昆虫滞育关联热休克蛋白的研究进展

滞育是昆虫逃避不利环境条件的基本方式之一, 益虫的合理利用和害虫的综合治理, 都离不开对滞育调控机理的研究。滞育可以诱导一些基因表达模式的改变, 如热休克蛋白基因的差异表达, 导致昆虫抗逆性增强。本文综述了与昆虫滞育关联的热休克蛋白的研究概况, 从热休克蛋白与滞育的关联、 不同虫态滞育期间热休克蛋白基因的差异表达和滞育相关的蛋白质组学研究几个方面进行了概述。与其他的胁迫反应均诱导热休克蛋白同步上调表达不同, 热休克蛋白在不同种类昆虫以及同种昆虫的不同滞育生理阶段的表达模式差别很大。热休克蛋白在滞育期间的表达是决定越冬抗逆性和存活的重要因子之一。本文可为昆虫滞育如何应答环境条件刺激的研究提供参考信息。     

棉铃虫β-catenin基因的克隆、表达分析及真核表达载体构建

β-catenin基因是生物进化上高度保守的基因,是Wnt/β-catenin信号通路中的重要组分。本研究通过RACE方法获得了棉铃虫β-catenin基因的全长c DNA序列,命名为Har-β-catenin(Gen Bank登录号为KJ206237)。其开放阅读框长2382 bp,编码793个氨基酸残基。与已报道的其它物种β-catenin蛋白相似,Har-β-catenin蛋白具有多个ARM重复结构域。运用RT-PCR的方法比较滞育和非滞育蛹脑中Har-β-catenin基因的表达情况,结果表明非滞育蛹脑中Har-β-catenin基因的表达水平高于滞育蛹脑。最后,我们构建了包含Har-β-catenin全长编码区的真核表达载体并调查了Har-β-catenin的亚细胞定位情况。这些结论为我们进一步研究Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫滞育中的作用奠定了基础。     

棉铃虫Hsp70的多克隆抗体制备及鉴定

HSPs(热休克蛋白)是机体在不利环境条件刺激下合成的一类蛋白质,在进化上高度保守,普遍存在于生物体,其中Hsp70是最为保守的成员。研究发现,昆虫滞育过程中普遍存在Hsp70表达上调的现象。然而,现有的研究均是在基因水平的检测结果。为了能从蛋白水平检测棉铃虫中Hsp70的表达,本研究制备了棉铃虫Hsp70的多克隆抗体。构建了hsp70的原核表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,重组蛋白经镍柱纯化后免疫兔子,制备了棉铃虫Hsp70的多克隆抗体。抗体的效价较高,达到了1∶256 000,此外Western结果表明,制备的抗体能检测出热诱导的Hsp70蛋白。本研究制备了高效价且较为特异的Hsp70对克隆抗体,该抗体为后续从蛋白水平研究棉铃虫滞育过程中Hsp70的表达及其分子机制奠定了基础。     

热休克因子1活性的调控机制

热休克因子1(HSF1)是调控热休克蛋白(HSPs)表达的核心转录因子,可被热应激、氧化应激、缺氧/血、pH下降等刺激因素激活,与靶基因的热休克元件特异性结合,增强HSPs表达,发挥内源性保护作用.HSF1活性的调控发生在HSF1三聚化、转位入核、结合DNA和调节转录等多个环节,受到分子伴侣蛋白、磷酸化作用、氧化-还原等机制共同调控,其复杂而精确的调控对于应激应答、生长发育等过程有重要意义.     

基于转录组的葱蝇表皮蛋白基因家族的鉴定及在非滞育和冬滞育条件下的表达分析

【目的】昆虫表皮蛋白在昆虫的生长发育、抑制水分蒸发和抵御其他外界不良环境等方面起到重要的作用。通过转录组水平上葱蝇Delia antiqua表皮蛋白基因家族的鉴定及部分基因在非滞育和冬滞育条件下的表达规律分析,为进一步研究葱蝇表皮蛋白在滞育期的抗逆功能奠定基础。【方法】基于转录组数据,通过生物信息学方法对葱蝇表皮蛋白基因进行鉴定分析,系统进化和保守结构域分析并采用实时荧光定量PCR法比较分析了12个基因在葱蝇非滞育和冬滞育不同发育时期的表达变化。【结果】在葱蝇中鉴定出81个表皮蛋白基因,分别属于RR(71个基因)、CPAP(5个基因)和CPLC(5个基因)亚家族,其编码的蛋白质含有92~495个氨基酸,分子量约为8.692~52.2 k D,等电点为3.90~9.93。亚细胞定位预测结果显示67个全长表皮蛋白均为外分泌型。12个葱蝇表皮基因在非滞育和冬滞育过程中有明显不同的表达规律。【结论】葱蝇表皮蛋白基因RR-2型的保守基序中发生了基因突变,引起关键氨基酸的替换,这可能暗示它们在非滞育和滞育不同条件下,不同发育阶段中蛹皮结构重建和某些器官的发生方面发挥不同作用。该研究结果为进一步阐明葱蝇滞育蛹皮结构及抗逆功能的研究提供了重要理论基础。     

水稻热休克转录因子OsHSF13的克隆与生物信息学的初步分析(简报)

环境刺激的信号转导是植物信号转导的一个重要研究方向。热激反应(heat-shockresponse,HSR)是动植物细胞或器官在遇到外界热刺激时所产生的一种保护性反应,是正常的蛋白质合成受阻时产生热激蛋白(heat-shockprotein,HSP)的一种细胞生理活动,其表达通过热休克转录因子(heat-shock factor,HSF)来进行调控[1]。编码热激蛋白基因的启动子区域存在着一段保守的DNA序列,是热休克转录因子的结合位点(heat-shockelement,HSE)。当植物受到外界的热刺激时,HSF可以与HSE特异性结合,激活热激蛋白基因的表达,     

麦红吸浆虫热激蛋白基因SmHsp40的克隆及其在滞育进程中和极端温度胁迫下的表达

【目的】麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana是一种典型的专性滞育昆虫,滞育过程中经历酷暑和严寒。本研究旨在探讨麦红吸浆虫热激蛋白基因Hsp40在滞育中的作用。【方法】以麦红吸浆虫滞育前幼虫为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆Hsp40全长cDNA序列;利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白的特性;采用实时荧光定量PCR技术分析其在滞育不同阶段幼虫及越夏滞育幼虫在短期(≤120 min)极端高温(35～50℃)和越冬滞育幼虫在短期极端低温(0～-15℃)胁迫下的表达模式。【结果】克隆获得麦红吸浆虫Hsp40基因,命名为SmHsp40(GenBank登录号:MH001167),其cDNA全长1 553 bp,开放阅读框长为1 074 bp,编码357个氨基酸,相对分子量为40.87 kD,理论等电点为5.31。推导的氨基酸序列中含有Hsp40蛋白家族典型的J结构域和HPD基序。蛋白序列相似性和系统进化关系分析表明,SmHsp40蛋白与冈比亚按蚊Anopheles gambiae等长角亚目(Nematocera)昆虫Hsp40的相似性最高、亲缘关系最近。麦红吸浆虫滞育不同时期幼虫SmHsp40表达量存在显著差异,进入滞育后表达量上调;滞育进程中,夏季7-8月和冬季12月至翌年1月表达量显著高于其他季节。与未处理的对照相比,40℃处理越夏滞育幼虫和-10℃处理越冬滞育幼虫1 h明显诱导SmHsp40的表达,但超过45℃或低于-15℃极端温度处理诱导效果均不明显。【结论】SmHsp40参与了麦红吸浆虫滞育进程,可能在滞育状态的维持及滞育期间耐热和耐寒能力的调控方面起重要作用。     

棉铃虫腺苷酸转移酶基因的克隆与分析

腺苷酸转移酶(ANT)是线粒体内膜上负责能量分子传导的转运蛋白, 在细胞凋亡调控网络中有重要作用。本研究以棉铃虫幼虫组织的mRNA为模板, 根据鳞翅目昆虫ant基因编码区保守序列设计引物, 进行RT-PCR分析, 同时结合5′、3′ RACE方法扩增出棉铃虫ant基因的全长cDNA序列, cDNA全长为1 190 bp (GenBank登录号AY253868), 具有完整的开放阅读框架(ORF, 133~1 033 bp), 编码蛋白为300个氨基酸, 其中N端22个氨基酸为信号肽, 引导ANT蛋白定位于线粒体内膜。该蛋白具有3个保守的线粒体穿膜功能结构域, 形成能量分子传导的转运通道, 催化细胞质中ADP和线粒体内ATP间进行跨膜交换。通过与其他昆虫的腺苷酸转移酶蛋白序列比较, 发现该基因具有高度的保守性, 氨基酸序列同源性都在90%左右。     

滞育和非滞育棉铃虫血淋巴中蛋白质含量及图谱的比较

昆虫在滞育期间和非滞育期间,由于某些器官的生理功能产生差异,致使血淋巴中的化学成份发生了量或质的变化,特别是蛋白质的变化,如在浦育的马铃薯叶甲Leptinotarsadecemlineata[1,2]及西南玉米杆草螟Diatraeagrandiosella[3,4]的血淋巴中,均发现了特殊蛋白质,即滞育蛋白。为了弄清滞育棉铃虫Helicoverpaarmigera的血淋巴中是否也出现滞育蛋白或与滞有相关联的蛋白,及注定滞育和非滞育棉铃虫在不同发育阶段中蛋白质含量的变化和谱带特征,以进一步探索棉铃虫滞育的生理生化机制,我们通过电泳等手段对不同时期的滞育和非滞育棉铃虫…     

热休克转录因子1与机体耐热性的相关研究

热休克转录因子1(HSF1)能够启动各种热休克蛋白基因的诱导表达,这对防止机体免受热应激损伤具有重要的意义。从HSF1的结构、功能及活化过程等几个方面阐述了HSF1的生理特征及其与机体耐热性能之间的关系。     

棉铃虫Wnt-1基因克隆、多克隆抗体制备及在滞育和非滞育蛹脑中的表达检测

【目的】Wnt1蛋白是Wnt/β-catenin信号通路的重要成员。本研究旨在克隆棉铃虫Helicoverpa armigera Wnt1基因,制备多克隆抗体,进而从蛋白水平初步研究该蛋白在滞育和非滞育蛹脑中的表达情况。【方法】通过RACE的方法克隆棉铃虫Wnt1基因。根据获取的序列构建Wnt1的真核表达载体并调查其亚细胞定位,同时构建原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达、纯化后免疫兔子,制备多克隆抗体。最后用Western blot的方法检测Wnt1蛋白在两种发育状态蛹脑中的表达情况。【结果】成功克隆了棉铃虫Wnt1基因(Gen Bank登录号为KJ206240)。Wnt1定位在细胞质,通过镍柱纯化获得了较纯的重组蛋白。制备的Wnt1抗体效价高达1∶625 000。Western blot结果表明滞育蛹脑中Wnt1蛋白水平明显低于非滞育蛹脑。【结论】获得了高效价的棉铃虫Wnt1多克隆抗体。我们的结果表明滞育蛹脑中Wnt/β-catenin通路很有可能受到抑制。本研究结果为进一步深入研究棉铃虫Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫发育中的作用奠定了基础。     

葱蝇热激蛋白DaHSP23基因的克隆及在冬滞育和夏滞育蛹中的表达分析

[目的]低分子量(12 ～43 kDa)热激蛋白(sHSPs)具有抗逆应答的功能,滞育是昆虫抵抗不良环境的特殊发育形式,但sHSPs在昆虫滞育发育过程中的作用仍不清楚.本研究克隆和特征化葱蝇Delia antiqua sHSP基因,并研究它在夏滞育和冬滞育发育过程中的表达模式,为阐明sHSPs在滞育发育上的功能奠定基础.[方法]通过RACE-PCR方法克隆了葱蝇HSP23基因,通过相似性比较分析了其特征、结构域及与双翅目代表性同源基因的系统发育关系;采用实时荧光定量PCR研究了该基因在葱蝇冬滞育蛹和夏滞育蛹发育过程中的表达情况,通过表达的差异比较揭示了该基因与滞育发育的关系.[结果]克隆出了葱蝇HSP23基因,命名为DaHSP23(GenBank登录号:HQ392521.1),其cDNA全长序列为904 bp,编码186个氨基酸,推测蛋白分子量为20.9 kDa,等电点为6.42.该基因的编码蛋白与其他双翅目昆虫的sHSPs有超过66％的氨基酸序列一致性,与已报道的其他双翅目昆虫的滞育相关HSP23基因同源.基因组测序显示该基因无内含子.DaHSP23基因在葱蝇非滞育蛹的发育过程中一直保持在较低的水平,各发育阶段间的表达量不存在显著差异.但在冬滞育和夏滞育蛹中,该基因从滞育起始期开始逐渐显著升高表达,到滞育维持期的中后期达到峰值,在滞育终止期逐渐降到较低的水平.[结论]DaHSP23基因在葱蝇冬滞育和夏滞育发育过程中明显上调表达,但存在差异,它在滞育期的调控可能是种专化的.DaHSP23可能在葱蝇两种类型的滞育上起重要作用.     

棉铃虫剂量补偿相关基因Hamsl1的鉴定与功能分析

【目的】棉铃虫Helicoverpa armigera的剂量补偿(dosage compensation, DC)分子机制尚不清楚。本研究旨在通过克隆棉铃虫雄性特异性致死(male specific lethal, msl) 基因Hamsl1,利用RNA干扰技术明确其是否参与调控棉铃虫剂量补偿。【方法】利用RT-PCR同源克隆棉铃虫Hamsl1基因全长cDNA; 利用qPCR技术研究Hamsl1基因在棉铃虫不同发育时期的表达谱;通过显微注射Hamsl1 siRNA到棉铃虫3龄幼虫中对Hamsl1基因进行RNA干扰后,利用qPCR技术检测15个Z染色体基因的表达情况,分析Hamsl1是否调控Z染色体基因剂量。【结果】成功克隆了棉铃虫Hamsl1基因的cDNA序列,鉴定出Hamsl1基因mRNA存在2种剪接体,分别命名为Hamsl1a(GenBank登录号: MK564008)和Hamsl1b(GenBank登录号: MK564009)。功能域分析发现HaMSL1含有典型的PEHE和coiled-coil功能域,具有MSL1蛋白的特征。qPCR分析表明,Hamsl1基因位于棉铃虫Z染色体上;棉铃虫Hamsl1a与Hamsl1b基因表达均具有发育时期特异性,在成虫期表达量最高,且雌雄化蛹后基因表达量差异显著,具有性别特异性。通过同源比对和qPCR分析,在DNA水平鉴定了15个Z染色体候选基因。显微注射Hamsl1 siRNA于3龄幼虫体内72 h,干扰效率为36.01%~64.27%,并未发生雄性致死现象;与对照组相比,Hamsl1 RNAi处理组中棉铃虫15个Z染色体基因在雄性个体中整体呈现表达量上调趋势,而在雌性个体中平均表达水平差异不显著。【结论】本研究初步探明Hamsl1基因位于棉铃虫Z染色体上,且该基因可能通过抑制雄性棉铃虫Z染色体基因表达,调控棉铃虫Z染色体剂量补偿。本研究为深入研究棉铃虫剂量补偿分子机制和绿色防控棉铃虫提供了理论基础。     

热休克蛋白的生物学作用和转录水平调控研究进展

热休克蛋白（HSP）具有广泛的生物学功能,其表达方式有两种：一种是诱导性表达,即当生物细胞受到刺激时才进行表达,另一种是组成性表达,即在生物,细胞的正常生活,代谢过程中表达。HSP的这两种表达式意味着HSP基因表达的调控方式和机理不同。本文简要介绍了热休克因子（HSF）的种类,结构及调控HSP基因表达的机理,HSF通过以下4个步骤调节HSP基因：（1）HSF由单体形式变成磷酸化的三聚体形式被激活;（2）三聚体形成式的HSF与HSP基因的热休克元件（HSE）上相邻排列的3个5′－GAA－3′结合,（3）与HSF结合后,HSE的活化域暴露,HSP基因转录;（4）HSP的mRNA5′端前导芪的特异结构适合于核糖体快速结合和高效翻译,不同生物体内的HSF作用有一定差异,功能较为明确的有：（1）对应激信号敏感的HSF1;（2）对应激信号不敏感,对生长,发育,分化信号敏感的HSF2;（3）起抑制HSP基因转录作用的HSF4。还有一些HSF（如HSF3）的作用机制较复杂,有待深入研究。此外,本文也简单介绍了HSP在衰老,免疫应答,细胞生存和凋亡平衡等中的作用,对了解和认识生物生长,发育,衰老,保护,免疫应答及细胞生存和凋亡平衡的分子机制有一定帮助。     

柞蚕蛹解除滞育过程中海藻糖合成酶基因的表达变化

【目的】克隆柞蚕Antheraea pernyi海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)基因,并对其进行组织表达分析,探讨该基因在柞蚕滞育蛹解除滞育过程中的表达规律,为阐明柞蚕滞育期间碳水化合物代谢规律与蛹滞育解除的关系提供数据支持。【方法】利用PCR及3'RACE技术从柞蚕幼虫脂肪体组织中克隆得到TPS基因,并进行生物信息学分析;RT-PCR检测该基因在柞蚕幼虫各组织中的表达分布,进一步采用Real-time PCR分析柞蚕滞育蛹解除滞育过程中该基因在脂肪体组织和血淋巴中的表达量变化。【结果】克隆获得柞蚕海藻糖合成酶基因并命名为ApTPS。其开放阅读框长2 487 bp,编码828个氨基酸,蛋白预测分子量为93.19 k D,等电点(p I)4.61;无信号肽,无跨膜区。蛋白质亚细胞定位预测该蛋白定位于细胞质中;蛋白质结构域分析表明,ApTPS有两个保守功能区:TPS(第22-497位氨基酸)和TPP(第532-772位氨基酸)。组织特异性分析表明,ApTPS基因在柞蚕幼虫脂肪体中表达量最高;柞蚕解除滞育过程中,ApTPS在脂肪体和血淋巴中的表达量均有所升高,且显著高于对照组(P0.05),但血淋巴中表达量的升高滞后于脂肪体。【结论】结果提示ApTPS参与了柞蚕蛹滞育中碳水化合物代谢调控并在其中发挥重要作用,与柞蚕蛹滞育解除关系密切。     

葱蝇热激蛋白DaHSP23基因的克隆及在冬滞育和夏滞育蛹中的表达分析（英文）

【目的】低分子量（12~43 kDa）热激蛋白(sHSPs)具有抗逆应答的功能,滞育是昆虫抵抗不良环境的特殊发育形式,但sHSPs在昆虫滞育发育过程中的作用仍不清楚。本研究克隆和特征化葱蝇Delia antiqua sHSP基因,并研究它在夏滞育和冬滞育发育过程中的表达模式,为阐明sHSPs在滞育发育上的功能奠定基础。【方法】通过RACE-PCR方法克隆了葱蝇HSP23基因,通过相似性比较分析了其特征、结构域及与双翅目代表性同源基因的系统发育关系;采用实时荧光定量PCR研究了该基因在葱蝇冬滞育蛹和夏滞育蛹发育过程中的表达情况,通过表达的差异比较揭示了该基因与滞育发育的关系。【结果】克隆出了葱蝇HSP23基因,命名为DaHSP23（GenBank登录号：HQ392521.1）,其cDNA全长序列为904 bp,编码186个氨基酸,推测蛋白分子量为20.9 kDa,等电点为6.42。该基因的编码蛋白与其他双翅目昆虫的sHSPs有超过66%的氨基酸序列一致性,与已报道的其他双翅目昆虫的滞育相关HSP23基因同源。基因组测序显示该基因无内含子。DaHSP23基因在葱蝇非滞育蛹的发育过程中一直保持在较低的水平,各发育阶段间的表达量不存在显著差异。但在冬滞育和夏滞育蛹中,该基因从滞育起始期开始逐渐显著升高表达,到滞育维持期的中后期达到峰值,在滞育终止期逐渐降到较低的水平。【结论】DaHSP23基因在葱蝇冬滞育和夏滞育发育过程中明显上调表达,但存在差异,它在滞育期的调控可能是种专化的。DaHSP23可能在葱蝇两种类型的滞育上起重要作用。