化学感受蛋白Amel-CSP3和Amel-CSP4在意大利蜜蜂成年工蜂中的时空表达水平研究

[目的]化学感受蛋白(Chemosensory proteins,CSPs)广泛存在于昆虫的触角等化学感受器中,在昆虫的化学感受系统中发挥着重要的作用,为探究Amel-CSP3和Amel-CSP4在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica成年工蜂中的时空表达水平及功能。[方法]首先通过荧光定量PCR技术检测了Amel-CSP3和Amel-CSP4在哺育蜂和采集蜂的触角、头部、胸部、腹部和腿的表达水平;然后对不同日龄工蜂(1,6,12,18,28日龄)触角中Amel-CSP3和Amel-CSP4的表达情况进行检测。[结果]Amel-CSP3在哺育蜂和采集蜂触角均具有较高的表达水平,其在28日龄触角中的表达水平最高,显著的高于其他日龄(P0.05);Amel-CSP4仅在工蜂触角表达,其在触角中表达水平随着工蜂日龄的增加而逐渐降低。[结论]Amel-CSP3和Amel-CSP4在意大利蜜蜂工蜂中的表达水平具有显著地时空特异性,这对探究Amel-CSP3和Amel-CSP4以及整个CSPs家族的功能具有一定的生物学意义。     

意大利蜜蜂不同日龄工蜂脑部三种miRNA的表达水平

【目的】意大利蜜蜂 Apis mellifera ligustica（简称“意蜂”）是社会性昆虫,蜂群中的工蜂表现出年龄依赖性的行为转变,其行为转变的机制一直是研究的热点。本研究分别检测了3种miRNA（ame-let-7, ame-miR-13b和ame-miR-279）在不同日龄意蜂工蜂脑部的表达情况,以期为探究意蜂工蜂年龄依赖性行为变化机制提供重要线索。【方法】通过荧光定量PCR分别检测了不同发育时期（4, 8, 12, 17, 22, 26和30日龄）意蜂工蜂脑部3种miRNA的表达情况,并检验miRNA的表达差异情况。【结果】ame-let-7的表达量随工蜂日龄的增加逐渐降低,在17日龄后其表达量趋于稳定;ame-miR-13b的表达量则随着工蜂日龄的增加逐渐增加,但在26和30日龄的工蜂中稳定表达;ame-miR-279的表达量则呈类似正态分布状态,其中在12日龄工蜂中表达量最高,且在17日龄后稳定表达。这3种miRNA表达均具有明显的时间特异性。【结论】 ame-let-7, ame-miR-13b和ame-miR-279的表达与工蜂年龄依赖性行为变化具有相关性和规律性,对于深入探究miRNA的作用位点具有重要参考价值。     

三种微小RNA在意大利蜜蜂工蜂蛹期发育过程中的表达谱及潜在功能

[目的]意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica是生产性能优良的西方蜜蜂Apis mellifera亚种.本研究旨在利用分子生物学手段揭示3种微小RNA(microRNA,miRNA) ame-miR-13b,ame-miR-100和ame-miR-bantam调控蛹期变态发育的分子机理.[方法]通过...     

意大利蜜蜂工蜂卵巢发育的研究

蜜蜂Apis mellifera L.蜂群中的工蜂卵巢发育和工蜂产卵现象受多种因素控制,了解其影响因素对养蜂生产具有重要意义。本研究将意大利蜜蜂蜂群设置为囚王群(tg1)、无王有子群(tg2)、无王无子群(tg3)以及正常有王蜂群(CK)4个试验组,通过对工蜂卵巢管的显微观察,确定不同处理组工蜂在不同时间段内卵巢的发育情况。结果表明:随着时间的延长,与CK处理组相比,tg3处理组中的工蜂卵巢发育水平最高,tg2次之,tg1最低;在31d时,4个处理组两两之间差异均达到显著水平(P<0.05)。tg1、tg2和tg3处理组中工蜂产卵前期时间分别为35、22和17d,而CK蜂群在试验期内未出现工蜂产卵现象;tg2和tg3处理组的工蜂产卵的封盖前期时间分别为8和6d,而tg1和CK组在试验期内未出现子房封盖现象。蜂群失王时间过长会刺激工蜂卵巢发育,并导致其产卵;蜂群的短期失王和蜂王老化也会刺激工蜂卵巢发育,但是刺激程度较低;蜂群中的蜂子能抑制工蜂卵巢管的发育,因此在蜂群短时间失王时可以适当地补充子脾延缓工蜂卵巢发育。     

中华蜜蜂化学感受蛋白基因Acer-CSP1克隆与表达特征分析

化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)是昆虫化学感受系统中重要的组成部分之一。本研究克隆了中华蜜蜂Apis cerana cerana化学感受蛋白基因Acer-CSP1, 其核苷酸全长351 bp （GenBank登录号为FJ157352）, 编码116个氨基酸残基, 预测蛋白分子量为13.85 kD, 等电点为4.89, 且含有4个保守的半胱氨酸残基, 均符合昆虫CSPs的一般特征, 且与意蜂CSP1基因具有99.1%的相似性, 与其他昆虫也有45.3%~68.0%的相似性。利用2^-ΔΔCt法及绝对定量法的real-time PCR技术对Acer-CSP1在中蜂不同器官表达特征进行了研究, 得出的一致结论为Acer-CSP1显著水平地高丰度表达于中华蜜蜂触角, 其次大量表达于头部。由于触角为中华蜜蜂最主要的嗅觉器官, 而头部则具有发达的感觉神经系统和味觉系统, 这也提示Acer-CSP1极有可能参与中华蜜蜂的嗅觉以及其他化学感受功能。     

气味结合蛋白OBPs在意大利蜜蜂头部表达模式的研究

昆虫气味结合蛋白(OBPs)是脂溶性化学物质的载体,参与了嗅觉识别和化学传输等生理过程.本研究利用MEME在线软件对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica OBPs基因家族21条氨基酸序列进行Motif预测分析;采用RT-PCR初步筛选出在意大利蜜蜂头部表达量较高的OBPs基因,然后利用qPCR技术对筛选出的基因进一步分析其在不同日龄内勤蜂头部的表达情况.结果 表明,在预测获得的6个motif中,motif1为21个OBPs所共有,具有极高的保守性,推测该序列元件可能是意大利蜜蜂OBPs与底物结合的区域;表达谱分析结果表明,13个OBPs基因的凝胶电泳条带明显(即在头部的表达量较高),且大多数基因在4日龄时表达量达到最高值,推测这类蛋白可能参与了幼虫信息素和糖类物质的识别过程.本研究结果丰富了蜜蜂OBPs表达特性的研究数据,同时也为探讨昆虫OBPs广泛的生理功能奠定了基础.     

意大利蜜蜂工蜂唾腺和中肠消化酶活性比较研究

对意大利蜜蜂 Apis mellifera ligustica L工蜂唾腺和中肠中淀粉酶、蛋白酶、蔗糖酶、果胶酶和海藻糖酶5种消化酶进行活性测定,发现巾肠的蛋门酶和蔗糖酶活性较唾腺高,有显著性差异;唾腺的果胶酶活性较中肠高,有显著性差异;唾腺与中肠的淀粉酶和海藻糖酶没有显著性差异.表明意大利蜜蜂工蜂对蔗糖和蛋白的消化主要由中肠分泌的消化酶来完成,唾腺起辅助作用;对果胶的消化主要在唾腺,中肠起辅助作用;而在淀粉和海藻糖的消化过程中唾腺和中肠都有很重要的作用.     

意大利蜜蜂工蜂中肠响应Nosema ceranae胁迫的高表达基因分析

东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae是专性寄生蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌,对意大利蜜蜂(意蜂)具有较强的侵染性。本研究利用RNA-seq技术对正常10 d (Apis mellifera ligustica control group,Am CK)和N. ceranae胁迫10 d的意蜂工蜂中肠(Apis mellifera ligustica treatment group,Am T)进行测序,共得到160 847 237 100条原始读段,过滤后得到1 066 955 298条有效读段。主成分分析结果显示Am CK与Am T测序样品的组内重复性较好,组间的基因表达模式差异明显。GO分类结果显示,Am CK与Am T的前100位高表达基因(HEGs)分别分布于32和33个GO terms,基因富集数最多的均为代谢进程。KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果显示,Am CK的前100位HEGs富集在21个pathways,基因富集数最多的是内吞作用、信号通路和嘌呤代谢; Am T的前100位HEGs富集在26个pathways,基因富集数最多的是内吞作用、RNA转运和蛋白质的内质网加工。前100位HEGs的Venn分析结果显示Am CK与Am T的共有HEGs为87个,特有HEGs分别均为13个。研究结果揭示了N. ceranae胁迫意蜂工蜂中肠过程中的基因表达谱信息,也为解析N. ceranae致病的分子机理提供了有益信息和线索。     

东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-12220及其靶基因的表达谱

东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染成年蜜蜂导致蜜蜂微孢子虫病。本研究旨在验证东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-12220的存在和表达,并检测nce-miR-12220及其靶基因在病原侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica (简称意蜂)工蜂过程的表达谱。Stem-loop RT-PCR和Sanger测序结果显示nce-miR-12220真实存在和表达。靶向预测结果显示nce-miR-12220共靶向KRAB-A和γ tubulin等15个基因。上述靶基因可注释到19个GO条目和3条KEGG通路。RT-qPCR结果显示,相较于接种后1 d (1 day post infection,1 dpi),nce-miR-12220在2 dpi上调表达,而在3-12 dpi阶段总体表现出显著下调表达的趋势。类似地,与1 dpi相比,靶基因KRAB-A在2 dpi上调表达,而在3-12 dpi阶段总体呈下调表达的趋势。另外,与1 dpi相比,靶基因γ tubulin在2-12 dpi阶段总体表现出显著下调表达的趋势。上述结果表明nce-miR-12220与KRAB-A和γ tubulin之间存在潜在的靶向结合和正向调控关系;东方蜜蜂微孢子虫通过下调表达nce-miR-12220抑制KRAB-A的表达进而促进增殖;意蜂工蜂可能通过抑制东方蜜蜂微孢子虫的γ tubulin表达抵御病原侵染。研究结果明确了nce-miR-12220及其靶基因KRAB-A和γ tubulin在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂过程中的动态表达规律,为深入探究nce-miR-12220在病原侵染中的功能及调控机制提供了理论和实验依据。     

王浆主蛋白MRJP7基因在意大利蜜蜂体内的表达

王浆蛋白是蜂王浆生物功能的物质基础,是由王浆蛋白基因家族(mrjps)编码合成的。但部分家族成员如MRJP7在王浆中的含量极少甚至检测不到。基因功能与其在生物体内的时空表达特性相关,为探究mrjp7的生物学功能,本研究利用荧光定量PCR技术对mrjp7在不同发育时期的工蜂和成年工蜂、雄蜂和蜂王的不同组织部位的表达进行定量检测。结果显示mrjp7在成年雄蜂体内的表达水平最低,成年蜂王次之,且在它们的各不同组织部位之间的表达量差异较小。该基因在工蜂幼虫和蛹期的表达同样较低,但在羽化后9日龄前后的哺育蜂王浆腺和头部特异性高表达,这与哺育蜂分泌蜂王浆哺育幼虫和蜂王的功能是相适应的,该结果在转录水平上证实了mrjp7的营养功能,为进一步的研究和应用打下了理论基础。     

ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用

【目的】本研究旨在揭示ame-miR-14在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用。【方法】通过Stem-loop RT-PCR和Sanger测序分别验证ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中的表达和序列真实性。饲喂ame-miR-14的模拟物(mimic-ame-miR-14)和抑制物(inhibitor-ame-miR-14)及其相应的阴性对照mimic-NC和inhibitor-NC对ame-miR-14分别进行过表达和敲降,利用RT-qPCR检测意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中ame-miR-14的表达量。利用生物信息学软件预测ame-miR-14的靶基因并进行相关分析。利用RT-qPCR检测ame-miR-14的过表达和敲降后其靶基因FoxO和Hedgehog在4-6日龄幼虫肠道中的相对表达量。【结果】ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中真实存在和表达。相较于饲喂mimic-NC,饲喂mimic-ame-miR-14后ame-miR-14表达量在意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中均为显著上调;相...     

不同水平亮氨酸对繁殖期意大利蜜蜂蜂群群势及工蜂发育的影响

【目的】评价日粮中不同水平亮氨酸对繁殖期意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica蜂群群势及工蜂发育的影响。【方法】选取重庆荣昌本地繁殖期意大利蜜蜂21群,随机分为7组,分别饲喂添加0,15.30,17.50,26.25,35.00,43.75和52.5 g/kg亮氨酸的试验日粮,每12 d测定各组蜂群群势、封盖子量、蜂群取食量和营造王台情况,24 d后测定蜂群采集行为、工蜂初生重、工蜂虫体蛋白质含量及工蜂寿命。【结果】当亮氨酸添加水平为43.75和52.50 g/kg时能够显著提高繁殖期意大利蜜蜂的蜂群群势、封盖子量、蜂群取食量及采集行为(P0.05)。与空白对照组相比,基础日粮组及各亮氨酸添加组的新出房蜂和6日龄幼虫体蛋白质含量较高(P0.05);各亮氨酸添加组的工蜂初生重显著高于空白组(P0.05);不同亮氨酸添加水平对意大利蜜蜂工蜂寿命影响较小。此外,亮氨酸添加水平26.25,35.00和43.75 g/kg能够在饲喂0-24 d时促进蜂群营造自然王台,刺激蜂群分蜂。【结论】配方日粮中43.75和52.5 g/kg的亮氨酸能够显著促进繁殖期意大利蜜蜂蜂群发展,其中43.75 g/kg的亮氨酸饲喂量还能刺激蜂群营造自然王台,激发蜂群分蜂。     

意大利蜜蜂血淋巴HP19蛋白的表达及功能

昆虫血淋巴蛋白HP19主要参与蜕皮激素调控昆虫的变态及发育进程,蜂群内的工蜂、蜂王和雄蜂具有不同的变态和发育历期,为探究hp19在调控意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica三型蜂变态发育中的作用,本研究利用实时荧光定量PCR技术对hp19在不同发育时期的工蜂、雄蜂和蜂王体内的转录水平进行检测。结果表明,该基因在工蜂和雄蜂3龄幼虫体内表达量分别为参照基因的104和105倍,在5龄幼虫体内的表达则分别降为参照的10和102倍,蛹期表达量又都显著提高。hp19在蜂王整个幼虫期的表达保持在参照的102倍,封盖后逐渐上升,至化蛹前达到参照的105倍。在成年工蜂体内的表达为参照的104倍,而在新羽化蜂王和雄蜂体内表达水平为参照的107倍,但在性成熟的产卵蜂王和雄蜂体内的表达显著降低至参照的104倍。hp19在三型蜂体内这种不同的表达模式说明其不仅与三型蜂差异的变态发育历期有关,还可能与雄蜂和蜂王的生殖有关,具有多样的生物学功能。     

意大利蜜蜂工蜂幼虫nkd基因的生物信息学分析及功能研究

【目的】意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)是西方蜜蜂(Apis mellifera)的亚种之一。蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)侵染意蜂幼虫导致白垩病。本研究对西方蜜蜂裸表皮蛋白(naked cuticle, Nkd)进行保守基序预测和系统进化分析,并通过RNAi明确nkd基因对意蜂工蜂幼虫体重及宿主响应蜜蜂球囊菌胁迫的免疫应答的影响,以期丰富西方蜜蜂基因nkd的信息,并揭示意蜂幼虫nkd的功能。【方法】通过MEME软件预测西方蜜蜂和其他9个物种Nkd蛋白的保守基序。采用MEGA X软件对西方蜜蜂及其他9个物种的Nkd蛋白进行系统进化分析。通过饲喂dsRNA对意蜂幼虫肠道内的nkd进行RNAi。使用电子天平对幼虫进行称重。利用RT-qPCR检测nkd基因的干扰效率及免疫基因的相对表达量。【结果】西方蜜蜂与东方蜜蜂、柑橘凤蝶、家蚕和金凤蝶的Nkd蛋白均含有3个保守基序(motif 1、motif 2 和motif 3),说明上述5个昆虫物种的Nkd具有较高的保守性。西方蜜蜂与东方蜜蜂的Nkd蛋白聚为一支,说明二者的亲缘关系近。与dsRNA-egfp组相比,dsRNA-nkd组5日龄和6日龄幼虫肠道内nkd的表达量均极显著下调(P<0.001),干扰效率分别为49.60%和56.40%。另外,dsRNA-nkd组幼虫体重较dsRNA-egfp组显著下降,说明nkd显著影响幼虫体重。RT-qPCR结果显示,4日龄幼虫肠道内abaecin、apidaecin、birc5、defensin-1和PGRP-S2均被激活表达;5日龄幼虫肠道内abaecin、apidaecin、birc5和defensin-1均被激活表达,PGRP-S2的表达受到抑制;6日龄幼虫肠道内abaecin被激活表达,而apidaecin、birc5、defensin-1和PGRP-S2的表达均受到抑制,说明上述5个免疫基因在宿主响应胁迫的过程中呈不同的表达趋势,均参与宿主的免疫应答,nkd与abaecin和apidaecin的表达存在负向调控关系。【结论】西方蜜蜂的Nkd蛋白含有3个保守基序(motif 1、motif 2和motif 3),西方蜜蜂与东方蜜蜂的Nkd蛋白亲缘关系最近,通过饲喂dsRNA能有效干扰意蜂工蜂幼虫肠道内nkd表达,nkd影响意蜂工蜂幼虫体重及宿主对蜜蜂球囊菌胁迫的免疫应答。     

幼虫信息素中三种酯类对中华蜜蜂和意大利蜜蜂工蜂哺育和封盖行为以及蜂王发育影响

为研究蜜蜂幼虫信息素中3种酯类成分（甲基棕榈酸酯、乙基棕榈酸酯和乙基油酸酯）对中华蜜蜂Apis cerana cerana和意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂哺育行为、封盖行为以及蜂王发育影响, 在人造蜂蜡王台中加入1%和0.1%（w/w）的3种酯类作为实验组, 以不添加酯类（0%）的为对照组, 移入1日龄工蜂幼虫, 测定王台接受率、单个王台中幼虫和王浆重量; 另将分别添加1%和0.1%（w/w）3种酯类的石蜡假幼虫放入工蜂巢房中, 同样设对照组, 测定假幼虫的封盖率; 在新鲜王浆中以1%和0.1%（w/w）分别加入3种酯类作为实验组, 以不添加酯类（0%）的作为对照组, 再分别在1日龄、2日龄和3日龄幼虫王台中加入0.01 mL含有酯类的蜂王浆, 并测定蜂王初生重和卵巢管数量。结果表明: 0.1%甲基棕榈酸酯可以显著提高中蜂和意蜂幼虫重量; 意蜂的甲基棕榈酸酯和乙基油酸酯两个实验组(1.0%, 0.1%)假幼虫封盖率都极显著高于对照组; 乙基油酸酯两个实验组(1.0%, 0.1%)都显著降低了中蜂和意蜂蜂王初生重和卵巢管数量。这说明不同蜜蜂幼虫信息素具有不同的生物学效应。     

西花蓟马化学感受蛋白的cDNA克隆、时空表达分析及组织定位

【目的】研究西花蓟马Frankliniella occidentalis化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)在其嗅觉及化学感受系统中的作用。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆西花蓟马化学感受蛋白基因,用DNAMAN软件进行序列分析,使用BLAST进行同源性比较,采用MEGA6的Neighbor-joining法构建了进化树。通过实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测了西花蓟马不同发育期以及成虫不同组织(触角、头、足、胸、腹)中该基因的表达谱。免疫新西兰大白兔制备了Focc CSP1蛋白抗体,与样品切片中Focc CSP1蛋白以及10 nm胶体金颗粒偶联的羊抗兔二抗反应,经透射电镜观察,对该蛋白在西花蓟马成虫组织中进行免疫定位。【结果】克隆并鉴定了一个西花蓟马化学感受蛋白基因,命名为Focc CSP1(Gen Bank登录号:KM527949)。该基因c DNA序列全长597 bp,完整开放阅读框(ORF)288 bp,编码95个氨基酸,成熟蛋白分子量11.377 k D,等电点4.72,具有化学感受蛋白典型的4个保守半胱氨酸位点特征。Focc CSP1与东亚飞蝗Locusta migratoria Lmig CSP(Gen Bank登录号:CAJ01476.1)的氨基酸序列一致性最高,进化关系最近。Focc CSP1在西花蓟马不同发育阶段和成虫不同组织中均有表达,在羽化1 d的雌虫中相对表达量最高,其次是2龄若虫,蛹和成虫后期表达量最低;在触角和足中相对表达量较高。成功构建了重组表达质粒p ET-30a/Focc CSP1,并诱导表达,经Ni柱纯化,获得目的蛋白;免疫定位表明,该蛋白在西花蓟马触角、足、头等部位血淋巴中均大量存在。【结论】明确了西花蓟马化学感受蛋白基因Focc CSP1的核苷酸、氨基酸序列特征。Focc CSP1广泛分布在西花蓟马多个组织及各个发育期,据此推测该基因可能在西花蓟马嗅觉识别、感受机械刺激以及调节生长发育等方面扮演重要角色。     

雌性意大利蜜蜂复眼形态发育及其视蛋白基因的表达

【目的】复眼作为大多数昆虫最重要的视觉器官,其小眼数量和体积大小一定程度上反映了昆虫视觉能力的强弱。视蛋白作为视觉感知中的功能性分子,在光信号转导过程中具有重要作用,基因的表达受到外源和内源等多种因素的影响。本研究旨在探讨蜂王和工蜂复眼形态发育及视蛋白基因的时间表达模式。【方法】选取3群群势相当的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica蜂群进行人工育王,采集蜂王与工蜂蛹期各日龄蜂蛹及新蜂样品,采用扫描电镜技术观察蜂王和工蜂复眼的外部形态结构,利用Image J软件测量复眼短长轴、面积、小眼个数、小眼面积和小眼直径;采用实时定量PCR技术检测蜂王和工蜂蛹期紫外光视蛋白基因（UV-sensitiveopsin,UVop）、绿光视蛋白基因（Greenopsin,Lop1）和蓝光视蛋白基因（Blue-sensitive opsin,BLop）3种视蛋白基因的mRNA表达水平。【结果】蜂王和工蜂均是在蛹期末龄（出房前）分化出小眼;出房后,蜂王和工蜂复眼面积均变小（P＜0.001）,蜂王复眼短轴（P＜0.05）、面积（P＜0.001）、小眼个数（P＜0.001）均显著小于工蜂,但...     

ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中靶基因CYP450和FG的表达

【目的】本研究旨在通过饲喂ame-miR-79的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减,探究ame-miR-79对幼虫肠道内靶基因表达的调控作用。【方法】通过分子克隆与Sanger测序验证意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的序列真实性。通过饲喂mimic-miR-79和inhibitor-miR-79对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减。采用相关生物信息学软件进行ame-miR-79的靶基因预测与分析。通过RT-qPCR检测ame-miR-79的过表达和敲减效果及过表达和敲减ame-miR-79后靶基因的相对表达量。【结果】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在。与无义模拟物(nonsense mimic, mimic-NC)组相比,mimic-miR-79组的4-6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量皆极显著上调;与无义抑制物(nonsense inhibitor, inhibitor-NC)组相比,inhibitor-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量显著下调,6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量极显著下调。ame-miR-79共靶向303个基因,涉及27个GO条目和179条KEGG通路。相较于mimic-NC组,靶基因细胞色素P450基因CYP450在mimic-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内均极显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达;靶基因fringe糖基化转移酶(fringe glycosyltransferase, FG)基因在4日龄幼虫肠道内下调表达,在5日龄幼虫肠道内显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达。相较于inhibitor-NC组,CYP450在inhibitor-miR-79组的4日龄幼虫肠道内极显著上调表达,在6日龄幼虫肠道内上调表达,而在5日龄幼虫肠道内下调表达;FG的表达水平在4日龄幼虫肠道内显著上调,在5和6日龄幼虫肠道内极显著上调。【结论】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在;通过饲喂模拟物和抑制物能分别实现意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的有效过表达和敲减;ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内CYP450和FG的表达。     

意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam对靶基因USP和P300的表达调控

【目的】本研究旨在通过饲喂法对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam进行过表达与敲减,明确ame-miR-bantam对靶基因USP和P300表达的调控作用。【方法】通过饲喂ame-miR-bantam模拟物(mimic-ame-miR-bantam)和抑制物(inhibitor-ame-miR-bantam)及相应的阴性对照mimic-NC-ame-miR-bantam和inhibitor-NC-ame-miR-bantam,对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道组织中的ame-miR-bantam分别进行过表达和敲减。利用生物信息学软件进行ame-miR-bantam的靶向预测及分析。通过RT-qPCR检测4-6日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam的过表达和敲减效果及靶基因USP和P300的相对表达量。【结果】相较于饲喂mimic-NC-ame-miR-bantam,饲喂mimic-ame-miR-bantam后,ame-miR-bantam在意大利蜜蜂4-6日龄工蜂幼虫肠道中均显著上调;相较于饲喂inh...     

中华蜜蜂及意大利蜜蜂气味结合蛋白OBP12的基因克隆与差异表达分析

【目的】克隆获得中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称中蜂)和意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称意蜂)的气味结合蛋白基因OBP12序列,并对两蜂种的蛋白结构进行预测,明确该基因在两蜂种不同组织和发育阶段的表达差异。【方法】分别以中蜂和意蜂的触角cDNA为模板,采用RT-PCR技术扩增和克隆获得OBP12cDNA全长序列,并利用生物信息学软件对其编码蛋白的理化特性、结构特征和系统进化进行分析;采用qRT-PCR技术对OBP12在中华蜜蜂和意大利蜜蜂不同发育阶段(1、5、10、15、20、25、30日龄)各组织(触角、头、胸、腹、足和翅)中mRNA的表达情况进行比较分析。【结果】成功获得了AcerOBP12和AmelOBP12的完整开放阅读框ORF序列,全长均为453bp,共编码150个氨基酸,预测分子量分别为17.76 ku、17.42 ku;N-末端均有一段含22个氨基酸的信号肽,无跨膜结构;均含有6个保守的半胱氨酸位点,属于Classical OBP亚家族。两蛋白均包含6个α螺旋,且由Cys组成的3个二硫键连接在一起。系统进化树分析表明,中华蜜蜂AcerOBP12首先与意大利蜜蜂AmelOBP12聚在一起,再与同为膜翅目的回条蜂HlabPBPGp-9-like、印度跳蚁HsalPBPGp-9-like、阿根廷蚁LhumPBPGp-9-like和小火蚁WaurPBPGp-9-like聚为一类。荧光定量PCR结果显示,OBP12在中、意蜂不同发育阶段各组织中均有表达,且触角中的表达量极显著高于其他组织(P0.01);其他组织中,翅膀和足的表达量相对较高,头、胸和腹中呈微量表达。此外,OBP12在意蜂不同发育阶段各组织的表达量均高于中蜂。【结论】AcerOBP12和AmelOBP12均属于Classical OBP亚家族,推测其为信息素气味结合蛋白PBP。组织表达谱结果暗示,OBP12除广泛参与嗅觉相关行为之外,还可能参与味觉识别过程。