Microsporidia infecting Apis mellifera: coexistence or competition. Is Nosema ceranae replacing Nosema apis?

Nosema ceranae has been suggested to be replacing Nosema apis in some populations of Apis mellifera honeybees. However, this replacement from one to the other is not supported when studying the distribution and prevalence of both microsporidia in professional apiaries in Spanish territories (transverse study), their seasonal pattern in experimental hives with co-infection or their prevalence at individual level (either in worker bees or drones). Nevertheless, N.ceranae has shown to present a higher prevalence at all the studied levels that could indicate any advantage for its development over N.apis or that it is more adapted to Spanish conditions. Also, both microsporidia show a different pattern of preference for its development according to the prevalence in the different Spanish bioclimatic belts studied. Finally, the fact that all analyses were carried out using an Internal PCR Control (IPC) newly developed guarantees the confidence of the data extracted from the PCR analyses. This IPC provides a useful tool for laboratory detection of honeybee pathogens.     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的研究

应用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立一种准确、灵敏、快速的蜜蜂微孢子虫检测方法。本研究根据东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的依赖DNA的RNA聚合酶Ⅱ大亚基(RPB1)序列,用在线软件Primer Explorer V4.0 online设计4条特异性引物,分别对Mg2+、d NTP、内引物FIP/BIP和甜菜碱浓度及反应温度和时间优化;选择蜜蜂体内常见病原进行该方法的特异性验证,用MseⅠ酶切扩增产物验证其准确性;将N.ceranae的DNA梯度稀释进行灵敏度检测并与PCR比较分析;最后在临床检测中验证该技术的可行性。结果表明,优化的体系可在恒温57℃下完成扩增反应;引物的病原特异性检测仅N.ceranae有梯状条带,MseⅠ酶切产物条带符合理论值;LAMP反应检测的灵敏度较PCR高10倍;能够直接从蜜蜂体内检测出N.ceranae。本研究建立的LAMP检测N.ceranae体系准确、快速、成本低,可为蜜蜂微孢子虫病的检测提供有力的技术支撑。     

意大利蜜蜂工蜂中肠响应Nosema ceranae胁迫的高表达基因分析

东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae是专性寄生蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌,对意大利蜜蜂(意蜂)具有较强的侵染性。本研究利用RNA-seq技术对正常10 d (Apis mellifera ligustica control group,Am CK)和N. ceranae胁迫10 d的意蜂工蜂中肠(Apis mellifera ligustica treatment group,Am T)进行测序,共得到160 847 237 100条原始读段,过滤后得到1 066 955 298条有效读段。主成分分析结果显示Am CK与Am T测序样品的组内重复性较好,组间的基因表达模式差异明显。GO分类结果显示,Am CK与Am T的前100位高表达基因(HEGs)分别分布于32和33个GO terms,基因富集数最多的均为代谢进程。KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果显示,Am CK的前100位HEGs富集在21个pathways,基因富集数最多的是内吞作用、信号通路和嘌呤代谢; Am T的前100位HEGs富集在26个pathways,基因富集数最多的是内吞作用、RNA转运和蛋白质的内质网加工。前100位HEGs的Venn分析结果显示Am CK与Am T的共有HEGs为87个,特有HEGs分别均为13个。研究结果揭示了N. ceranae胁迫意蜂工蜂中肠过程中的基因表达谱信息,也为解析N. ceranae致病的分子机理提供了有益信息和线索。     

感染了微孢子虫Nosema mesnili的斜纹夜蛾幼虫的急性麻痹症状

用微孢子虫Ｎａｓｅｍａｍｅｓｕｉｌｉ的日本分离株感染斜纹夜蛾Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｌｌｉｔｕｒａ幼虫,３天急性麻痹,７天幼虫死亡。寄生物微孢子虫侵入幼虫神经存在部位的皮层。考察了被侵染的神经节组织的病理学,在被侵染的神经节细胞内发现了少量孢子。     

东方蜜蜂微孢子虫感染对中华蜜蜂免疫基因表达和血淋巴中糖水平的影响

【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosemaceranae主要感染蜜蜂的消化系统,它被认为是引起蜂群崩溃综合症(Colony collapse disorder,CCD)的主要原因之一。东方蜜蜂微孢子虫对新寄主西方蜜蜂Apis mellifera的影响已得到广泛的研究,但它对原宿主中华蜜蜂Apis cerana cerana影响的报到则相对较少。本实验以意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica来源的东方蜜蜂微孢子虫感染中华蜜蜂,分析感病中华蜜蜂的免疫基因表达和血淋巴中糖含量变化,评价东方蜜蜂微孢子虫对中华蜜蜂健康的影响。【方法】利用荧光定量检测样本的免疫基因(vitellogenin、abaecin、apidaecin、hymenoptaecin、defensinl、defensin2和eater)表达量,分析东方蜜蜂微孢子虫的感染能否引起中华蜜蜂免疫应答。通过高效液相色谱法对样本的血淋巴进行糖浓度定量分析,检测其血淋巴中葡萄糖、海藻糖含量。【结果】所研究基因中,hymenoptaecin基因表达量在14日龄时感染组和对照组差异显著、vitellogenin基因表达量在7日龄时感染组和对照组间差异显著、defensin2基因表达量在7日龄和14日龄时感染组和对照组均差异显著,其他基因的表达量在均未达到显著水平;血淋巴中的葡萄糖与海藻糖的浓度在处理组和对照组间差异不显著。【结论】东方蜜蜂微孢子虫侵染中华蜜蜂后,hymenoptaecin、vitellogenin,defensin2基因在相应的日龄可对病原物应答,然而血淋巴中的葡萄糖和海藻糖的浓度不因侵染与否变化。     

东方蜜蜂微孢子虫传染病学分析

东方蜜蜂微孢子虫病是一种由东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)引起的蜜蜂传染病,已经蔓延到全球。蜜蜂感染东方蜜蜂微孢子虫后会导致早衰、哺育能力下降、生产力和繁殖能力降低,严重时可直接导致蜂群瓦解。本文从传染病学角度出发,对近10年东方蜜蜂微孢子虫病原学、流行病学和防治方法等方面进行总结,以此提高对微孢子虫的认识,为微孢子虫防治提供新思路。     

蜜蜂及熊蜂微孢子虫rRNA基因研究

核糖体RNA(rRNA)是一种理想的进化计时器,已广泛地应用于研究微生物的系统发育和进化关系。蜜蜂和熊蜂都被微孢子虫感染,关于蜜蜂和熊蜂微孢子虫rRNA基因研究主要有rRNA基因序列的测定分析、二级结构的研究和用rRNA基因检测诊断微孢子虫等。这些对蜜蜂和熊蜂微孢子虫系统发育的研究和微孢子虫的防治等具有重要的推动作用。     

柞蚕微孢子虫Nosema pernyi微管蛋白基因的克隆及系统发育分析

【目的】柞蚕微粒子病的病原为柞蚕微孢子虫Nosemapernyi,为解明柞蚕微孢子虫微管蛋白基因的序列信息,明确柞蚕微孢子虫的系统分类学地位。【方法】采用RT-.PCR、3′RACE(Rapid amplification ofcDNAends)等技术克隆得到了柞蚕微孢子虫的α、β和y-微管蛋白基因,并利用α、β-微管蛋白序列,分别采用NJ、ML法构建进化树。【结果】将克隆得到的基因序列提交NCBI(GenBank登录号:KF154086、KF023271、KF740389)。构建的系统发育树显示,微孢子虫类以一个独立群位于真菌群体中,与真菌的虫霉门关系较近,且与担子菌、球囊菌、壶菌、接合菌及部分子囊菌互为姐妹群。从部分微孢子虫的系统发育分析结果可以看出,20种微孢子虫分为2个分支,柞蚕微孢子虫与其他Nosema属聚为一类。【结论】本研究克隆得到了柞蚕微孢子虫α、β和y-微管蛋白基因,系统发育分析为更进一步了解柞蚕微孢子虫奠定了基础。     

蜜蜂微孢子虫在中国的自然种系构成初探

蜜蜂微孢子虫(Nosema apis及Nosema ceranae)是微孢子虫的典型代表之一,由它寄生蜜蜂所产生的疾病,称为蜜蜂微孢子虫病。通过目前国际上普遍使用的克隆16srRNA基因(16srDNA)的片段并测序的方法来进行蜜蜂微孢子虫在我国主要养蜂地区的分布情况。结果表明,在我国主要养蜂地区,造成大量西方蜜蜂患蜜蜂微孢子虫病的是东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae,至今为止未发现过去我们广泛认定的西方蜜蜂微孢子虫Nosema apis。     

转录组分析揭示东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂的分子机制

【目的】本研究旨在通过差异表达基因(differentially expressed gene, DEG)分析以及毒力因子和其他侵染相关因子分析,在转录组水平揭示东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的分子机制。【方法】基于前期已获得高质量的东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子(NcCK)及侵染意大利蜜蜂工蜂7和10 d的东方蜜蜂微孢子虫(分别为NcT1和NcT2)转录组数据,根据P≤0.05且|log₂(Fold change)|≥1的标准,通过比较分析筛选出NcCK vs NcT1, NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组的DEG。通过相关生物信息学软件对上述DEG进行Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析。根据Nr和KEGG数据库注释信息和相关文献进行对东方蜜蜂微孢子虫的毒力因子和侵染相关因子的统计和分析。通过RT-qPCR验证转录组数据及DEG表达趋势。【结果】从NcCK vs NcT1, NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组分别鉴定出1 397, 1 ...     

东方蜜蜂微孢子虫腺苷酸激酶的生物信息学与基因表达特征

本研究旨在解析东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的腺苷酸激酶（Adenylat kinase, ADK）NcADK的理化性质和分子特性,并检测NcADK基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程中的表达特征,以期丰富NcADK相关信息,并为进一步的功能研究提供依据。利用相关生物信息学软件预测和分析NcADK的理化性质、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构。使用MEME软件和Batch CD-Search工具分别预测东方蜜蜂微孢子虫和其它7种微孢子ADK蛋白的保守基序和保守结构域。通过Mega 11.0软件基于ADK氨基酸序列构建进化树。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中NcADK的相对表达量。结果表明,NcADK的CDS含有540个核苷酸,可编码179个氨基酸;NcADK的分子量约为20.66 kDa,分子式为C903H1488N258O278S8,脂肪系数为100.61,平均亲水系数为-0.502,等电点为6.83,含29个负电荷氨基酸和29个正电荷氨基酸;NcADK可同时定位于细胞质、线粒体、细胞核、囊泡和过氧化物酶体;NcADK含20个磷酸化位点,不含典型的信号肽;NcADK含88个α-螺旋,24条延长链,17个β-转角,50个无规则卷曲,与模板A0A0F9WEU7.1.A之间的序列同源性为100%;在东方蜜蜂微孢子虫、东方赤孢子虫Hamiltosporidium tvaerminnensis、肠脑炎微孢子虫Encephalitozoon intestinalis、按蚊微孢子虫Anncaliia algerae和角膜条孢虫Vittaforma corneae ADK中均鉴定到1个相同的结构域和5个相同的保守基序;东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫Nosema apis的ADK在进化树上聚为一支。相较于接种后1 d（1 day post inoculation, 1 dpi）,NcADK的表达量在2 dpi上调但无显著差异(P>0.05）,在3 dpi 和4 dpi均显著上调（P>0.05）。研究结果明确了NcADK的理化性质和分子特性,并揭示NcADK是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白,不同微孢子虫的ADK具有较强的保守性,东方蜜蜂微孢子虫及其姐妹种蜜蜂微孢子虫的ADK具有高同源性,NcADK在3 dpi和4 dpi被激活表达。     

东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程的nce-miR-23928及其靶基因表达谱

【背景】东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)专性侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞而导致的微孢子虫病给养蜂业造成严重损失。【目的】检测东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-23928及其靶基因在侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂过程的表达谱,为深入探究nce-miR-23928在东方蜜蜂微孢子虫侵染中的功能及调控机制提供依据。【方法】通过RNAhybrid、miRanda和TargetScan软件预测nce-miR-23928的靶基因。使用BLAST工具将上述靶基因比对到基因本体论(geneontology,GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)、Nr和Swiss-Prot数据库以获得相应注释。采用实时荧光定量PCR(realtimequantitativePCR,RT-qPCR)技术检测nce-miR-23928及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂过程中的相对表达量。【结果】相较于接种后1 d (1 day post infection, 1 dpi),nce-...     

东方蜜蜂微孢子虫孢子中微小RNA的鉴定与分析

【目的】丰富东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的微小RNA(microRNA, miRNA)信息,并为深入探究miRNA在病原孢子和病原侵染中的功能提供理论和实验依据。【方法】基于已获得的small RNA-seq数据,利用生物信息学软件对东方蜜蜂微孢子虫的纯净孢子中的miRNA进行鉴定和分析。采用茎环反转录PCR(stem-loop RT-PCR)检测已鉴定的miRNA的表达;通过分子克隆与Sanger测序验证miRNA的序列。使用TargetFinder软件预测这些miRNA的靶基因,并对靶基因进行数据库注释。根据miRNA与靶基因的靶向结合关系构建调控网络,再利用Cytoscape软件进行可视化。【结果】在东方蜜蜂微孢子虫孢子中共鉴定到10个miRNA;这些miRNA的长度分布介于21~25 nt,首位碱基表现出U偏向性,每一位碱基的偏向性差异明显。Stem-loop RT-PCR检测结果表明这10个miRNA均真实表达;Sanger测序结果证实了随机选取的其中2个miRNA的序列真实性。共预测出249个靶基因,其中分别有249, 118, 136和3个靶基因可注释到Nr,Swiss-Prot, KOG和eggNOG数据库。此外,分别有134和71个靶基因可分别注释到GO数据库的30个功能条目和KEGG数据库的54条通路。【结论】本研究揭示了东方蜜蜂微孢子虫孢子中miRNA的存在和表达;这些miRNA通过调控潜在靶基因的表达参与孢子的生命活动。     

一株家蚕异型微孢子虫感染特征和分类地位

【背景】家蚕微粒子病是一种对蚕业生产危害巨大的蚕病,该病病原是蚕种生产唯一检疫对象,而家蚕病原性微孢子虫种类多、来源复杂,给蚕种生产微粒子病的防控增加了难度。【目的】研究一株从蚕种检疫样品中分离的微孢子虫(命名为GXM15)的致病性和分类地位,鉴定并分析其来源,完善家蚕病原性微孢子虫分类和数据库,为蚕种生产控制家蚕微粒子病提供参考依据。【方法】采用生物试验方法测定GXM15微孢子虫对家蚕的半数感染浓度(IC₅₀)和胚种传染率;显微镜观察GXM15微孢子虫孢子形态,利用透射电子显微镜观察GXM15微孢子虫的超微结构;采用PCR扩增、T克隆和测序获得GXM15微孢子虫的SSUrRNA基因和ITS片段DNA序列,并利用MEGA5.0和DNAStar软件构建GXM15微孢子虫的系统发育树和遗传距离分析。【结果】GXM15微孢子虫对家蚕的IC₅₀为8.29×10⁴个/mL,是家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)的2.28倍;GXM15微孢子虫对家蚕的胚种传染率为3.6%,明显低于Nb;GXM15微孢子虫形态呈短卵圆...     

东方蜜蜂微孢子虫的基因结构优化及新基因鉴定

东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae是一种寄生于蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌,对蜜蜂的健康危害严重,给世界各国的养蜂业造成较大损失。本研究基于前期获得的N.ceranae孢子的转录组数据对其已注释基因进行结构优化,并对未注释基因进行预测和分析。通过将测序得到的clean reads比对参考基因组和转录本重构,共对10个N.ceranae的已注释基因的5'端或3'端进行了延长。利用Cuffcompare软件将重构转录本与参考基因组进行比对,共鉴定出27个新基因,随机挑选9个新基因进行RT-PCR验证,均能扩增出符合预期的目的片段,表明预测出的新基因真实存在。有6个新基因能够注释到GO数据库和6个基因注释到KEGG数据库。进一步分析结果显示上述新基因注释到细胞等10个GO条目上,它们可能在N.ceranae的生命活动中具有重要功能。研究结果为N.ceranae的基因结构和功能注释信息的完善提供了有益补充,也为新基因的功能研究打下了基础。     

东方蜜蜂微孢子虫的SNP与InDel位点鉴定及分析

【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae是一种专性侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌病原,广泛感染世界各地的蜂群。本研究拟利用已获得的东方蜜蜂微孢子虫纯净孢子的高质量转录组数据进行单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）和插入缺失（Insertion-Deletion,InDel）位点的鉴定和分析,旨在丰富东方蜜蜂微孢子虫的SNP和InDel信息,并为新型分子标记的开发提供基础。【方法】使用GATK软件识别东方蜜蜂微孢子虫的SNP和InDel位点。采用SnpEff软件预测变异位点发生的基因组区域及变异产生的影响。通过相关生物信息学软件分别将SNP和InDel位点所在基因分别比对GO和KEGG数据库,获得相应的功能和通路注释。【结果】共鉴定到28195个SNP位点,其中发生转换和颠换的SNP位点分别有21403和6792个;上述SNP位点的突变类型有12种,其中最丰富的突变类型为C/T;分布在CDS区的SNP位点最多,其次是基因间区、上游区、下游区和内含子区;最丰富的密码子突变类型是同义突变;SNP位点所在基因可注释到代谢进程、细胞组分和催化活性等43个GO条目以及代谢途径、核糖体和等次生代谢产物的生物合成等85条KEGG通路。共鉴定到2831个InDel位点,其中分布在基因间区InDel位点最多,分布在CDS区的InDel位点最少;最丰富的密码子突变类型是移码突变;InDel位点所在基因可注释到细胞进程、细胞和结合等38个GO条目以及代谢途径、次生代谢产物的生物合成及核糖体等73条KEGG通路。【结论】东方蜜蜂微孢子虫中存在大量的SNP和InDel位点,SNP位点的突变类型主要为转换,与其他物种类似;SNP与InDel位点的基因组功能元件分布规律和突变类型具有明显差异;SNP和InDel位点所在基因与东方蜜蜂微孢子虫适应宿主细胞内环境及病原增殖过程具有潜在关系。     

蝗虫微孢子虫对东亚飞蝗的实验感染

蝗虫微孢子虫(Nosema locustae Canning)系Canning(1953,1962)从非洲飞蝗(Locustamigratoria migratorioides)体内分离并命名。Henry(1971、1973)用双带蚱蜢(Melanoplus bivittatus)做替代寄主增殖孢子,用来防治草原蝗虫取得显著成效,后来发展成为第一个商品化的微孢子杀虫剂。 1985年我们从美国John.S.Evans博士处得到蝗虫微孢子虫浓缩液,并成功地在东亚飞蝗体内增殖,从而获得大量孢子。本文报道经东亚飞蝗体内增殖后的孢子超微形态结构、发育过程及孢子产生等方面的观察结果。     

东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-10660及其靶基因表达谱

【目的】本研究旨在为探究nce-miR-10660调控东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染的作用机制提供理论和实验依据。【方法】采用Stem-loop RT-PCR对前期鉴定到的东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-10660进行表达验证，再通过Sanger测序验证nce-miR-10660的序列。利用相关生物信息学软件预测和分析nce-miR-10660的靶基因。通过RT-qPCR检测nce-miR-10660及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程中中肠中的表达谱。【结果】Stem-loop RT-PCR和Sanger测序结果分别证实了nce-miR-10660在东方蜜蜂微孢子虫孢子中的表达和真实存在。靶向预测结果显示nce-miR-10660共靶向RRDRP和RCDP 42等9个基因；分别有2和6个靶基因可被分别注释到KEGG数据库中的4条通路和GO数据库中的23个条目。RT-qPCR结果显示，相较于东方蜜蜂微孢子虫侵染后1 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中nce-miR-10660的表达量，东方蜜蜂微孢子虫侵染后2 d时意...     

东方蜜蜂微孢子虫基因的可变剪接及可变腺苷酸化解析

本研究旨在基于已获得的第三代纳米孔全长转录组数据对东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae基因的可变剪接(alternative splicing,AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)进行分析.通过Astalavista软件鉴定东方蜜蜂微孢子虫基因的AS事件类型...