悬铃木方翅网蝽触角气味结合蛋白基因鉴定

【目的】悬铃木方翅网蝽Corythucha ciliata是专性危害悬铃木属Platanus植物的外来入侵害虫,本研究旨在获得该害虫触角中气味结合蛋白(OBPs)基因信息,以期寻求有效控制害虫的嗅觉分子靶标。【方法】利用Illumina HiSeq~(TM) 4000高通量测序技术对悬铃木方翅网蝽雌雄成虫触角进行转录组测序并对测序结果进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR(qPCR)方法,分析OBP基因在悬铃木方翅网蝽雌雄成虫触角中的表达模式。【结果】对悬铃木方翅网蝽雌雄成虫触角6个样品的转录组测序,共获得40.87 Gb clean reads,各样品的序列长度均达到6.31 Gb。转录组数据分析共鉴定出26个推测的悬铃木方翅网蝽OBP基因,其编码蛋白中24个(CcilOBP1-24)属于Classic OBPs,CcilOBP25/26属于Plus-C OBPs;与半翅目其他昆虫相关OBPs系统发育分析表明,大部分CcilOBPs形成独立一簇,少数与其他半翅目昆虫OBPs直系同源。qPCR分析显示,有11个OBP基因在雌雄成虫触角中表达量差异显著,其中有9个OBP基因(CcilOBP5/6/9/10/17/18/21/24/25)在雄成虫触角中显著高表达,有2个OBP基因(CcilOBP14/16)在雌成虫触角中显著高表达。【结论】本研究获得了悬铃木方翅网蝽成虫触角气味结合蛋白基因信息,研究结果为生物控制该害虫提供了重要基础数据和候选分子靶标。     

桃小食心虫成虫期高表达气味结合蛋白基因的克隆与表达谱分析

【目的】桃小食心虫Carposina sasakii是我国北方落叶果树的重要蛀果害虫,一旦幼虫蛀入果内,便会对果实的品质产生影响。成虫期是控制此害虫发生为害的关键时期。气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)作为昆虫嗅觉感受系统中与气味分子结合的重要气味运转蛋白,在成虫寄主植物定位及交配行为中具有重要作用。本研究对桃小食心虫气味结合蛋白基因进行克隆、鉴定和成虫组织表达分析,以期为OBPs在桃小食心虫嗅觉感受过程中的功能研究奠定基础。【方法】基于前期获得的桃小食心虫转录组测序数据,选择在其雌雄成虫触角中相对高表达的5个OBP基因(CsasOBP7, CsasOBP12, CsasOBP15, CsasOBP19和CsasOBP21)。采用RACE技术克隆出这5个OBP基因cDNA全长序列,进行生物信息学分析;通过qRT-PCR技术检测这5个OBP基因在桃小食心虫不同发育阶段(1和5日龄卵、初孵幼虫、老熟幼虫和蛹)以及在刚羽化、交配高峰期的和交配后6 h的雌雄成虫不同组织［触角、头(不含触角)、胸、腹、足和翅］中表达量。【结果】获得桃小食心虫5个OBP基因CsasOBP7, CsasOBP12, CsasOBP15, CsasOBP19和CsasOBP21的全长cDNA序列(GenBank登录号: MZ476786-MZ476790)。其中CsasOBP19为一段C端不完整的Minus-C OBP,其余均属于完整的Classical OBPs,且均含有信号肽。系统发育分析表明,在桃小食心虫5个CsasOBPs中, CsasOBP7和CsasOBP19的亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明,CsasOBP7和CsasOBP19均在桃小食心虫蛹期高表达,而CsasOBP12, CsasOBP15和CsasOBP21均在卵期高表达。从桃小食心虫成虫刚羽化、交配高峰直至交配后6 h,5个CsasOBP基因表达量总体呈下降趋势。在成虫刚羽化时,这5个CsasOBP基因在各组织中均有表达,且主要在雄虫组织中高表达;在成虫交配高峰期,这5个CsasOBP基因在雄虫触角中高表达,特别是CsasOBP7和CsasOBP15只在雄虫触角中特异性表达;在成虫交配后6 h,每个CsasOBP基因只特异性地高表达于1或2个组织中。【结论】桃小食心虫的这5个CsasOBP基因在成虫交配高峰期雄虫触角中高表达,意味着这些CsasOBP基因可能在雄虫寻找雌虫过程中发挥着重要作用。     

小菜蛾触角结合蛋白PxylOBP31的鉴定与结合特性分析

【目的】触角结合蛋白(antennal binding proteins,ABPs)为昆虫气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)家族的一个亚类,是昆虫识别和响应外界环境中气味信号的载体之一,对昆虫的生存和繁衍有着重要的意义。明确触角结合蛋白在小菜蛾Plutella xylostella(L.)嗅觉识别中的作用,有助于揭示小菜蛾嗅觉识别分子机制。【方法】利用PCR技术克隆小菜蛾的一个触角结合蛋白基因;采用实时荧光定量PCR技术对该基因在小菜蛾不同发育阶段和成虫不同组织中的表达量进行分析;利用荧光竞争结合实验测试该触角结合蛋白与39种配基化合物的结合特性。【结果】成功克隆了一个小菜蛾触角结合蛋白基因,命名为Pxyl OBP31(Gen Bank登录号:KT156676)。序列分析结果显示,其开放阅读框全长411 bp,编码136个氨基酸,N端自起始位置开始21个氨基酸为信号肽,含有气味结合蛋白家族的6个保守半胱氨酸残基,预测分子量为14.74 k D,等电点为4.41。表达谱分析表明,Pxyl OBP31主要在雄蛾中表达,且交配后的雄蛾中表达量明显降低;该基因在小菜蛾触角中有较高表达,在雄蛾触角中的表达量比雌蛾触角中高近2倍。结合特性实验结果显示,Pxyl OBP31与醛、酮、萜品油烯以及邻苯二甲酸二异丁酯等物质的结合能力较强,与3种性信息素及其他烯烃与酯类结合能力弱。【结论】本研究明确了Pxyl OBP31的核苷酸序列以及发育和组织表达谱。根据qRT-PCR和荧光竞争结合实验结果,推测Pxyl OBP31蛋白可能与小菜蛾觅偶、定位寄主植物等行为有关。     

光肩星天牛气味结合蛋白AglaOBP12的基因克隆、表达及配体结合特征

【目的】克隆和鉴定光肩星天牛Anoplophora glabripennis气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)基因,明确其表达特点及与寄主植物挥发物的结合特性,有助于阐明光肩星天牛嗅觉识别的分子机制。【方法】根据光肩星天牛雌成虫触角转录组数据,利用RT-PCR克隆OBP12基因,并进行生物信息学分析。通过实时定量PCR(qRT-PCR)测定OBP12在光肩星天牛成虫触角、头(移除触角)、胸、腹、足、翅中的转录水平。利用原核表达系统和Ni离子亲和层析技术表达和纯化OBP12重组蛋白,荧光竞争结合实验测定重组蛋白与39种气味配体的结合能力。【结果】获得光肩星天牛气味结合蛋白基因AglaOBP12(GenBank登录号:KX890109)的完整编码序列,其开放阅读框长414 bp,编码137个氨基酸,N末端具有18个氨基酸组成的信号肽序列,蛋白序列具有6个保守的半胱氨酸残基,Agla OPB12属于Classical OBPs亚家族基因。qRT-PCR测定结果表明,AglaOBP12主要在成虫触角中表达,在其他组织微量表达。在待测的39种寄主植物挥发物中,重组蛋白AglaOBP12仅与19种化合物具有结合活性,表明AglaOBP12对寄主植物挥发物具有明显的选择结合特性。重组蛋白AglaOBP12与十二烷醇、十四烷醇、法尼醇、十二醛、乙酸-顺-3-己烯酯和β-石竹烯的结合能力较强,结合常数分别为1.96,0.96,1.03,0.82,0.77和0.74μmol/L。【结论】明确了AglaOBP12的核苷酸和氨基酸序列组成,重组AglaOBP12蛋白与主链有12个碳原子的醇类、醛类和萜烯类挥发物有特异性的结合活性。根据AglaOBP12基因的表达特点和重组蛋白的结合特性,推测AglaOBP12在光肩星天牛成虫定位补充营养寄主植物中发挥重要作用。     

梨小食心虫Minus-C气味结合蛋白的分子克隆、表达谱及结合特性分析

【目的】通过克隆梨小食心虫Grapholita molesta的Minus-C气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,并测定其在成虫不同组织中的表达量及其重组蛋白对气味配体的结合能力,推测其嗅觉生理功能。【方法】基于梨小食心虫雌虫触角转录组测序数据,利用RT-PCR克隆MinusC OBP基因的完整编码区;qPCR测定该基因在成虫不同组织[触角、头(去除触角)、胸、腹、足、翅]中的表达量;构建原核表达系统表达重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达和纯度;运用荧光竞争结合实验测定重组蛋白与35种气味配体的结合能力。【结果】成功克隆了梨小食心虫的一个Minus-C OBP基因,命名为GmolOBP14(GenBank登录号:MF066361)。GmolOBP14开放阅读框长411 bp,编码136个氨基酸,成熟蛋白具有4个保守的半胱氨酸残基,属于Minus-C OBP亚家族。GmolOBP14在雌雄成虫的不同组织中均有表达,但在雄成虫翅和雌成虫触角中的表达量显著高于同性别的其他组织。重组蛋白GmolOBP14与气味配体的结合谱较窄,仅能与16种配体表现出不同程度的结合活性,其中与梨酯和十二醛的结合能力较强,解离常数Ki分别为6.92和12.74μmol/L;与癸醛、十四醛、顺-3-己烯-1-醇、苯甲醇和己酸丁酯有中等程度的结合活性,Ki分别为25.54,20.61,24.35,23.44和23.33μmol/L;GmolOBP14对性信息素组分没有结合活性,提示该蛋白不参与对性信息素的感受和识别。【结论】根据GmolOBP14基因的组织表达特点及其重组蛋白的结合特性,推测GmolOBP14除具有选择性结合和运输寄主植物挥发物的作用外,还参与与嗅觉无关的生理过程。     

绿豆象气味结合蛋白基因的克隆及表达分析

[目的]对绿豆象Callosobruchus chinensis气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)基因进行克隆、鉴定和组织表达分析,为研究OBPs在绿豆象嗅觉感受过程中的功能奠定基础.[方法]基于绿豆象触角转录组数据,通过RT-PCR克隆绿豆象6个OBP基因并进行生物信息学分析;...     

棉铃虫气味结合蛋白HarmOBP16的组织表达谱及配基结合特性分析

【目的】揭示棉铃虫Helicoverpa armigera气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因Harm OBP16的组织表达谱及其重组蛋白与气味化合物的结合特性。【方法】基于棉铃虫触角转录组数据,利用PCR技术从棉铃虫成虫触角中PCR克隆气味结合蛋白基因,并进行生物信息学和系统进化分析;采用qPCR对其进行组织[头部(去除触角和喙)、胸部、腹部、足、翅、触角和喙]表达谱分析;进一步采用原核表达系统表达和纯化重组蛋白;最后采用荧光竞争结合实验测定该重组蛋白与85种候选气味物质的结合能力。【结果】从棉铃虫成虫触角中克隆得到一个Atypical OBP家族基因Harm OBP16(Gen Bank登录号:JQ753074),其开放阅读框长441 bp,编码146个氨基酸,推断的编码蛋白等电点为6.87,具有10个保守的半胱氨酸。组织表达谱结果表明,Harm OBP16在雌成虫翅中高表达。纯化后的重组蛋白Harm OBP16对植物花的挥发物香叶基丙酮(Ki=14.2μmol/L)、β-紫罗兰酮(Ki=15.2μmol/L)、辛醛(Ki=15.3μmol/L)、芳樟醇(Ki=16.8μmol/L)、(R)-(+)-柠檬烯(Ki=14.9μmol/L)和β-蒎烯(Ki=17.3μmol/L)有较强的结合能力。【结论】Harm OBP16可能在棉铃虫识别寄主植物的过程中发挥一定的作用,可为基于气味物质的棉铃虫引诱剂或驱避剂的研发提供潜在的分子靶标。     

中华蜜蜂OBP3基因的克隆、原核表达及组织表达谱

【目的】气味结合蛋白质（odorant binding proteins, OBPs）参与气味分子的识别,在蜜蜂嗅觉中扮演重要的角色。本研究旨在克隆中华蜜蜂 Apis cerana cerana OBP3基因,以制备多克隆抗体。【方法】运用RT-PCR技术从中华蜜蜂头部总RNA中扩增OBP3基因,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-28a并转入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)中诱导表达获得融合蛋白质,融合蛋白质经纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,最后分别用间接ELISA和Western Blot检测抗体的效价和特异性,并采用荧光定量PCR检测OBP3基因在中蜂不同组织中的表达。【结果】克隆得到了中华蜜蜂OBP3基因AccOBP3（GenBank登录号KJ026357）,大小为444 bp。 SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达。制备的多克隆抗体效价高于1∶40 000,且具有很高的特异性。荧光定量PCR结果表明,AccOBP3基因在腿部和触角中显著高表达（P<0.01）,胸部中次之（P<0.01）,头部和腹部中显著低表达,后两者表达量差异不显著（P>0.05）。【结论】OBP3基因在中蜂触角有高转录活性。本研究实现了中蜂OBP3基因的原核表达,并制备了兔抗中蜂OBP3多克隆抗体,为深入研究中蜂OBP3基因的功能奠定基础 。     

中华按蚊气味结合蛋白基因AsinOBP1的克隆和表达分析

【目的】蚊虫的行为在很大程度上依赖于嗅觉系统, 例如寻找宿主和产卵场所等。中华按蚊Anopheles sinensis是我国最重要的传疟媒介之一, 但有关中华按蚊嗅觉信号传递过程的研究甚少。本研究旨在克隆和表达分析中华按蚊的气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）基因, 为进一步研究中华按蚊嗅觉传递的分子机制奠定基础。【方法】通过分析中华按蚊的转录组数据克隆气味结合蛋白基因, 采用RT-PCR和实时定量PCR技术分析该基因在成虫不同组织和在吸血前后的表达模式。【结果】克隆到一个气味结合蛋白基因, 命名为AsinOBP1 (GenBank登录号为KJ958382)。AsinOBP1基因开放阅读框长435 bp, 编码144个氨基酸, 具有典型的6个半胱氨酸位点。RT-PCR组织表达谱分析发现, AsinOBP1在检测的所有成虫触角、下颚须、喙和头部组织中都有表达, 而在足和去掉头部以外的躯体组织中不表达。定量分析发现AsinOBP1在雌蚊触角中的表达水平最高, 吸食血液后, AsinOBP1的表达水平显著下降; 仅用小鼠气味处理后, AsinOBP1的表达水平也显著下降。【结论】研究结果说明AsinOBP1可能是嗅觉组织特异性表达的基因, 与雌蚊寻找宿主等行为有关, 其功能还需深入研究。     

苜蓿盲蝽气味结合蛋白基因Alin-OBP1的克隆及表达谱分析

有证据表明昆虫气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)与其嗅觉识别密切相关,起着运输外界脂溶性气味分子通过嗅觉感器淋巴液到达嗅觉受体的关键作用.为了更好地了解OBPs在苜蓿盲蝽Adelphocoris lineolatus (Goeze)嗅觉识别中的作用,本研究首次克隆了苜蓿盲蝽气味结合蛋白基因Alin-OBP1 (GenBank序列号GQ477022). 测序和序列分析结果表明,该基因开放阅读框长438 bp, 编码145个氨基酸,预测分子量为15.69 kDa,等电点为5.01,N-末端疏水区包含由18个氨基酸组成的信号肽.蛋白特征分析表明,该基因翻译后的蛋白质具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中有6个保守的半胱氨酸残基.利用RT-PCR和Real-time PCR技术对Alin OBP1在苜蓿盲蝽成虫不同组织和各个发育阶段的表达水平进行了测定,结果显示Alin-OBP1几乎全部在触角中表达.不同发育阶段Alin-OBP1表达量不同,在5龄若虫和成虫阶段表达水平最高.结果提示Alin-OBP1可能在苜蓿盲蝽感受包括性信息素在内的外界化合物的过程中发挥着重要作用.     

异色瓢虫气味结合蛋白基因HaxyOBP1和HaxyOBP6的克隆及表达谱分析

【目的】本研究旨在探索异色瓢虫Harmonia axyridis气味结合蛋白的结构和分布,更好地了解气味结合蛋白在异色瓢虫嗅觉系统中的作用。【方法】利用生物信息学方法克隆异色瓢虫2个气味结合蛋白基因序列并对其蛋白结构进行分析;通过实时荧光定量PCR分析克隆获得的这2个基因在异色瓢虫各个发育阶段和成虫不同组织中的表达水平。【结果】本研究成功克隆得到异色瓢虫两个气味结合蛋白基因HaxyOBP1和HaxyOBP6(GenBank登录号分别为MG757923和MG757927)。HaxyOBP1开放阅读框全长447 bp,编码148个氨基酸,具有6个保守的半胱氨酸,表明HaxyOBP1属于Classic OBPs。HaxyOBP1在异色瓢虫各发育阶段均有表达,在雄性成虫中表达量最高;组织表达谱分析表明HaxyOBP1在雄虫头部表达量最高。HaxyOBP6开放阅读框全长414 bp,编码137个氨基酸,具有4个保守的半胱氨酸,表明HaxyOBP6属于Minus-C OBPs。HaxyOBP6在成虫期的表达量明显高于幼虫阶段,并且在雄成虫中的表达量显著高于雌成虫;组织表达谱分析表明HaxyOBP6在雄成虫头部和雌成虫翅中表达量最高。【结论】本研究克隆得到异色瓢虫两个气味结合蛋白基因,表达谱分析表明HaxyOBP1和HaxyOBP6分别在异色瓢虫成虫头和翅中具有较高的表达水平,说明气味结合蛋白基因可能在异色瓢虫非嗅觉组织中同样具有重要作用。本研究结果为深入研究异色瓢虫气味结合蛋白结构和功能奠定了基础。     

花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的克隆、原核表达及组织表达谱分析

【目的】本研究克隆花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)基因AzanOBP3,并对其进行序列和表达分析,旨在更好地了解OBP基因在花椒窄吉丁成虫触角识别气味物质过程中的作用,为农林害虫的绿色防控提供理论依据。【方法】利用RT-PCR扩增花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的cDNA序列,采用生物信息学软件分析其核苷酸和氨基酸序列;构建重组表达载体pET-28a(+)/AzanOBP3,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中进行融合蛋白的IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定重组表达蛋白;基于qPCR技术分析AzanOBP3基因在花椒窄吉丁雌雄成虫不同组织(头、胸、腹、足和翅)中的表达情况。【结果】克隆获得了花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的cDNA全长序列(GenBank登录号:MT318832),预测到其开放阅读框长414 bp,共编码137个氨基酸,等电点为4.79,蛋白分子量为16.038 kD,N末端具有29个氨基...     

小菜蛾气味结合蛋白OBP2基因的克隆、表达谱及其结合特性分析

【目的】气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在昆虫寄主定位、产卵地选择等行为中发挥重要作用,克隆与鉴定小菜蛾Plutella xylostella OBP基因、明确其与配体化合物的结合特性有助于阐明小菜蛾嗅觉识别的分子机制。【方法】利用PCR技术克隆小菜蛾OBP2,对获得的编码序列全长进行信号肽及跨膜区域预测,用DNAMAN与其他昆虫的OBP2进行多序列比对,采用MEGA5.0邻接法(neighbor-joining method,NJ)构建进化树。通过实时定量PCR(qRT-PCR)分析Pxyl OBP2在小菜蛾不同发育阶段和不同组织中的表达模式。构建原核表达载体p ET28aPxyl OBP2,进行原核表达及蛋白纯化。利用荧光竞争结合实验对Pxyl OBP2蛋白与39种配基化合物的结合特性进行分析。【结果】成功获得小菜蛾OBP2基因Pxyl OBP2(Gen Bank登录号:KT070562)的编码序列全长,其完整开放阅读框大小为546 bp,编码182个氨基酸,具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸结合位点。荧光定量PCR结果表明,发育表达模式显示,Pxyl OBP2在未交配雄性成虫中的表达量均明显高于雌性成虫和已交配雄虫;组织表达模式显示,Pxyl OBP2在足中的表达量高于其他组织。经预测成熟蛋白大小为22.24 k Da,等电点5.69。SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达。荧光竞争结合实验对3种性信息素和36种植物挥发物结合发现,Pxyl OBP2与性信息素Z-11-16:Ald可以结合,解离常数48.951μmol/L;可以和11种寄主植物挥发物有效结合,其中,与芳樟醇、正壬醇结合能力最强,解离常数分别为4.733和6.861μmol/L。【结论】本研究明确了Pxyl OBP2的核苷酸、氨基酸序列,并根据qRT-PCR和荧光竞争结合实验结果,推断Pxyl OBP2与小菜蛾雄虫寻求配偶有关,且寄主挥发物芳樟醇、正壬醇起协同促进作用。     

暗黑鳃金龟气味结合蛋白HparOBP15a基因的克隆及功能分析

【目的】暗黑鳃金龟Holotrichia parallela通过气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)识别性信息素和植物挥发物准确而迅速地定位配偶、寄主植物。本研究通过克隆暗黑鳃金龟气味结合蛋白15a(Hpar OBP15a)基因,解析该基因的编码蛋白特征、组织表达模式及与寄主植物气味等化合物的结合特性方面的研究,为阐明暗黑鳃金龟基于嗅觉识别的寄主植物选择机理奠定理论基础。【方法】根据暗黑鳃金龟成虫触角转录组测序的结果,利用RT-PCR克隆了Hpar OBP15a基因;Real-time PCR方法分析了该基因在成虫不同部位的表达量差异;荧光竞争结合测定了Hpar OBP15a蛋白和58种候选化合物的结合特征。【结果】暗黑鳃金龟Hpar OBP15a基因全长534 bp,编码147个氨基酸,Gen Bank登录号为AK1834747。Hpar OBP15a在触角中特异表达,且在雌虫触角中表达量显著高于雄虫。在被测的58种化合物中,Hpar OBP15a与46种气味化合物具有较好的亲和性,其中与十二烷、十二醇结合能力最强,其解离常数分别为8.5和11.3μmol/L;同时,对性信息素(L-异亮氨酸甲酯和R-芳樟醇)也有一定的结合能力(解离常数分别为21.0和18.5μmol/L)。【结论】Hpar OBP15a具有广泛的气味结合谱,其中对榆树挥发物十二烷的结合能力最强,因此该蛋白可能在暗黑鳃金龟对榆树的定位过程中具有重要作用。     

花椒窄吉丁触角转录组及嗅觉相关基因分析

【目的】建立花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi成虫触角转录组数据库,挖掘嗅觉相关基因,为今后研究其触角的化学感受机制及生物防控提供理论支撑。【方法】采用高通量测序平台IlluminaNovaSeq 6000对花椒窄吉丁雌雄成虫触角进行转录组测序,用Trinity软件对获得的高质量reads进行序列拼接与组装;使用BLAST软件将触角转录组数据比对NR, NT, Swiss-Prot, GO, KEGG, BLASTX,eggNOG, Pfam, TmHMM, SignalP, KO, Map, BLASTP和RNAMMER公共数据库;基于初步筛选到的花椒窄吉丁候选气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)和化学感受蛋白(chemosensory protein, CSP)以及其他鞘翅目昆虫的同源蛋白的核苷酸序列,利用MEGA软件进行系统进化分析。运用RPKM (reads perkilobase per million mapped reads)值对嗅觉相关基因表达量进行分析。【结果】花椒窄吉丁雌雄成虫触角转录组测序共获得36 209条基因和90 982条转录本,其N₅₀分别为2 103和2 523 bp,组装完整性较高。注释到NR数据库的基因最多(41.62%),其中与赤拟谷盗Tribolium castaneum相似基因所占比例最高(19%)。在GO数据库中比对到11 614个基因,按功能分为细胞组分、分子功能与生物学进程三大类57个分支,其中分子功能大类中的结合(70.57%)与催化活性(45.51%)相关基因占比最多;KEGG代谢途径分析表明,7 427条基因参与了5类代谢通路,其中涉及信号转导的基因最多,为815条;筛选到7个候选OBP基因和5个具有全长开放阅读框的CSP基因,其编码蛋白均具有化学感受蛋白家族的典型特征。系统进化分析表明,花椒窄吉丁OBPs和CSPs分别与苹果小吉丁A. mali的OBPs和CSPs氨基酸序列一致性最高。RPKM值表明,嗅觉相关基因AzanOBP1和AzanOBP2在雌成虫触角中不表达,在雄成虫触角中微量表达;AzanOBP3在雄成虫触角中高丰度表达。【结论】首次获得了花椒窄吉丁成虫触角转录组数据,筛选到了花椒窄吉丁OBP, CSP, Or, IR和SNMP等的嗅觉相关基因。推测触角中高丰度表达的OBPs对雄成虫识别同类异性释放的信息素或寄主植物释放的挥发物起关键作用。研究结果可为花椒窄吉丁化学感受基因功能分析及嗅觉感受机制研究奠定分子基础。     

松墨天牛OBP基因MaltOBP2和MaltOBP6的克隆、序列分析及组织表达谱和原核表达研究

【目的】本研究旨在探索松墨天牛Monochamus alternatus Hope在嗅觉识别寄主植物过程中扮演重要角色的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)的结构及功能。【方法】利用生物信息学方法对得到的Malt OBP2和Malt OBP6基因序列和蛋白结构进行分析,并通过实时荧光定量PCR分析Malt OBP2和Malt OBP6在松墨天牛雄虫不同组织和时空中的表达差异,利用p ET32a(+)原核表达载体对Malt OBP2和Malt OBP6进行了诱导蛋白表达。【结果】本研究得到两个松墨天牛气味结合蛋白基因——Malt OBP2(Gen Bank登录号:KP120891)和Malt OBP6(Gen Bank登录号:KP120892),ORF长度分别为402 bp和408 bp,翻译的氨基酸序列均含有4个保守的半胱氨酸位点,表明得到的两个OBP基因的编码蛋白均属于Minus-C OBP亚家族;推导的两个OBP蛋白均有6个α螺旋区域,且α螺旋区域在两个蛋白的位置非常相似,但是两个OBP蛋白推测的配体结合位点和位点极性却完全不同。组织表达模式表明,Malt OBP2和Malt OBP6在成虫头部、触角、下颚(唇)须、腹部末端和足中均有表达,表达程度不一,但都在头部显著表达,触角中的表达量相比其他组织中较低或只是持平。发育表达结果表明,Malt OBP2在蛹触角中的表达量最高,而Malt OBP6在幼虫头部的表达量最高。本研究成功构建了原核表达载体p ET32aMalt OBP2和p ET32a-Malt OBP6,并进行了OBP蛋白诱导表达,低温(16℃和20℃)条件利于蛋白表达在上清液中,延长诱导表达时间(12 h)可以增加蛋白的表达量。【结论】本研究从松墨天牛体内得到了Minus-C OBP蛋白亚家族的两个基因Malt OBP2和Malt OBP6,通过配体结合位点推测它们具有不同的生理功能;通过组织表达谱结果推测这两个OBP基因在松墨天牛中的功能不仅仅局限于嗅觉识别,或还有味觉感受、化学感受等其他生理功能。本研究结果为两个OBP蛋白的结构和功能研究奠定了基础,为探索松墨天牛的化学感受机制提供了条件。     

中华蜜蜂气味结合蛋白基因OBP4的分子特性及时空表达

气味结合蛋白OBPs在蜜蜂识别气味分子和生理反应的过程中起到了十分重要的作用。本研究通过利用生物信息学软件预测分析中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白基因OBP4(AcerOBP4)编码的蛋白理化特性和结构特征;采用MEGA 5.2软件中的邻位相连法(Neighbor-joining, NJ)构建AcerOBP4及其它昆虫OBPs的系统发育树;通过qRT-PCR技术分析AcerOBP4在中华蜜蜂的哺育蜂、采集蜂和1日龄工蜂各组织的表达情况。结果表明,中华蜜蜂和意大利蜜蜂Apis melliferaOBP4(AmelOBP4)氨基酸同源性为78%,AcerOBP4在中华蜜蜂的触角表达量最高,其次是足和头部组织表明该基因与蜜蜂的嗅觉行为密切相关。此外,AcerOBP4在蜜蜂脑部有一定的表达,但是在腹部组织表达量很低。该研究结果丰富了蜜蜂OBPs表达特性的研究数据,同时也为继续深入研究OBP4在中华蜜蜂中是否影响嗅觉行为提供了基础。     

本期重点推介

正气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)是昆虫嗅觉机制中的关键物质之一,参与昆虫专一性识别外界环境的第一步生化反应。而昆虫嗅觉对其生理和行为又起着重要作用。研究OBPs的分子构造和功能,对认识昆虫的嗅觉机制并在害虫防治中加以应用都有重要意义。福建农林大学应用生态研究所程小娟、蔡立君和尤民生等在克隆和分析小菜蛾OBP2基因Pxyl OBP2 c DNA序列的基础上,通过实时定量PCR(qRT-PCR)分析Pxyl OBP2在小菜蛾不同发育阶段和不同组织中的表达模式,对Pxyl OBP2进行了原核表达及蛋     

角倍蚜气味结合蛋白和化学感受蛋白基因的鉴定及表达谱

【目的】通过对角倍蚜Schlechtendalia chinensis气味结合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)和化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)基因进行鉴定和表达谱分析,为研究OBPs和CSPs在角倍蚜嗅觉感知中的功能提供理论依据。【方法】基于角倍蚜基因组和不同发育阶段转录组数据,通过生物信息学方法鉴定和筛选角倍蚜OBPs和CSPs的基因序列;利用邻接法对角倍蚜与其他半翅目昆虫OBPs和CSPs的氨基酸序列进行系统发育分析;根据角倍蚜OBP和CSP基因在不同发育阶段(干雌、干母、春迁蚜、秋迁蚜、越冬若蚜、雌性蚜和雄性蚜)转录组数据中的TPM(tags per million)值进行表达丰度分析,结合qRT-PCR方法检测角倍蚜OBP和CSP基因在不同发育阶段的相对表达量。【结果】从角倍蚜基因组和转录组数据中鉴定出12个OBP基因(SchiOBP2-10,SchiOBP13-15)和9个CSP基因(SchiCSP1-2,SchiCSP4-10);系统发育分析发现,角倍蚜OBPs和CSPs与其他蚜虫OBPs和CSPs...