋白的解毒作用

【目的】明确桃蛀螟Conogethes punctiferalis幼虫取食Cry1Ab蛋白后体内CYP6AE76的过表达及对Cry1Ab蛋白有解毒作用。【方法】分析桃蛀螟CYP6AE76序列特征;利用RT-qPCR检测CYP6AE76在不同发育阶段(1-5龄幼虫)和4龄幼虫不同组织(头、中肠、血淋巴和脂肪体)以及4龄幼虫取食含有Cry1Ab蛋白(LC₅₀=1.08 ng/cm2)的人工饲料3 d存活的幼虫中肠和血淋巴中的表达量;利用RNAi饲喂法沉默桃蛀螟4 龄幼虫CYP6AE76后检测中肠中CYP6AE76的表达量,并统计120 h后幼虫体重并计算幼虫存活率;利用RNAi饲喂法沉默桃蛀螟初孵幼虫CYP6AE76后饲喂含1.08 ng/cm² Cry1Ab蛋白的饲料,7 d后统计幼虫体重并计算幼虫存活率。【结果】桃蛀螟CYP6AE76基因开放阅读框长1 572 bp,编码524个氨基酸,分子量约为60.34 kD,属于CYP6家族基因。发育表达谱结果表明, CYP6AE76基因在桃蛀螟整个幼虫阶段均有表达且在1龄幼虫期表达量最高,随着幼虫龄期增大而表达量降低;组织表达谱结果表明,CYP6AE76在4龄幼虫中肠中表达量最高。4龄幼虫取食含有Cry1Ab蛋白(1.08 ng/cm²)的人工饲料后,CYP6AE76在中肠和血淋巴中的表达量相比对照显著上调。通过RNAi沉默CYP6AE76后,桃蛀螟初孵幼虫再取食含有Cry1Ab蛋白的人工饲料后体重显著降低。【结论】CYP6AE76可能参与对桃蛀螟幼虫摄入的Cry1Ab蛋白的解毒。     

棉铃虫酪氨酸羟化酶基因的分子特性及功能分析

【目的】酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)是黑色素形成的关键酶,在昆虫表皮骨化过程中扮演重要角色。本研究旨在获得棉铃虫Helicoverpa armigera TH基因序列,并研究其分子特性、表达模式和功能,为更深入探析该基因作用机理奠定基础。【方法】通过生物信息学和分子生物学技术获得了棉铃虫TH基因序列,利用qRT-PCR分析该基因在棉铃虫不同生长发育阶段的表达模式;利用qRT-PCR技术,分别测定了蜕皮激素20E(400 ng/头)处理不同时间和RNAi成功干扰蜕皮激素受体基因(EcR)前提下再用20E(400 ng/头)处理后,棉铃虫5龄幼虫TH表达量变化;采用生物化学方法检测鞣化激素(30 μg/mg组织)和环腺苷酸(cAMP, 200 ng/mg 组织)处理后棉铃虫幼虫脂肪体中TH活性。【结果】获得了棉铃虫酪氨酸羟化酶基因TH (GenBank登录号: MF440319) cDNA片段,长2 270 bp,开放阅读框1 686 bp,编码561个氨基酸残基。该基因在棉铃虫整个发育期均表达,其中在卵期第3天、2龄幼虫第1天、3-5龄蜕皮期、预蛹期和成虫羽化第1天表达量相对较高。研究还发现,400 ng/头 20E注射能够促进TH的转录;在成功干扰并调低幼虫EcR转录水平的前提条件下(对照仅注射dsGFP)再注射20E,对TH表达量无明显影响;而鞣化激素(30 μg/mg组织)和cAMP(200 ng/mg组织)均显著提高了TH的酶活性。【结论】20E在转录水平参与了TH的表达;鞣化激素和cAMP均能够提高TH活性,在蛋白水平上对TH进行调控。     

光滑鳖甲肽聚糖识别蛋白ApPGRP的表达与功能分析

【目的】旨在研究光滑鳖甲Anatolica polita肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)基因ApPGRP表达模式及其对下游免疫相关基因的表达调控,以及重组蛋白ApPGRP与细菌的结合能力。【方法】构建原核表达载体pET-28a-ApPGRP,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),诱导表达并纯化重组蛋白His-ApPGRP,分别测定其与金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和肽聚糖(peptidoglycan, PGN)的结合能力。金黄色葡萄球菌S.aureus刺激后,利用qRT-PCR检测光滑鳖甲6龄幼虫体内ApPGRP、抗菌肽基因ApAttacin2和ApAttacin1、防御素基因ApDefensin、丝氨酸蛋白酶基因ApSP和丝氨酸蛋白酶抑制剂基因ApSerpin等免疫相关基因的表达水平;采用RNAi技术沉默光滑鳖甲6龄幼虫体内ApPGRP基因的表达,并利用qRT-PCR分别检测RNAi处理以及RNAi后再用S.aureus刺激时幼虫体内上述基因的表达水平变化。【结果】通过原核表达获得了重组蛋白His-ApPGRP,其具有结合金黄色葡萄球菌和肽聚糖的能力。注射金黄色葡萄球菌后,检测的光滑鳖甲6龄幼虫免疫相关基因(ApSP除外)的表达都显著上调;RNAi沉默光滑鳖甲6龄幼虫ApPGRP后,其他免疫相关基因表达量均显著降低,其响应金黄色葡萄球菌刺激后的表达量也显著低于对照组。【结论】这些结果表明,ApPGRP在光滑鳖甲免疫防御中起着识别外源微生物,激活信号通路并调控抗菌肽表达的作用。     

烟蚜热激蛋白基因MpHsp70的克隆及在UV-B胁迫下的表达分析

【目的】为探讨烟蚜Myzus persicae适应UV-B胁迫的分子机制。【方法】采用RT-PCR和RACE技术克隆了烟蚜热激蛋白基因Hsp70的全长,利用生物信息学方法分析了其特征;采用实时荧光定量PCR检测了不同时长(0,15,30,60,90和120 min) UV-B胁迫下烟蚜成虫中该基因的相对表达量。【结果】克隆获得烟蚜Hsp70基因并命名为MpHsp70(GenBank登录号:MF509827),该基因全长为2 221 bp,开放阅读框(ORF) 1 965 bp,编码654个氨基酸,蛋白相对分子量为71. 41kD,等电点(p I)为5. 34,末端高度保守序列EEVD显示该蛋白属于胞质热激蛋白。系统进化关系分析表明,MpHsp70与多种昆虫的Hsp70的同源性较高,表现出Hsp70基因的高度保守性。实时荧光定量PCR分析表明,随着UV-B照射时间的延长,烟蚜成虫体内MpHsp70基因的表达量先上升后下降,当照射时间为30 min时表达量最大。【结论】烟蚜MpHsp70基因可以响应UV-B的胁迫,它可能在烟蚜适应UV-B胁迫过程中起到重要作用。     

烟草甲谷胱甘肽S-转移酶基因LsGSTe1的表达及其与甲酸乙酯耐受性的关系

【目的】探究烟草甲Lasioderma serricorne谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)基因LsGSTe1的分子特性和生物学功能。【方法】在烟草甲转录组数据的基础上,利用RT-PCR技术扩增LsGSTe1基因,并进行生物信息学分析;采用qPCR技术检测LsGSTe1在烟草甲不同发育阶段(低龄幼虫、高龄幼虫、蛹、低龄成虫、高龄成虫)及高龄幼虫不同组织(表皮、中肠、脂肪体、马氏管)中的表达水平,以及在甲酸乙酯熏蒸胁迫后的5龄幼虫中的表达变化。进一步采用RNAi技术沉默烟草甲5龄幼虫LsGSTe1基因,通过生物测定分析烟草甲对熏蒸剂甲酸乙酯的敏感性变化。【结果】获得LsGSTe1基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:MN480468),开放阅读框长684 bp,编码227个氨基酸,N端和C端均存在催化保守位点。系统发育分析表明该基因属于GSTs的Epsilon家族。qPCR结果表明,LsGSTe1在烟草甲不同发育阶段均有表达,且在高龄幼虫期的表达量较高;表达部位主要在幼虫脂肪体,其次为中肠和表皮,而在马氏管中的表达量最低。LC_(30)(10μL/L)和LC_(50)(20μL/L)浓度的甲酸乙酯对烟草甲5龄幼虫熏蒸胁迫后,LsGSTe1的表达水平显著升高,分别是对照组的2.96和5.80倍。RNAi结果发现,RNAi 48 h和72 h后,LsGSTe1的表达量分别下降了79.9%和83.0%,沉默效率显著;RNAi 72 h后,dsLsGSTe1注射组与对照(dsGFP组)相比,LC_(50)浓度的甲酸乙酯处理5龄幼虫的死亡率明显提高了32.4%。【结论】推测LsGSTe1基因可能参与了烟草甲对甲酸乙酯的代谢与解毒过程。     

小菜蛾中肠Polycalin蛋白的基因克隆、表达及与Cry1Ac毒素的结合特性分析

【目的】Polycalin蛋白是一种新发现的Bt毒素受体,可能与昆虫对Bt的抗性有关。本研究旨在明确小菜蛾Plutella xylostella Polycalin蛋白与Bt Cry1Ac毒素的关系。【方法】本研究通过PCR结合RACE技术从小菜蛾3龄幼虫中肠克隆获得Polycalin蛋白基因的全长cDNA序列,采用实时定量PCR技术研究Polycalin蛋白在小菜蛾不同发育阶段、4龄幼虫不同组织及用不同浓度Cry1Ac毒素饲喂3龄幼虫后的表达量。提取小菜蛾幼虫中肠的刷状缘膜囊泡(BBMV),运用合成多肽的方法制备Polycalin蛋白抗体,利用Western blot和Ligand blot技术对小菜蛾Polycalin蛋白进行鉴定,分析其与Cry1Ac毒素的结合特性。【结果】克隆得到的小菜蛾Polycalin蛋白基因的cDNA序列全长为9 102 bp(GenBank登录号:MF138149),其中,开放阅读框为8 778 bp,编码2 925个氨基酸;预测蛋白质分子量为326.38 kD,等电点为4.39;在推导的氨基酸序列中,前20个氨基酸为N-末端信号肽序列,含有14个N-糖基化位点,67个O-糖基化位点,6个脂质运载蛋白特征序列,6个脂质运载蛋白位点和13个类脂质运载蛋白结构域,并且在第20和21位(TSG-QVV)氨基酸之间存在一个裂解位点,在C-末端存在2个GPI结合位点,具有Bt毒素受体的特征。该蛋白在幼虫期的表达量较高,尤其在3龄幼虫体内表达量最高,在蛹和成虫中的表达量最低;在4龄幼虫的头、胸、腹中均有表达,在幼虫腹部中的表达量最高;3龄幼虫取食不同浓度的Cry1Ac毒素后,Polycalin蛋白的表达量下降,且Cry1Ac毒素浓度越高,下降越明显。通过Western blot检测到小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)上存在大约300 kD的Polycalin蛋白条带;Ligand blot实验证明了小菜蛾Polycalin蛋白能与Cry1Ac毒素结合。【结论】本研究首次初步明确了小菜蛾Polycalin蛋白具有与Bt毒素结合的特性,为研究Bt对昆虫的作用机理和利用Bt防治害虫提供一定的理论基础和参考价值。     

南亚实蝇鞣化激素基因的克隆与表达分析

【目的】克隆南亚实蝇Zeugodacus tau鞣化激素基因,分析其分子特征及时空表达模式,为探索其生理功能奠定基础。【方法】利用同源克隆和RACE技术从南亚实蝇刚羽化成虫中克隆鞣化激素基因bursicon-α和bursicon-β的全长cDNA序列,并用邻接法(neighbor-joining method)与其他昆虫同源序列构建系统发育进化树。利用荧光定量PCR技术检测这两个基因在南亚实蝇不同发育阶段(卵、1-3龄幼虫、预蛹、蛹和刚羽化成虫)的表达特性。【结果】克隆获得南亚实蝇鞣化激素基因bursicon-α(GenBank登录号:MH421861)和bursicon-β(GenBank登录号:MH421862)。bursicon-α基因开放阅读框为551 bp,编码183个氨基酸;bursicon-β基因开放阅读框为467 bp,编码156个氨基酸。基于两个鞣化激素基因的氨基酸序列的系统发育树分析显示,南亚实蝇Bursicon-α与Bursicon-β均与瓜实蝇Zeugodacus cucurbitae的同源蛋白亲缘关系最近,且与其他双翅目昆虫的同源蛋白聚为一类,形成独立的分支。荧光定量PCR结果表明,两个基因在南亚实蝇各龄期均有表达,均在第5天蛹和刚羽化成虫翅伸展时期表达量最高。【结论】bursicon-α和bursicon-β基因在南亚实蝇不同发育阶段表达量不同,推测其在南亚实蝇成虫表皮鞣化和翅的形成中发挥着重要作用。本研究为进一步探索鞣化激素在南亚实蝇生长过程中表皮的骨化、翅的重建等方面的功能机制奠定了基础。     

大豆食心虫储存蛋白hexamerin基因的克隆与表达分析

【目的】储存蛋白是昆虫发育、变态和生殖过程中氨基酸的主要来源,Hexamerin是储存蛋白家族重要成员,在昆虫的生长发育中起着重要作用。为了研究hexamerin基因(SpbHex)在大豆食心虫Leguminivora glycinivorella Matsumurav生长发育过程中的作用,对大豆食心虫SpbHex基因进行克隆与表达分析。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆SpbHex的cDNA全长序列,并通过qPCR研究其在不同发育阶段和幼虫不同组织的表达情况。【结果】SpbHex基因cDNA序列全长2 161 bp,其中开放阅读框2 112 bp,编码703个氨基酸。蛋白预测分子量84.15 ku。hexamerin基因在大豆食心虫不同发育阶段和不同组织中均有表达。在不同生长发育阶段中4龄幼虫的表达量较高,1龄和成虫的表达量较低;在不同组织中脂肪体的表达量较高,表皮中的表达量最低。【结论】本研究克隆了大豆食心虫储存蛋白hexamerin基因,并对其在大豆食心虫中表达模式进行分析,为进一步明确hexamerin基因在大豆食心虫生长发育中的作用奠定基础。     

莱茵衣藻E2泛素结合酶CrUBC23调控油脂积累

【目的】为研究莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzymes,E2)CrUBC23在莱茵衣藻油脂代谢中的作用,为高产油微藻基因工程改良和揭示藻类油脂合成及代谢调控机理奠定基础。【方法】qRT-PCR分析莱茵衣藻在低氮、低磷胁迫下泛素结合酶CrUBC23表达情况;克隆CrUBC23同源基因干涉片段和全长基因,构建RNAi干涉载体和过量表达载体,转化莱茵衣藻并检测生物量和油脂含量;构建CrUBC23-GFP融合表达载体,用农杆菌浸染洋葱表皮细胞进行亚细胞定位。【结果】莱茵衣藻在低氮、低磷胁迫下CrUBC23基因表达量显著增加,增加幅度分别为正常培养的4.98–5.80倍和1.85–5.20倍。RNAi干扰结果显示,转基因藻细胞中性脂含量降低5.5%,总脂含量降低3.16%–17.6%。过量表达结果显示,转基因藻细胞中性脂含量增加8.8%,总脂含量增加4.51%–14.03%。【结论】CrUBC23正向调控莱茵衣藻油脂代谢,该基因定位于细胞核。     

棉铃虫HaTO-like基因的克隆、序列分析和表达特征

【目的】克隆和分析了棉铃虫Helicoverpa armigera HaTO-like基因的编码框序列,检测了该基因的时空表达谱以及在棉铃虫感染核型多角体病毒HaSNPV后的转录变化,为深入研究该基因的功能提供理论依据。【方法】本研究利用RT-PCR的方法首次克隆获得HaTO-like基因的全长cDNA序列,通过几种生物信息学软件对该基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析,并利用荧光定量PCR技术检测了该基因在棉铃虫不同发育阶段、幼虫组织和成虫组织的表达情况,以及HaSNPV感染对HaTO-like基因表达的影响。【结果】棉铃虫HaTO-like基因cDNA全长为994 bp,开放阅读框为756 bp,编码251个氨基酸,其蛋白序列的N端含有23个氨基酸的信号肽。进一步的序列分析表明棉铃虫HaTO-like与其他昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性不是太高,大概在39%~61%之间,其中与家蚕和脐橙螟在系统进化上关系最近。荧光定量PCR结果表明该基因在棉铃虫的5龄0 h和成虫第1天的的表达量相对较高,在幼虫的头部和表皮内的表达量较其他幼虫组织较高,在成虫的头部和足的表达量也相对较高。而病毒感染则显著地诱导了该基因在棉铃虫幼虫头部和表皮内的表达。【讨论】本研究克隆了棉铃虫HaTO-like基因的全长cDNA序列,分析了该基因的序列特征和表达谱,为进一步阐释该基因的功能奠定理论基础。     

松墨天牛表皮蛋白基因的克隆及表达分析

【目的】本研究旨在探索松墨天牛Monochamus alternatus Hope中昆虫表皮蛋白（ICP）基因在幼虫各组织中和不同发育阶段的时空表达模式。【方法】用cDNA末端快速扩增方法(rapid amplification of cDNA ends, RACE) 克隆了松墨天牛表皮蛋白基因,用实时荧光定量PCR分析了该基因在幼虫体内和不同虫态中的表达。【结果】克隆获得的松墨天牛幼虫表皮蛋白基命名为MoalICP（GenBank 登录号：AGX00998.1）,开放阅读框长408 bp,编码135个氨基酸,推测得到的蛋白的分子量为14.51 kDa。由MoalICP推导的蛋白与桑天牛Apriona germari ICP (AAM66718.1)氨基酸序列一致性为79%;与丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis ICP (NP_001161297.1)、果蝇Drosophila mojavensis ICP (XP_002005461.1)、玉带凤蝶Papilio polytes ICP (BAM18876.1)等19种昆虫表皮蛋白的氨基酸序列一致性在35%~45%之间;在第10-26位氨基酸位处含有一个跨膜片段。MoalICP在幼虫头、体壁、脂肪体、血细胞、中肠和马氏管均有表达;在蛹和成虫中的表达量分别是在幼虫中的44%和161%。【结论】MoalICP与其他昆虫有较高的氨基酸序列一致性。MoalICP在松墨天牛幼虫内广泛表达;在各个发育阶段中,以成虫中的表达量最高。本文为进一步研究松墨天牛表皮蛋白基因的生理功能和松墨天牛的表皮化学奠定基础。     

基于转录组的葱蝇表皮蛋白基因家族的鉴定及在非滞育和冬滞育条件下的表达分析

【目的】昆虫表皮蛋白在昆虫的生长发育、抑制水分蒸发和抵御其他外界不良环境等方面起到重要的作用。通过转录组水平上葱蝇Delia antiqua表皮蛋白基因家族的鉴定及部分基因在非滞育和冬滞育条件下的表达规律分析,为进一步研究葱蝇表皮蛋白在滞育期的抗逆功能奠定基础。【方法】基于转录组数据,通过生物信息学方法对葱蝇表皮蛋白基因进行鉴定分析,系统进化和保守结构域分析并采用实时荧光定量PCR法比较分析了12个基因在葱蝇非滞育和冬滞育不同发育时期的表达变化。【结果】在葱蝇中鉴定出81个表皮蛋白基因,分别属于RR(71个基因)、CPAP(5个基因)和CPLC(5个基因)亚家族,其编码的蛋白质含有92~495个氨基酸,分子量约为8.692~52.2 k D,等电点为3.90~9.93。亚细胞定位预测结果显示67个全长表皮蛋白均为外分泌型。12个葱蝇表皮基因在非滞育和冬滞育过程中有明显不同的表达规律。【结论】葱蝇表皮蛋白基因RR-2型的保守基序中发生了基因突变,引起关键氨基酸的替换,这可能暗示它们在非滞育和滞育不同条件下,不同发育阶段中蛹皮结构重建和某些器官的发生方面发挥不同作用。该研究结果为进一步阐明葱蝇滞育蛹皮结构及抗逆功能的研究提供了重要理论基础。     

柞蚕14-3-3基因的鉴定及表达分析

14-3-3蛋白是一种可以改变其结合蛋白构象的酸性蛋白质.柞蚕14-3-3 cDNA序列全长1 220 bp,包括一个126 bp的5'非编码区和一个350 bp的3'非编码区.该基因的开放读码框长度为744 bp,编码247个氨基酸.序列比对结果表明,柞蚕14-3-3蛋白与家蚕的14-3-3蛋白具有高度同源性.此外对柞蚕14-3-3基因进行了原核表达和重组蛋白纯化.SDS-PAGE和免疫印迹结果表明,分子量大小约32 kD的重组蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.     

柞蚕Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂ApKTSPI基因克隆及表达特征分析

【目的】克隆柞蚕(Antheraea pernyi)Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂(ApKTSPI)基因的cDNA序列并进行序列分析,研究ApKTSPI基因的组织表达分布及病原物免疫刺激后的表达模式,原核表达ApKTSPI。【方法】利用RACE-PCR方法扩增柞蚕ApKTSPI基因全长cDNA,生物信息学软件进行序列分析,利用实时定量PCR检测柞蚕ApKTSPI基因的组织分布及免疫刺激后的表达模式,利用pET-28a载体在大肠杆菌BL21中融合表达ApKTSPI。【结果】柞蚕ApKTSPI基因的cDNA全长568 bp,开放阅读框编码96个氨基酸,含一个Kazal结构域。ApKTSPI基因在柞蚕5龄幼虫脂肪体中特异性高表达,在核型多角体病毒、大肠杆菌和白僵菌免疫刺激后表达量都能上调,但上调的程度和时间都不同。ApKTSPI在大肠杆菌中成功诱导表达。【结论】获得了柞蚕ApKTSPI基因的cDNA全长,并研究了ApKTSPI基因的表达模式,为进一步研究其在柞蚕免疫中的功能及作用机理奠定了基础。     

梨小食心虫生物钟基因Gmper和Gmtim的鉴定及其对羽化节律的影响

【目的】本研究旨在探究梨小食心虫Grapholita molesta生物钟基因Gmper和Gmtim的分子特性与表达模式,分析其对羽化节律的调控作用,为梨小食心虫的防控提供潜在新靶标。【方法】根据梨小食心虫转录组数据,采用PCR技术克隆生物钟基因Gmper和Gmtim的cDNA全长;利用RT-qPCR测定这两个基因在梨小食心虫成虫头、胸、腹和足中的表达量,及其在蛹头部中的日表达模式;应用siRNA进行RNAi技术分析Gmper和Gmtim在梨小食心虫羽化节律中的作用。【结果】克隆获得梨小食心虫Gmper基因(GenBank登录号:MN862636)和Gmtim基因(GenBank登录号:MN862637)全长cDNA。Gmper基因开放阅读框长2 862 bp,编码953个氨基酸,序列中含2个PAS结构域和1个PAC结构域;Gmtim开放阅读框长3 048 bp,编码1 015个氨基酸。Gmper和Gmtim在雌雄成虫头部中的表达水平均高于其他组织中的;蛹期头部两基因在暗期的表达水平显著高于光期的。RNAi下调这两个基因的表达均导致梨小食心虫羽化时间更加分散以及羽化高峰期的羽化成虫数量显著降低。【结论】梨小食心虫生物钟基因Gmper和Gmtim具有组织和昼夜表达差异性,两基因对梨小食心虫羽化节律的调控有重要作用。研究结果为开发基于发育行为节律调控的梨小食心虫监测和防控方法提供了新线索。