柞蚕蛹解除滞育过程中海藻糖合成酶基因的表达变化

【目的】克隆柞蚕Antheraea pernyi海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)基因,并对其进行组织表达分析,探讨该基因在柞蚕滞育蛹解除滞育过程中的表达规律,为阐明柞蚕滞育期间碳水化合物代谢规律与蛹滞育解除的关系提供数据支持。【方法】利用PCR及3'RACE技术从柞蚕幼虫脂肪体组织中克隆得到TPS基因,并进行生物信息学分析;RT-PCR检测该基因在柞蚕幼虫各组织中的表达分布,进一步采用Real-time PCR分析柞蚕滞育蛹解除滞育过程中该基因在脂肪体组织和血淋巴中的表达量变化。【结果】克隆获得柞蚕海藻糖合成酶基因并命名为ApTPS。其开放阅读框长2 487 bp,编码828个氨基酸,蛋白预测分子量为93.19 k D,等电点(p I)4.61;无信号肽,无跨膜区。蛋白质亚细胞定位预测该蛋白定位于细胞质中;蛋白质结构域分析表明,ApTPS有两个保守功能区:TPS(第22-497位氨基酸)和TPP(第532-772位氨基酸)。组织特异性分析表明,ApTPS基因在柞蚕幼虫脂肪体中表达量最高;柞蚕解除滞育过程中,ApTPS在脂肪体和血淋巴中的表达量均有所升高,且显著高于对照组(P0.05),但血淋巴中表达量的升高滞后于脂肪体。【结论】结果提示ApTPS参与了柞蚕蛹滞育中碳水化合物代谢调控并在其中发挥重要作用,与柞蚕蛹滞育解除关系密切。     

柑橘大实蝇滞育和非滞育蛹体内海藻糖含量的调控

【目的】通过比较柑橘大实蝇Bactrocera minax蛹滞育期与滞育前和滞育后以及滞育蛹与非滞育蛹体内海藻糖和葡萄糖含量的变化、海藻糖合成代谢途径中关键酶的活力变化以及关键酶基因的表达量变化,明确蛹滞育期间海藻糖合成代谢途径中关键酶对海藻糖含量的调控。【方法】利用分光光度法检测柑橘大实蝇滞育前(1日龄蛹)、滞育期(30,60和90日龄蛹)以及滞育后(120和150日龄蛹)蛹体内海藻糖与葡萄糖含量的变化,以及海藻糖合成代谢途径中的海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)、海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(TPP)和海藻糖酶(Tre)活力的变化;利用实时定量荧光PCR(qPCR)检测TPS,TPPB,TPPC-1,TPPC-2和Tre-1基因表达量的变化。向1日龄蛹体内注射20-羟基蜕皮酮(20E)作为处理(以注射10%乙醇为对照),分别于注射后1和30 d比较处理组与对照组蛹体内海藻糖与葡萄糖含量、关键酶活力以及上述基因表达量的差异。【结果】柑橘大实蝇蛹进入滞育后,海藻糖含量显著升高,葡萄糖含量无显著变化; TPS和TPP的酶活力以及TPS,TPPC-1和TPPC-2表达量在化蛹后逐渐升高,于滞育期达到最高水平,维持至羽化前显著下降;TPPB表达量在整个蛹期无显著差异; Tre酶活力以及Tre-1表达量在化蛹后逐渐升高,于滞育早期达到最高水平,随后显著下降,羽化前再次显著上升。注射20E后1 d,与对照组相比,处理组蛹体内海藻糖与葡萄糖含量、关键酶(TPS,TPP和Tre)活力以及TPS,TPPC-2和Tre-1表达量无显著变化,TPPB表达量显著下降,TPPC-1表达量显著上升;注射后30 d,与对照组滞育蛹相比,处理组非滞育蛹海藻糖含量显著上升,葡萄糖含量、TPS和Tre酶活力、TPS和Tre-1表达量显著下降,TPP酶活力以及TPPB和TPPC-2表达量无显著差异。【结论】柑橘大实蝇蛹体内海藻糖的含量在合成代谢途径中关键酶的调控下,随着滞育状态发生变化,表明海藻糖与滞育之间存在密切的关系,但其作用机理仍待进一步研究。     

本期重点推介

正昆虫体内海藻糖含量及海藻糖酶活力变化与昆虫滞育和滞育的解除有密切关系。为了探讨柞蚕Antheraea pernyi蛹滞育过程中海藻糖酶基因的作用,沈阳农业大学生物科学技术学院王德意、王勇和秦利等利用RT-PCR技术从柞蚕蛹中克隆获得3个海藻糖酶基因,再分别采用半定量RT-PCR和qPCR方法检测了这些基因在柞蚕滞育和发育蛹不同组织中的表达谱及长光照(17L∶7D)处理蛹滞育解除过程中脂肪     

柞蚕蛹脂肪体和血淋巴中糖类含量动态的温度和光周期效应

本文研究了柞蚕Antheraea pernyti滞育蛹和非滞育蛹的糖类含量动态.两类柞蚕蛹血淋巴中所含糖类均为海藻糖和葡萄糖,但葡萄糖始终处于极低水平.滞育蛹的脂肪体糖原与血淋巴海藻糖之间存在相互转化的关系,这种转化受温度的制约.温度对于滞育的终止和海藻糖积累量影响很大.在保种温度范围内,滞育蛹接触低温越早,温度越低,海藻糖积累量越高.非滞育蛹即使经长期低温(0℃左右)处理,体内也不积累海藻糖,且耐寒力显著低于滞育蛹.在25℃条件下,光周期对滞育蛹和非滞育蛹的影响不同.     

沙葱萤叶甲海藻糖酶基因GdTre1的克隆、分子特性和表达分析

【目的】海藻糖酶(trehalase,Tre)作为昆虫体内海藻糖代谢的关键性酶,在昆虫能量调节和生长发育中具有重要作用。本研究旨在克隆获得沙葱萤叶甲Galeruca daurica海藻糖酶基因,并对其表达模式进行定量分析,以期探究海藻糖酶在沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育中的作用。【方法】根据沙葱萤叶甲转录组数据,采用RACE技术,克隆得到Tre基因的c DNA全长,并进行生物信息学分析;应用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术检测其在沙葱萤叶甲不同发育阶段[卵、1-3龄幼虫、预蛹、蛹、成虫(羽化后3,7,10,15,25,40,60,80和100 d)]、成虫不同组织(头、胸和腹)以及3日龄成虫在不同温度(15,20,25,30,35和40℃)胁迫下的表达水平;采用3,5-二硝基水杨酸法测定不同日龄成虫体内海藻糖酶活性。【结果】克隆获得了沙葱萤叶甲可溶性海藻糖酶基因,并命名为Gd Tre1(Gen Bank登录号:KY697913),该基因全长1 933 bp,开放阅读框1 704bp,编码567个氨基酸;蛋白预测分子量为66.56 k D,等电点为6.62;编码蛋白具有海藻糖酶超基因家族典型的功能结构域,包含1条信号肽,不具有跨膜结构。同源序列比对和系统发育分析表明,Gd Tre1与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata Tre1b的同源性最高,氨基酸序列一致性达70.25%。RT-q PCR检测结果表明,Gd Tre1在沙葱萤叶甲各发育阶段均有表达,其中在卵期和成虫滞育期间高表达,而在幼虫、预蛹、蛹及成虫滞育前低表达;在成虫不同组织中,通常在腹部中表达量最高,其次为胸部,最低为头部;Gd Tre1表达量随着温度升高而上升,30℃达最高值,而后随温度升高略有下降。沙葱萤叶甲不同日龄成虫体内Gd Tre1表达量及Tre活性存在显著差异,且Gd Tre1表达量与Tre活性变化趋势一致。【结论】海藻糖酶与沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育有密切的关系。该结果为进一步揭示该虫的夏滞育分子机理提供了必要的基础。     

松毛虫赤眼蜂脂肪酸合酶基因的克隆、表达谱及其在滞育中的功能分析

【目的】本研究旨在克隆松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi脂肪酸合酶(fattty acid synthase, Fas)基因(TdFas),并分析其在滞育中的调控功能,为松毛虫赤眼蜂滞育研究提供新依据。【方法】基于松毛虫赤眼蜂转录组数据,克隆TdFas的cDNA全长序列并进行生物信息学分析。利用RT-qPCR检测TdFas在松毛虫赤眼蜂滞育与非滞育预蛹、蛹和成虫及滞育诱导维持期预蛹和滞育解除期预蛹中的表达量。通过以1 000, 2 000和3 000 ng/μL dsTdFas溶液浸泡松毛虫赤眼蜂幼虫的RNAi方式干扰TdFas的表达,探究其对松毛虫赤眼蜂滞育率及甘油三酯相对含量的影响。【结果】克隆得到松毛虫赤眼蜂TdFas的cDNA序列全长为8 601 bp(GenBank登录号：OP146440),其开放阅读框长7 278 bp,推测编码一个2 426个氨基酸的蛋白,含有一个典型的脂肪酸合酶的β-酮酰还原酶结构域。系统发育分析结果表明,TdFas与膜翅目其他昆虫的FASs亲缘关系较近,其中与短管赤眼蜂Trichogramma pretiosum FAS亲缘关...     

昆虫海藻糖酶的基因特性及功能研究进展

海藻糖酶(Treh)是昆虫能量代谢必不可少的一类酶, 亦是昆虫体内几丁质合成通路的第一个酶。其基因表达和酶活性直接与正常发育、 蜕皮、 变态以及繁殖等昆虫重要生理过程密切相关。目前已有多种昆虫的海藻糖酶基因被成功克隆, 从而发现昆虫海藻糖酶基因家族由多个成员组成。海藻糖酶基因所编码的蛋白大多数具有一个信号肽前导区, 部分蛋白拥有1~2个跨膜结构域, 根据是否具有跨膜结构, 可将其分为可溶性海藻糖酶(Treh1)和膜结合型海藻糖酶(Treh2)两类, 膜结合型海藻糖酶具有2个特有的标签序列, 即“PGGRFREFYYWDSY”和“QWDYPNAWPP”。海藻糖酶的主要功能是将胞外和胞内的海藻糖降解成葡萄糖, 为昆虫的生命活动提供能量。具体表现为两个方面, 一是参与昆虫几丁质合成途径, 从而调控表皮、 中肠等处的几丁质合成; 二是通过与激素的协同作用, 调控昆虫体内海藻糖和葡萄糖等糖类物质的浓度变化, 从而有效保护体内细胞的适应并渡过相应的逆境环境, 并提高其抗逆能力。鉴于海藻糖酶的重要功能, 其已成为害虫控制的潜在新靶标。不同类型海藻糖酶的功能研究及酶抑制剂的研发与应用将进一步推动害虫生物防治的发展。     

松毛虫赤眼蜂一氧化氮合酶基因的克隆、原核表达及在不同滞育阶段的表达谱分析

【目的】本研究旨在克隆松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi一氧化氮合酶(NOS)基因,表达其编码蛋白,并探究其在松毛虫赤眼蜂滞育过程中的表达模式,为松毛虫赤眼蜂滞育研究提供新依据。【方法】通过转录组数据分析获得松毛虫赤眼蜂一氧化氮合酶基因TdNOS cDNA序列,使用qPCR方法检测其在松毛虫赤眼蜂不同滞育阶段预蛹和蛹中的表达量。使用RT-PCR方法扩增TdNOS cDNA序列并通过生物信息学方法分析其序列特征。构建TdNOS的原核表达载体,利用大肠杆菌Escherichia coli表达系统表达重组TdNOS蛋白,通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化,并用于制备多克隆抗体。利用Western blot进一步检测TdNOS在松毛虫赤眼蜂不同滞育阶段的表达量。通过质谱鉴定纯化的目标蛋白。【结果】qPCR分析表明,TdNOS在松毛虫赤眼蜂滞育解除后蛹期的相对表达量显著高于其他阶段的。克隆获得松毛虫赤眼蜂TdNOS cDNA序列(GenBank登录号:MN650600),开放阅读框(ORF)序列长1 014 bp,编码337个氨基酸,无信号肽序列,不含跨膜结构,预测有33...     

大斑芫菁滞育幼虫在滞育不同阶段体内糖类和醇类含量的变化

在以卵滞育的昆虫中昆虫滞育时的生理代谢特点已经得到了大量研究。本文对以末龄幼虫（5龄）滞育的大斑芫菁Mylabris phalerate（Pallas）在不同滞育阶段体内糖类和醇类代谢的特征进行了研究。结果表明： 滞育个体血淋巴中的海藻糖含量高于非滞育个体,且随滞育时间的加大逐渐升高,滞育5个月时达到最大值,为5.61 μmol/mL。糖原的含量随滞育的进程逐渐减少,滞育初期（0.5个月）为0.72 mg/mL,到滞育末期（5个月）时仅为0.1 mg/mL。滞育个体脂肪体中的海藻糖含量都高于非滞育个体,滞育1个月时为非滞育个体的3倍,至滞育末期时达非滞育个体的5倍,为2.5 μmol/g脂肪体。糖原含量总体变化趋势是随滞育时间的加大逐渐减少,滞育早期和中期都高于非滞育个体。在滞育过程中血淋巴积累的小分子多元醇主要为甘油,其次是山梨醇;而在脂肪体中主要为甘油,其次是甘露醇,少量积累山梨醇：表明大斑芫菁滞育幼虫主要积累的是海藻糖和一些小分子多元醇。滞育幼虫在准备滞育时储备了大量糖原,这些糖原可能为滞育期间海藻糖、山梨醇和甘油的代谢提供了原料。     

二化性家蚕滞育、非滞育和即时浸酸卵中糖代谢相关酶mRNA水平和活性的变化

【目的】探究家蚕Bombyx mori胚胎发育早期卵内糖代谢与滞育的关系。【方法】以家蚕二化性品种"秋丰"活化越年卵为材料,一部分于17℃暗催青,孵化后常规饲养,制备非滞育命运卵(ND);另一部分于25℃明催青,孵化后常规饲养,制备滞育命运卵(DD),再用盐酸溶液处理部分DD卵制备即时浸酸卵(IA)。在卵产下或浸酸后0, 2, 6, 12, 24, 48, 72和96 h分别取样,利用qRT-PCR测定家蚕卵中己糖激酶(hexokinase, HK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, PFK)、山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase, SDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)和海藻糖酶(trehalase, TRE)5种糖代谢相关酶基因的mRNA表达水平,利用紫外-可见分光光度法测定家蚕卵中这5种酶的活性。【结果】家蚕糖酵解途径关键酶己糖激酶(BmHK)和磷酸果糖激酶(BmPFK),以及糖分解代谢关键酶山梨醇脱氢酶(BmSDH-1)和海藻糖酶(BmTRE)在ND和IA中...     

低温对麦红吸浆虫滞育解除及蜕皮激素受体基因EcR和热激蛋白基因Hsp70和Hsp90表达水平的影响

【目的】本研究旨在明确破茧率和破茧所需时间作为典型的专性幼虫期滞育昆虫麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana滞育解除指标的可行性,探讨蜕皮激素受体基因EcR和热激蛋白基因Hsp70和Hsp90在低温解除滞育中的作用。【方法】9月上旬采自田间的麦红吸浆虫滞育幼虫在低温(4℃)和自然变温处理不同时间(0~90 d)后转移至24℃化蛹,调查幼虫的破茧率、化蛹率及破茧和化蛹所需时间;采用qPCR技术分析4℃低温终止滞育并在24℃下恢复发育的幼虫EcR, Hsp70和Hsp90的mRNA水平。【结果】不同时间低温(4℃)和自然变温处理的麦红吸浆虫滞育幼虫破茧率和化蛹率以及破茧和化蛹所需时间均存在显著差异。未经低温(4℃)处理的幼虫在水分满足的条件下破茧率为71.3%,但均不能化蛹;低温(4℃)处理60 d内,随着处理时间的延长破茧率和化蛹率逐渐升高,破茧和化蛹所需时间逐渐缩短;与4℃低温处理30~60 d相比,自然变温处理30~60 d的幼虫化蛹率显著较低;4℃低温处理60 d和自然变温处理90 d后幼虫的化蛹率均超过91%。低温(4℃)处理显著提高了麦红吸浆虫幼虫EcR, Hsp70和Hsp90的表达量,其中处理30 d时其表达量最高,随着低温(4℃)处理时间的延长,表达量逐渐降低,大部分幼虫滞育解除后表达量趋于恒定。【结论】低温能显著促进麦红吸浆虫的滞育解除,效果优于9-10月自然变温;破茧率及破茧所需时间可作为评判麦红吸浆虫幼虫滞育强度的参考,但不能独立作为滞育解除的指标;EcR,Hsp70和Hsp90的表达水平与滞育强度密切相关,在麦红吸浆虫滞育解除中发挥潜在作用。     

温度对柑橘大实蝇滞育蛹能量结构与代谢的影响

【目的】为从生理生化水平上探讨越冬温度对柑橘大实蝇Bactrocera minax(Enderlein)滞育蛹的调控生理机制。【方法】测定了不同恒温条件下柑橘大实蝇越冬蛹滞育期虫体粗脂肪和糖类物质含量的变化动态。【结果】低温(12℃)越冬促进了虫体粗脂肪的积累,随温度升高,粗脂肪含量逐渐减少;总糖含量随越冬温度升高,趋于倒"U"型变化;虫体海藻糖含量先升后降(24℃除外),随温度上升,海藻糖含量最高值时期逐渐提前,且最大值逐渐降低;虫体糖原含量变化趋势各不相同,随温度升高,糖原含量最高值时期逐渐接近滞育解除期,越冬温度升高促进了柑橘大实蝇越冬蛹滞育期后期糖原的积累。此外,16℃下越冬,同时期各物质的含量均低于其它处理,说明在16℃下越冬加快了虫体能量物质的代谢或转换。【结论】不同恒温越冬,柑橘大实蝇越冬滞育期能量代谢方式不同,表明越冬温度与越冬蛹的能量代谢特点存在密切的关系。本研究结果对深入了解柑橘大实蝇越冬蛹能量代谢生理机制具有一定的参考价值。     

稻纵卷叶螟海藻糖酶基因的克隆、分子特性和表达分析

【目的】海藻糖酶(trehalase,Tre)是昆虫体内海藻糖代谢的一个关键酶,包括可溶型(Tre1)和膜结合型(Tre2)两种类型,在昆虫发育和能量调节中具有重要作用。本研究旨在克隆稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis海藻糖酶基因(Cm Tre),解析其在稻纵卷叶螟不同发育阶段和不同组织中的表达模式,分析该基因及酶蛋白的分子特征。【方法】通过稻纵卷叶螟转录组数据结合RACE技术,克隆稻纵卷叶螟Cm Tre的全长c DNA序列,并对该基因进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)解析Cm Tre在稻纵卷叶螟不同发育阶段及成虫不同组织部位的m RNA表达模式。【结果】获得两种类型的稻纵卷叶螟Cm Tre基因,即可溶型海藻糖酶基因Cm Tre1和膜结合型海藻糖酶基因Cm Tre2。Cm Tre1的全长c DNA长度为2 364 bp,开放阅读框长1 704 bp,编码567个氨基酸;Cm Tre2的全长c DNA长度为2 079 bp,开放阅读框长1 923 bp,编码640个氨基酸。生物信息学分析表明,Cm Tre前端有一个信号肽,Cm Tre1无跨膜结构,Cm Tre2有一个跨膜结构。同源性和聚类分析表明,Cm Tre1和Cm Tre2的氨基酸序列与竹蠹螟Omphisa fuscidentalis海藻糖酶Tre1和Tre2氨基酸序列的一致性最高,分别为74%和79%。同源建模预测结果显示,Cm Tre1的三维分子结构包含19个α螺旋和2个β折叠片;Cm Tre2的三维分子结构含有23个α螺旋,没有β折叠片。RT-q PCR结果显示,Cm Tre在稻纵卷叶螟整个发育历期都有表达,在成虫期表达水平最高,在整个幼虫期都有相对稳定的表达;Cm Tre1在蛹期表达水平最低,Cm Tre2在5龄幼虫时期表达水平最低。Cm Tre在所检测的成虫组织(中肠、体壁、马氏管、头、卵巢、脂肪体、肌肉和精巢)中均有表达;Cm Tre1在中肠和体壁中的表达水平较高,Cm Tre2在肌肉和中肠中的表达水平较高。【结论】本研究克隆了稻纵卷叶螟两种类型的海藻糖酶基因,分析了其基因特征和表达模式。研究结果为阐明海藻糖酶基因的功能进而以海藻糖酶基因为靶标防治害虫奠定了基础。     

亚洲玉米螟南昌种群滞育的解除

【目的】为了探明滞育诱导期和滞育期间的光周期和温度如何影响亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis滞育的强度。【方法】采用不同条件下诱导的亚洲玉米螟滞育幼虫转到不同条件下解除滞育的方法,测试了亚洲玉米螟南昌种群滞育幼虫滞育解除的光周期反应、滞育诱导期和滞育期间的光周期和温度对滞育持续时间的影响及田间越冬幼虫滞育解除的时间进程。【结果】滞育解除是由光周期控制的,临界日长为14.5 h。在25℃和28℃,光周期13L︰11D诱导的滞育个体的滞育强度显著弱于11L︰13D和12L︰12D。滞育幼虫在长光周期15L︰9D和22,25和28℃解除滞育,显示了其滞育持续时间随温度的升高显著缩短,从22℃下的72 d降到28℃下的34 d。5℃的低温处理没有缩短滞育持续时间,但低温处理同步了滞育个体的化蛹时间。越冬幼虫不同时期从自然条件下转入恒温25℃,长光周期15L︰9D和短光周期12L︰12D的条件下解除滞育,显示了越冬幼虫滞育初期对光周期仍然敏感,但这种光敏感性在1月份后丧失。3年的田间观察揭示了50%滞育幼虫的化蛹时间出现在4月末至5月上旬,50%羽化时间出现在5月中旬。【结论】亚洲玉米螟滞育幼虫的滞育强度受到滞育诱导期和滞育期间的光周期和温度的显著影响。     

粘虫的血糖代谢

本文通过纸上层析和化学方法,研究了粘虫在蛹化前后各虫期血淋巴液中的总糖、海藻糖、葡萄糖和血淋巴的还原值,并与蓖麻蚕进行了比较。此外,还测定了血淋巴海藻糖酶的活性变化。结果表明:1)在蛹化前后血淋巴液中的总糖与海藻糖,自末龄幼虫进食以后开始大量积累,到幼虫老熟时达最高。在幼虫蜕皮和停食化蛹过程,血糖含量明显地减少。雌体含量均高于雄体。血淋巴液中的糖量变化与粘虫的生长发育有密切关系。2)和蓖麻蚕相似,在蜕皮和停食以后的化蛹过程,血淋巴中的还原值显著增加,这种增加主要是由于葡萄糖、核糖以及其它还原物质的出现或数量的增加所引起。3)末龄幼虫血淋巴液中的总糖及海藻糖的百分比含量,均比同虫期的蓖麻蚕的含量低2—5倍。粘虫幼虫血淋巴中的海藻糖量只占总糖的66.3%—94%,而蓖麻蚕则为98%—100%。4)幼虫血淋巴中的海藻糖酶活力与家蚕、蓖麻蚕的相同,均在进食期间无活力表现或活力极低;在幼虫蜕皮和化蛹过程则明显出现活力。5)血淋巴液中的糖量变化与海藻糖酶活力变化有明显的负相关。文中还分析和讨论了粘虫血糖代谢的特点以及各种糖类物质在生长发育中的作用。     

二化螟滞育生物钟蛋白TIME-EA4基因的克隆及时空和温度诱导表达分析

【目的】生物测时蛋白TIME-EA4是昆虫特有的一种滞育生物钟蛋白。本文旨在克隆二化螟Chilo suppressalis TIME-EA4基因,研究其在二化螟不同发育时期和不同组织中的时空表达模式及在不同田间种群和不同温度诱导下的滞育和非滞育种群中的表达水平。【方法】通过RACE技术克隆二化螟TIME-EA4基因全长c DNA序列,利用荧光定量PCR的方法检测TIME-EA4基因在二化螟不同发育时期、6龄幼虫不同组织中的表达模式,及在不同季节采集的田间种群和不同温度处理1h后的滞育和非滞育种群6龄幼虫中的表达量变化。【结果】从二化螟中克隆获得TIME-EA4的c DNA序列(Gen Bank登录号:KU356855),全长821 bp,开放阅读框516 bp,编码172个氨基酸;TIME-EA4基因在二化螟不同发育时期和不同组织中均有表达,且在早期蛹、雌雄成虫以及6龄幼虫的头部、脂肪体和中肠中表达水平较高,同时在滞育幼虫组织中的表达高于非滞育幼虫。此外,TIME-EA4基因在滞育种群中的表达量是非滞育种群的3倍左右,同时在非滞育种群中,该基因的表达明显受10℃及以下低温的诱导,且在10℃时表达量最高,而在滞育种群中该基因的表达受温度影响不明显。【结论】结果说明TIME-EA4基因与二化螟的抗低温胁迫以及低温滞育相关。本研究为TIME-EA4在农业害虫滞育的分子作用机制研究奠定了基础。     

光周期和温度对大草蛉滞育解除及滞育后发育和繁殖的影响

【目的】大草蛉Chrysopa pallens(Rambur)是自然界重要的天敌昆虫,以预蛹兼性滞育越冬。本研究旨在明确光周期和温度对大草蛉滞育解除及滞育后发育和繁殖的影响。【方法】在室内观测了不同温度(22℃和25℃)和光周期(15L∶9D及9L∶15D)条件下大草蛉预蛹的滞育解除及滞育解除后的蛹期、蛹存活率、成虫鲜重、成虫寿命、产卵前期和单雌产卵量等生物学特性,以及5℃低温处理对预蛹滞育解除的作用,并分析了滞育持续时间对大草蛉滞育解除后发育和繁殖的影响。【结果】在光周期15L∶9D和9L∶15D下,25℃下大草蛉预蛹期(分别为50.09和49.47 d)显著短于22℃下(分别为80.80和82.20 d)。5℃低温处理极显著延长了大草蛉预蛹期(P0.01),且缩小了预蛹期的个体差异。22℃下,与非滞育预蛹相比,滞育后预蛹的存活率显著降低,蛹期和产卵前期显著延长,雌成虫寿命显著缩短,成虫鲜重和单雌产卵量显著下降。22℃,光周期15L∶9D下大草蛉的滞育持续时间为50~170 d,且能影响滞育后发育:随着滞育持续时间的延长,蛹期逐渐延长,雌、雄成虫的鲜重逐渐降低,雄成虫寿命呈先延长后缩短的趋势,蛹存活率、雌成虫寿命、产卵前期和单雌产卵量没有显著性差异。【结论】试验条件下,两种光周期对大草蛉滞育解除、滞育后发育和繁殖没有明显的影响,而温度是调节大草蛉滞育发育和繁殖的重要因子。较高温度能促进滞育的解除,低温处理能够同步种群的滞育发育。大草蛉的滞育存在生殖代价,滞育持续时间影响滞育解除后的部分生物学特性。     

松毛虫赤眼蜂滞育诱导及解除条件研究

【目的】以柞蚕Antheraea pernyi卵为繁殖寄主,对松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolim滞育诱导及解除条件进行研究,以解决赤眼蜂工厂化生产和大面积应用中面临的的中、长期储存问题。【方法】通过观测不同发育阶段(寄生柞蚕卵在26℃培养40、96和144 h)、滞育诱导温度(10、13和16℃)和诱导时间对松毛虫赤眼蜂滞育的影响,确定松毛虫赤眼蜂滞育诱导条件;通过观测滞育诱导温度和滞育后的贮藏温度对滞育解除的影响,确定松毛虫赤眼蜂滞育解除条件。【结果】在松毛虫赤眼蜂的不同发育阶段对其进行持续的低温刺激均能使其导入滞育,但以小幼阶段(26℃培养40 h)开始效果最佳,寄生卵在26℃培养40 h后,转入10℃和13℃下连续诱导31 d,滞育率可达100%和99.12%。滞育诱导温度和滞育后的贮藏温度对松毛虫赤眼蜂解除滞育所需时间和解除滞育后的羽化出蜂率有较大影响,10℃诱导滞育后置于1℃冷藏的赤眼蜂解除滞育所需时间最短,解除滞育后的羽化出蜂率和单卵出蜂数更高,更耐储存。此条件下冷藏约30 d开始打破滞育,在正常发育下温度下羽化出蜂,60 d羽化出蜂率达到95.24%,冷藏4个月后羽化出蜂率仍在60%以上,单卵出蜂数高于50头。【结论】松毛虫赤眼蜂最佳滞育诱导条件为26℃培养40 h后,转入10℃连续低温诱导31 d;最佳滞育解除条件为1℃低温储存,但储存期不能超过4个月。     

海藻糖酶基因TRE2-like和TRE2在异色瓢虫羽化过程中的表达与功能

【目的】异色瓢虫Harmonia axyridis是一种重要的捕食性天敌昆虫,海藻糖在异色瓢虫的变态发育、羽化等整个生命过程都起着重要的作用。本研究以前期获得的类似膜结合型海藻糖酶(TRE2-like)与膜结合型海藻糖酶(TRE2)基因为基础,探讨在异色瓢虫羽化阶段这两个海藻糖酶的潜在功能,为阐明异色瓢虫从蛹发育到成虫时海藻糖代谢机制提供参考。【方法】根据TRE2-like和TRE2基因序列设计双链RNA(dsRNA)区域片段并合成对应的dsRNA,通过RNAi将其注射到异色瓢虫2日龄蛹中。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测RNAi处理后羽化第1天的异色瓢虫成虫糖代谢相关基因的表达;同时采用蒽酮比色法、酶标法等分别测定RNAi处理后羽化第1天的异色瓢虫成虫主要糖类物质含量及TRE活性变化,并观察异色瓢虫羽化后的表型变化。【结果】结果表明,与对照组(dsGFP注射组)相比,异色瓢虫2日龄蛹被注射TRE2-like或TRE2 dsRNA后,其新羽化成虫体内TRE2-like和TRE2表达量均极显著下调,且少数个体出现了蜕皮与翅形成困难等畸形表型。可溶性海藻糖酶活性在注射dsTRE2-like后显著降低,膜结合型海藻糖酶活性在注射dsTRE2后显著降低;注射dsTRE2后糖原含量显著下降,注射dsTRE2-like后糖原和海藻糖含量显著下降,注射dsTRE2-like+dsTRE2后糖原和葡萄糖含量显著下降,且海藻糖含量极显著下降。注射dsTRE2-like, dsTRE2和dsTRE2-like+dsTRE2后可溶性海藻糖酶基因TRE1-1和TRE1-2表达下降或显著下降,而TRE1-5表达上升或显著上升,海藻糖合成酶(trealose-6-phosphate synthase, TPS)、糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase, GP)、糖原合成酶(glycogen synthase, GS)基因的表达均显著下调。【结论】TRE2-like和TRE2基因表达被抑制后,异色瓢虫海藻糖等代谢受到影响。研究结果为探究异色瓢虫体内膜结合型海藻糖酶的潜在功能和调控机制奠定了基础。