茶树CsDREB-A1转录因子基因的克隆及其特性分析

基于茶树品种‘迎霜’（Camellia sinensis‘Yingshuang’）的转录组数据,采用PCR方法从其基因组DNA中克隆获得编码DREB转录因子的CsDREB-A1基因。结果显示：该基因的开放阅读框（ORF）长度为585 bp,编码194个氨基酸,该氨基酸序列即为CsDREB-A1转录因子。CsDREB-A1转录因子的N端含有AP2/ERF家族转录因子典型的AP2 DNA保守结合结构域,其中包含保守的YRG元件和WLG基序,且其第14位和第19位分别为缬氨酸和谷氨酸,该结构域的上、下游分别有PKK/RPAGRx KFx ETRHP和DSAW特征序列。通过进化分析可知CsDREB-A1转录因子属于AP2/ERF家族中DREB亚族的A1组,其与茶树CBF转录因子的相似性较高,与拟南芥〔Arabidopsis thaliana（Linn.）Heynh.〕等植物的DREB类转录因子也有较高的相似性。CsDREB-A1转录因子为亲水性蛋白,理论相对分子质量为21 165.4,理论等电点为p I 9.56,碱性、酸性、芳香族和脂肪族氨基酸比例分别为18%、10%、6%和18%;该转录因子只有1个包含53个氨基酸的无序化区域,且大部分无序化氨基酸位于AP2DNA保守结合结构域内,无序化氨基酸的比例为27.32%;在CsDREB-A1转录因子的三级结构中,N端有1个α螺旋、C端有3个β折叠。研究结果显示：CsDREB-A1转录因子可能与茶树的抗寒性相关。     

漾濞大泡核桃WRKY转录因子基因JsWRKY1的克隆及表达特性分析

WRKY转录因子普遍存在于植物体内,在植物的抗病防御反应中起重要作用。本实验基于漾濞大泡核桃（Juglans sigillata）中编码WRKY转录因子的EST序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到一个新的脓Ky基因的全长cDNA序列,命名为JsWRKY1（KJ170895）。JsWRKY1的cDNA全长为1012bp,含有564bp的开放阅读框,154bp 5’-非翻译区以及294bp的3＇-非翻译区,编码具有187个氨基酸的蛋白质。JsWRKY1编码的氨基酸序列与已知植物WRKY家族成员间的同源性和聚类分析表明JsWRKY1与来源于可可树（Theobroma cacao）和大豆（Glycinemax）中的wRKY相似性较高,属于IIc类wRKY。qRT-PCR分析结果显示,信号分子水杨酸、茉莉酸、H2O2和乙烯处理可以不同程度地诱导漾濞大泡核桃叶片中JsWRKY1的表达。此外,接种胶孢炭疽菌后JsWRKY1的表达量迅速上升,在接种后4h时达到最高水平,之后表达量逐渐下降,暗示JsWRKY1参与漾濞大泡核桃抗胶孢炭疽菌的防卫反应。     

大豆MYB转录因子基因GmMYB174的克隆及分子特性分析

克隆获得了大豆转录因子MYB基因GmMYB174,该基因序列全长1086 bp,编码361个氨基酸,属于MYB-related家族。生物信息学分析表明大豆GmMYB174与番茄、苜蓿、葡萄等物种同源性较高,序列分析表明包含2个保守的Trp(W)位点和1个保守基序SHAQKFF。亚细胞定位结果显示GmMYB174定位于细胞核中;组织表达量显示GmMYB174在多个组织均有表达,其中在上胚轴中表达量最高。启动子元件分析表明GmMYB174包含ABRE、MYB、MYC、LTRE、GT-1等逆境胁迫应答元件。实时荧光定量PCR分析表明Gm MYB174在干旱、盐、ABA处理下均有响应。因此,GmMYB174可能参与多种胁迫应答途径。     

中华蜜蜂Malvolio基因 Acmvl 的克隆及组织表达分析

【目的】本研究克隆了中华蜜蜂Apis cerana cerana Malvolio (Mvl)基因的cDNA序列,分析了其编码蛋白的结构特点,并探讨其mRNA在内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂各部位组织中的表达差异,以期为该基因的生物学功能研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术从中华蜜蜂内勤蜂头部组织中扩增和克隆获得Acmvl的全长序列,并采用多种生物信息学软件分析Acmvl蛋白的结构特征;采用Real-time PCR对中华蜜蜂Acmvl在内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂各组织中的表达特征进行分析。【结果】Acmvl基因cDNA全长为2 130 bp（GenBank登录号：KP662686）,编码587个氨基酸,预测该蛋白分子量为65.86 kD,等电点为6.03,无信号肽,存在11个跨膜结构域、9个糖基化位点和14个潜在磷酸化位点;系统发育树分析结果显示,中华蜜蜂Acmvl与其他膜翅目昆虫Malvolio聚为一支,与小鼠Mus musculus和人Homo sapiens Nramp家族的Nramp2聚为另一大分支,且与小鼠、水稻 Oryza sativa 、黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 和酵母Saccharomyces cerevisiae的Nramp家族同源体在跨膜区、跨膜区带电残基及转运蛋白特征结构域上有很高的保守性,尤其是与Nramp2。Acmvl 基因在中华蜜蜂各部位组织中均有表达,但高表达于内勤蜂的胸部及采蜜蜂和采粉蜂的腹部和足部,提示该基因表达的差异影响采集行为。【结论】Acmvl 属于Nramp基因家族,可能为Nramp2的同源基因,该基因影响采集行为可能与转运Cu²⁺, Mn²⁺和Fe²⁺（尤其是Fe²⁺）有关。     

转录因子AP-4基因真核表达载体构建及表达分析

本研究利用生物信息学分析AP-4与胃癌患者临床病理信息的相关性,根据GenBank中人AP-4基因cDNA序列设计并合成特异性引物,以胃癌细胞总RNA逆转录的cDNA为模板,利用高保真酶扩增AP-4基因CDS (Coding DNA sequence)序列并构建入pcDNA3.1+载体,并通过限制性内切酶酶切分析和测序法进行进一步验证;脂质体法将AP-4重组表达载体及对照pcDNA3.1+载体转染胃癌细胞,qRT-PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction)和Western blotting检测分别检测AP-4在m RNA和蛋白水平的表达。生物信息学分析发现,AP-4的表达与胃癌分期及预后显著相关;酶切及测序分析表明,转录因子AP-4真核表达载体构建成功,并能够在胃癌细胞中实现转录和蛋白水平的高效表达。此研究为深入研究转录因子AP-4在胃癌等肿瘤发生发展中的作用及分子机制奠定了基础。     

玉米转录因子ZmERF1的克隆及表达分析

ERF类转录因子是乙烯信号转导途径中的下游响应因子,参与乙烯调控的多种生理生化反应。从玉米自交系丹232授粉后20 d的胚乳中克隆了一个ERF类转录因子ZmERF1,并对其进行了序列及表达分析。结果显示,ZmERF1基因全长811 bp,ORF 690 bp,编码230个氨基酸,包含一个典型的AP2结构域,含有3个α-helix和1个β-sheets,亚细胞定位于细胞核中。进化树分析表明该基因与单子叶高粱SbERF和水稻Os ERF同源性较高。在体外原核表达系统中能够检测到重组蛋白His-ZmERF1,并用Western Blot验证了所表达蛋白为重组蛋白,表明该基因具有体外活性。荧光定量PCR分析表明该基因在胚乳发育的前期表达量较少,后期(36 d)表达量较高。进一步对胚乳总蛋白的定量Western Blot分析,表明该蛋白在胚乳发育后期积累量高于发育前期。因此,初步推测玉米ZmERF1可能在籽粒胚乳发育后期发挥重要作用。该研究结果为了解该基因家族转录因子并进一步阐明其生物学功能提供了依据。     

甜瓜CmERFIII-1转录因子基因cDNA的克隆与表达分析

根据甜瓜ERF亚家族成员聚类结果,选取第三亚群的Cm ERFIII-1(甜瓜基因组数据库登录号MELO3C005465)基因为研究对象,根据其c DNA序列设计基因特异引物,应用RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜果实的总RNA中克隆得到Cm ERFIII-1基因c DNA,序列长711 bp,编码236个氨基酸组成的多肽。序列比对及系统发育分析表明,Cm ERFIII-1 c DNA编码的蛋白质氨基酸序列与黄瓜中ERF亚家族两个成员的序列(Gen Bank登录号:XP_004143677.1、XP_004158119.1)亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因在甜瓜根、茎、叶和授粉后不同时期果实中均有不同程度表达,在叶片中表达量最高。     

中华蜜蜂气味受体基因AcerOr167的克隆及表达分析

本研究通过RT-PCR获得中华蜜蜂气味受体基因Or167的cDNA序列,并采用多种生物信息学软件对其结构特征进行预测分析;利用荧光定量PCR检测Acer Or167 m RNA在工蜂羽化后不同发育阶段(1、5、10、15、20、25和30日龄)和不同组织(触角、头、胸、腹、足、翅)中的相对表达量。克隆获得中华蜜蜂Or167的c DNA序列,命名为Acer Or167(Gen Bank登录号为KF239369),其全长1311 bp,编码436个氨基酸,预测有5个跨膜结构域;多序列比对结果显示,中华蜜蜂Acer Or167与西方蜜蜂Amel Or167的一致性最高,达94%,而与毕氏粗角蚁Cbir Or4-like的一致性最低,为49%;荧光定量结果显示,Acer Or167 m RNA在成蜂不同发育期的各个组织中均有表达,且触角中的表达量极显著高于其它各个组织(P0.01),在头、胸、腹、足、翅中有少量表达;从触角不同发育阶段的表达情况来看,1日龄表达量最低,5日龄表达量显著升高,20日龄表达量最高,且极显著高于其它各日龄(P0.01)。推测Acer Or167可能在中华蜜蜂的嗅觉识别系统中起着重要的作用,与中华蜜蜂外出采集,识别花香气味有关。本研究为进一步深入研究中华蜜蜂传统气味受体的功能奠定理论基础。     

中华蜜蜂气味受体基因AcOr10的克隆及表达分析

【目的】中华蜜蜂Apis cerana cerana气味受体Or10是感受信息素的重要受体蛋白之一。本研究目的是克隆出该受体基因的序列,并分析该基因在雄蜂不同生理状态下触角和大脑中的表达特征,为该基因的功能研究提供理论依据。【方法】采集中华蜜蜂雄蜂触角,提取其总RNA,采用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂Or10基因的序列。利用生物信息学软件分析该基因的氨基酸序列。通过荧光定量PCR技术(q PCR)分析其在巢门口未性成熟雄蜂、巢门口性成熟雄蜂、巢脾上未性成熟雄蜂、巢脾上性成熟雄蜂触角和大脑中的相对表达量。【结果】克隆到中华蜜蜂Or10基因(命名为Ac Or10)(Gen Bank登录号:MF693365)c DNA序列,长度为914 bp,编码区长738 bp,编码246个氨基酸,其蛋白质分子量为28.163 k D,理论等电点为5.50。系统发育树结果显示,中华蜜蜂Ac Or10与西方蜜蜂Apis mellifera Am Or10、小蜜蜂Apis florea Af Or4-like基因聚成一支。荧光定量PCR结果表明,巢门口性成熟雄蜂和巢脾上性成熟雄蜂触角中Ac Or10表达量显著高于巢门口未性成熟雄蜂和巢脾上未性成熟雄蜂触角中的表达量(P0.05),但前两者以及后两者之间均差异不显著(P0.05);巢门口性成熟雄蜂大脑中Ac Or10表达量显著高于巢门口未性成熟雄蜂、巢脾上未性成熟雄蜂和巢脾上性成熟雄蜂大脑中的表达量(P0.05),但后三者之间差异不显著(P0.05);巢门口未性成熟雄蜂、巢脾上未性成熟雄蜂和巢脾上性成熟雄蜂触角中Ac Or10的表达量都显著高于相同生理状态下大脑中Ac Or10的表达量(P0.05),但巢门口性成熟雄蜂触角和大脑中Ac Or10的表达量差异不显著(P0.05)。【结论】推测Ac Or10与中蜂雄蜂性成熟相关,出巢飞行对触角Ac Or10表达量影响较小,但引起其脑部变化,进而影响雄蜂的交尾行为。     

苎麻转录因子基因BnMYB3的克隆及表达分析

该研究采用RACE技术,从苎麻中克隆到1个MYB转录因子基因(BnMYB3)的全长cDNA序列(GenBank登录号为MF741320.1)。生物信息学分析表明,BnMYB3基因cDNA全长为1 216bp,包括900bp编码区序列,编码含有299个氨基酸的蛋白,其分子量约为33.63kD,理论等电点为9.16;该蛋白质含有2个典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB。从苎麻基因组中克隆了BnMYB3基因1 681bp启动子序列,该序列包含ABRE、GARE-motif、CGTCA-motif和TGACG-motif等多个逆境相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,BnMYB3为组成型表达基因,在茎和叶中的表达量显著高于根;BnMYB3基因能够响应镉胁迫,且表达量随镉胁迫处理时间和处理浓度的增加而显著上升。     

银杏bHLH91转录因子基因的克隆及表达分析

bHLH转录因子在植物的生长发育、胁迫应答和次生代谢中具有重要的调控作用。该研究通过PCR技术从银杏(Ginkgo biloba)叶中分离得到了一个bHLH基因的cDNA序列,并将其命名为GbbHLH91。序列分析结果显示扩增的GbbHLH91基因cDNA序列长度为1 425 bp,开放阅读框是1 065 bp,编码354个氨基酸,分子量为40.1 kDa,等电点为8.20。系统进化分析结果显示,从用于进化树构建的bHLH蛋白质聚类情况来看,银杏GbbHLH91蛋白与裸子植物油松(Pinus tabuliformis)bHLH蛋白亲缘关系最近,且与被子植物无油樟(Amborella trichopoda)bHLH蛋白相似性达到60%,表明该基因在进化过程中相对比较保守。实时荧光定量PCR分析发现银杏bHLH91基因在银杏的各个组织中均有表达,其中在银杏叶中表达量最高,在根和茎中基因的表达量次之,在银杏雌花和果中表达量较少,在雄花中的表达水平最低;GbbHLH91基因在不同发育时期的银杏叶片中,表达量也存在一定的差异,其中在4月中旬该基因的表达水平达到最高,而后随着叶片的生长发育,该基因的表达水平呈现下降趋势。该研究结果为进一步验证GbbHLH91基因的功能奠定了前期基础。     

小麦CPP转录因子基因的电子克隆及生物信息学分析

目的:运用电子克隆的方法获得小麦中的CPP转录因子基因。方法:以水稻的CPP转录因子作为探针,对小麦的EST数据库进行搜索,应用相关软件进行聚类分析、拼接组装和延长。结果:克隆出4个小麦CPP基因,分别命名为TaCPP1、TaCPP2、TaCPP3和TaCPP4,序列长度分别为977bp、3 022bp、1 582bp和1 156bp,开放阅读框为975bp、2 298bp、720bp和750bp。4个CPP类型蛋白质都具有一个或两个CXC域,而且多数还拥有完整的CRC结构域。结论:4个小麦CPP基因与水稻CPP蛋白具有高度的同源性。研究结果为进一步实验克隆和研究其功能提供了理论基础。     

菠菜CBF转录因子基因片段的克隆及序列分析

根据拟南芥CBF基因序列的保守区设计合成一对特异引物,以菠菜基因组DNA为模板,采用PCR扩增的方法扩出一条DNA特异片段并克隆到pMD18-T载体中。用PCR法和酶切分析法对克隆片段进行鉴定并进一步进行核苷酸序列分析。序列测定该片段长为423bp。OMIGA2.0软件分析结果表明,该片段的推断氨基酸序列与黑麦(AAL35759)、小麦(AAL37944)、拟南芥(AAC78646)、大麦(AAL84170)的同源性分别为33.8%、33.1%、30.8%和30%。     

中华蜜蜂化学感受蛋白基因Acer-CSP1克隆与表达特征分析

化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)是昆虫化学感受系统中重要的组成部分之一。本研究克隆了中华蜜蜂Apis cerana cerana化学感受蛋白基因Acer-CSP1, 其核苷酸全长351 bp （GenBank登录号为FJ157352）, 编码116个氨基酸残基, 预测蛋白分子量为13.85 kD, 等电点为4.89, 且含有4个保守的半胱氨酸残基, 均符合昆虫CSPs的一般特征, 且与意蜂CSP1基因具有99.1%的相似性, 与其他昆虫也有45.3%~68.0%的相似性。利用2^-ΔΔCt法及绝对定量法的real-time PCR技术对Acer-CSP1在中蜂不同器官表达特征进行了研究, 得出的一致结论为Acer-CSP1显著水平地高丰度表达于中华蜜蜂触角, 其次大量表达于头部。由于触角为中华蜜蜂最主要的嗅觉器官, 而头部则具有发达的感觉神经系统和味觉系统, 这也提示Acer-CSP1极有可能参与中华蜜蜂的嗅觉以及其他化学感受功能。     

桃PpNST1和PpSND1转录因子基因的克隆与表达分析

为了解NAC类转录因子与桃果实内果皮发育木质化的关系,本文以桃内果皮为试材,采用同源基因克隆法获得了两个NAC类转录因子的全长编码区,分别命名为PpNST1和PpSND1。序列分析表明2个基因编码区全长均为1188bp,可编码396个氨基酸,其预测蛋白均包含1个NAC结构域和2个特征结构域（LP—box和WQ-box）。氨基酸序列系统进化分析显示PpNST1和PpSND1与苹果、葡萄、毛果杨和拟南芥等参与调控次生细胞壁形成和木质化的NST／SND1类转录因子具有较高同源性。荧光实时定量PCR分析表明,PpNST1和PpSND1的表达水平随内果皮的木质化程度加强而不断升高,分别于盛花期后59和52d达到最高表达量,且它们在内果皮中的表达水平远高于中果皮。对PpNST1和PpSND1下游可能的作用靶标进行进一步的表达分析表明,PpNST1和PpSND1可能在内果皮发育木质化过程中扮演重要角色。     

梭梭NAC转录因子家族基因的克隆和转录激活分析

以梭梭NAC转录组测序结果设计特异引物,成功克隆5个梭梭NAC转录因子。通过与其它物种NAC蛋白进行多重比对,表明克隆的5条序列具有NAC转录因子所共有的5个典型亚结构域。通过构建p GBKT7融合表达载体,将其转入AH109酵母菌中进行转录激活功能分析。结果显示含有Ha NAC10、Ha NAC17、Ha NAC18、Ha NAC21转录因子的重组酵母菌可以在SD-Trp-His-Ade缺陷培养基平板上生长,X-gal检测显蓝色。这表明Ha NAC10、Ha NAC17、Ha NAC18、Ha NAC21可以激活下游报告基因表达,说明其具有转录激活活性;Ha NAC16不具备转录激活活性。为进一步分析梭梭NAC转录因子功能和调控机制提供帮助。     

转录因子AP-2α调控SOX9基因的表达

肝癌是肝脏中最常见的恶性肿瘤,是全球癌症相关死亡的第三大主要原因。肝癌发病具有隐蔽性、细胞异质性、耐药性的特点,且肿瘤易侵袭、转移和复发,使得其临床治疗效果欠佳。转录因子AP-2α在肝癌中作为肿瘤抑制因子发挥作用,其表达与肝癌患者的预后呈现正相关。SOX9在细胞分化、性别决定和肿瘤发生中起主要作用。在肝癌细胞中,SOX9异常增加可以促进癌细胞的生长。本研究利用JASPAR软件预测到SOX9的启动子区域含有潜在的AP-2α结合位点,通过萤光素酶和凝胶迁移试验（EMSA）证实了AP-2α可以与SOX9的启动子区域直接结合,抑制SOX9的转录活性。通过实时定量PCR和蛋白质免疫印迹发现,AP-2α抑制了SOX9的mRNA和蛋白质水平表达。这些结果提示了AP-2α可与癌基因SOX9的启动子区域结合,负调控肝癌细胞中SOX9的表达。     

扁桃CBF1转录因子的克隆及原核表达分析

为了探明CBF转录因子在扁桃中的抗寒分子机理,以新疆栽培扁桃‘矮丰’叶片为材料,通过PCR技术从扁桃基因组DNA中获得CBF1转录因子,命名为AF-Pd CBF1,Gen Bank登录号为KM245570。序列分析表明,该基因开放阅读框为729bp,编码242个氨基酸,推测蛋白质分子量为27.405 k D,并且该蛋白没有信号肽。进化树分析表明,AF-Pd CBF1与甜樱桃和中国梅的亲缘关系最近。将该基因片段连接到原核表达载体p ET-32a(+)中,构建融合表达质粒p ET-Pd CBF1,转化到E.coli Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期大小一致,分子量大小约为47.8 k D。对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果表明,重组蛋白p ET-Pd CBF1在IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导4 h时,其表达量最佳。试验结果可为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定基础。     

中间锦鸡儿转录因子基因 CiNAC1的克隆及功能分析

NAC转录因子家族是植物特有的、最大的转录因子家族之一,在植物应答非生物胁迫和生长发育过程中有重要的功能。该研究通过PCR技术,克隆得到了中间锦鸡儿 CiNAC1基因1 066 bp的cDNA全长序列。生物信息学分析显示, CiNAC1基因的开放阅读框(ORF)为921 bp,编码306个氨基酸,推导的蛋白分子量为34.57 kD,等电点为8.35,是一种亲水性蛋白,N端具有保守的NAM结构域,具有26个磷酸化位点和7个糖基化位点。实时荧光定量PCR检测显示,中间锦鸡儿 CiNAC1基因表达受干旱、高盐、脱水、高pH诱导;亚细胞定位发现CiNAC1定位到细胞核中,这与它作为转录因子的功能是一致的;转CiNAC1基因拟南芥株系侧根数目显著多于野生型,根长也明显比野生型长。研究认为, CiNAC1基因可能与中间锦鸡儿响应逆境胁迫机制有关。