Bmttv在家蚕翅发育过程中的功能分析

【目的】探析家蚕Bombyx mori糖基转移酶基因Bmttv在家蚕翅发育过程中的功能。【方法】通过RACE克隆家蚕Bmttv的CDS全长序列并进行生物信息学分析；使用qRT-PCR检测Bmttv在家蚕不同发育阶段(5龄幼虫、游走期幼虫、预蛹、蛹和成虫)和5龄幼虫不同组织(表皮、翅原基、精巢、马氏管、气管、丝腺、头、血淋巴、脂肪体和中肠)中的表达量；构建过表达载体，瞬时转染BmE细胞，通过免疫荧光对BmTTV进行亚细胞定位，利用qRT-PCR检测家蚕翅发育关键基因BmHippo,Bmwg,BmDpp,Bmsotv和BmHh的表达量。【结果】成功克隆到家蚕Bmttv的CDS全长序列，长2 228 bp; BmTTV蛋白具有两个特殊结构域，均与硫酸肝素聚糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPGs)的合成相关，与黑腹果蝇Drosophila melanogaster和智人Homo sapiens TTV的氨基酸序列一致性达45%左右，与鳞翅目昆虫TTV的亲缘关系更近。Bmttv主要在家蚕蛹期开始高量表达，在5龄幼虫中肠、精巢和翅原基中高量表达。BmTTV主要...     

hnRNPA1基因在家蚕翅原基组织中的表达与定位分析

核不均一蛋白A1(hnRNPA1)是一个重要的RNA结合蛋白。本研究旨在获得家蚕hnRNPA1基因的cDNA,并对其在家蚕翅原基组织进行表达和定位分析。以家蚕幼虫期翅原基mRNA为模板通过反转录克隆家蚕BmhnRNPA1基因的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析。构建pET32a-BmhnRNPA1蛋白表达载体,表达且纯化得到BmhnRNPA1重组蛋白,并制备该蛋白多克隆抗体,通过实时荧光定量RT-PCR、Western blot和免疫组化方法检测BmhnRNPA1在家蚕幼虫和蛹翅原基组织中的表达与定位。克隆得到了家蚕hnRNPA1基因的全长cDNA片段,其开放阅读框(ORF)序列为951 bp,编码316个氨基酸,预测分子量为34.98 kDa,等电点为5.15。编码蛋白在第18～90个氨基酸和109～181个氨基酸处为保守的RRM结构域。系统进化分析显示,家蚕hnRNPA1与小菜蛾hnRNPA1的亲缘关系最近。QRT-PCR结果显示,BmhnRNPA1在家蚕幼虫和蛹期的翅原基组织中均有表达,且在蛹期第3天的表达量达到峰值。Western blot进一步证实了实验结果。免疫组化分析结果显示,该蛋白存在于翅原基组织中,并定位于细胞核内。家蚕BmhRNPA1具有两个RNA结合结构域,属于hnRNPs家族,定位于细胞核内,表明其可能参与mRNA的选择性剪接作用。本研究结果为进一步探索该基因的功能提供了基础。     

果蝇翅原基发育分化的主要过程及分子机理

翅原基发育分化与昆虫的个体发育紧密联系, 对昆虫翅发育的研究有助于阐述昆虫的发育过程。另外, 翅的形成是一些农林害虫泛滥的主要原因之一, 研究翅发育分化有助于我们从翅发育的角度控制农林害虫。目前, 翅发育分化在果蝇Drosophila中研究已较为深入详细。果蝇翅发育分化主要包括4个阶段： 翅原基（wing disc）的确定, 前-后（antero-posterior, A-P）和背-腹（dorso-ventral, D-V）组织中心（organizing center）的建立, 翅区（wing region）的确定, 以及翅区的进一步分化。具有homeobox序列的基因（homeobox 基因）如Engrailed (En)、 Apterous (Ap)和Ultrabithorax (Ubx), 分泌蛋白如Wnt家族成员Wingless (Wg)及TGF-β超家族成员Decapentaplegic (Dpp)和Hedgehog (Hh), 以及翅原基特有的核蛋白编码基因Vestigial (Vg), 共同调控了翅原基的正常发育分化。本文综述了果蝇翅原基发育分化的过程及分子机理方面的研究发现, 为翅原基的研究提供了参考。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂20的表达特征分析

【目的】原核表达家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂20(Serine proteinase inhibitor 20,Bm Serpin-20),分析Bm Serpin-20基因和蛋白组织表达分布特点,以及不同外源病原物刺激家蚕后Bm Serpin-20基因的表达模式。【方法】利用p ET-28a表达载体在大肠杆菌Transetta(DE3)中融合表达Bm Serpin-20蛋白,利用纯化的重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用实时定量PCR技术及Western blot方法分别分析Bm Serpin-20基因和蛋白的组织表达水平,以及病原物免疫刺激后的表达模式。【结果】在大肠杆菌中正确表达和纯化了融合Bm Serpin-20蛋白,并制备了多克隆抗体;Bm Serpin-20基因和蛋白在脂肪体、中肠、血细胞、马氏管、表皮、睾丸、卵巢中均有表达,且在表皮中表达量最高;家蚕5龄幼虫经核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis viruses)、藤黄微球菌Micrococcus luteus、大肠杆菌Escherichia coli、白僵菌Beauveria bassiana处理后,Bm Serpin-20基因表达量先下调而后上调,但不同病原物在不同时间的影响不尽相同。【结论】研究了Bm Serpin-20基因和蛋白的表达模式,为下一步研究其在家蚕免疫系统中的作用奠定了基础。     

家蚕双重氧化酶BmDUOX的序列特征、表达模式及病原诱导表达

【目的】研究双重氧化酶(dual oxidase,DUOX)在家蚕Bombyx mori中的表达模式,探析其在家蚕肠道免疫机制中的作用。【方法】通过氨基酸多重序列比对和系统进化分析对Bm DUOX蛋白氨基酸序列特征进行研究,并采用RT-PCR方法扩增获得家蚕Bm DUOX膜外部分Bm DUOX_OM基因序列。在大肠杆菌Eescherichia coli(DE3)中诱导表达并通过亲和层析法纯化获得重组表达蛋白,以其为抗原免疫昆明鼠,获得对应的多克隆抗体;利用所得的抗体检测Bm DUOX的表达和细胞定位。通过半定量RT-PCR方法分析Bm DUOX在家蚕不同发育时期和组织中的表达模式及病原诱导表达谱。另外,利用活性氧检测试剂盒分析家蚕微孢子虫Nosema bombycis诱导后家蚕Bm E细胞的活性氧(ROS)的含量。【结果】生物信息学分析表明,Bm DUOX内有保守的Peroxidase,Ferric_reduct,EF-hand,FAD-binding和NAD-binding结构域,且具有6个跨膜区,跨膜形式与人类Homo sapiens、果蝇Drosophila melanogaster等的DUOX蛋白的跨膜形式一致。多重序列比对分析表明,Bm DUOX的过氧化酶区域内具有过氧化物酶的保守活性位点。克隆获得家蚕Bm DUOX_OM基因,并纯化获得重组表达蛋白,制备的鼠多抗具有较好的特异性。间接免疫荧光实验(IFA)表明,Bm DUOX位于家蚕Bm E细胞的细胞膜上。表达模式分析表明,Bm DUOX在家蚕5龄第3日幼虫和成虫中表达量较高;且在幼虫表皮、精巢、卵巢和头内高量表达,在成虫的卵巢、精巢、表皮和脂肪体内也有较高的表达量。病原诱导分析表明,通过肠道起始感染的家蚕微孢子虫能够诱导家蚕幼虫中肠Bm DUOX基因持续上调表达,且其诱导后的Bm E细胞内活性氧含量也明显增加,提示Bm DUOX调控的肠上皮ROS应答参与抵抗家蚕微孢子虫的侵染。【结论】Bm DUOX含有典型的结构域及保守的活性位点,表明其在家蚕中具有保守的生物学功能。Bm DUOX在家蚕不同发育时期、不同组织及病原诱导下的表达谱提示其可能参与宿主肠上皮对家蚕微孢子虫的免疫反应。     

本期重点推介

正全变态昆虫在变态发育过程中存在大量的组织细胞凋亡和自噬现象,可作为研究程序性细胞死亡的理想模型。家蚕Bombyx mori翅原基的生长分化过程中存在造血器官和翅囊等组织的消失现象,暗示可能存在细胞凋亡或自噬。华南师范大学生命科学学院刘学术和邓惠敏等以家蚕为材料,采用TUNEL法检测初蛹翅原基细胞凋亡情况,利用定量PCR检测幼虫和蛹期不同阶段翅原基中凋亡相关基因(Caspase     

家蚕保幼激素结合蛋白Bmtol基因的克隆及表达分析

目的:克隆获得家蚕(Bombyx mori)Bmtol基因序列,并对其蛋白结构进行预测,分析其在组织和JHA处理后头部的表达差异,为该基因的功能研究提供参考。方法:以家蚕的全组织c DNA为模板利用RT-PCR技术扩增和克隆获得Bmtol基因c DNA全长序列,并提交至Gen Bank数据库;利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;采用MREGA5.0软件中的邻接法(neighbor-joining,NJ)构建Bm TOL及其它昆虫同源TO的进化树;通过q PCR技术分析Bmtol基因在5龄3天家蚕不同组织的表达情况,及JHA处理5龄蚕后在0 h、24 h、48 h、72 h和96 h家蚕头部的表达情况。结果:克隆获得了家蚕Bmtol基因的c DNA序列(Gen Bank登录号KY681053),Bmtol基因的开放阅读框(ORF)长度为759 bp,编码252个氨基酸,预测其蛋白分子量为27.72k Da,理论等电点为6.16,有信号肽,无跨膜结构,且第25~251位氨基酸之间存在一个保幼激素结合蛋白家族JHBP保守结构域;N端为疏水区域,可能与保幼激素结合蛋白的核心部位有关。亚细胞定位分析表明,Bm TOL属于分泌型蛋白,主要集中在内质网-高尔基体-质膜分泌途径上。Bm TOL蛋白具有3个α螺旋,第34位的Cys和第44位Cys形成一个二硫键链接在α1螺旋和N末端,构成Bm TOL蛋白与配体结合的核心部位。序列比对结果显示,家蚕Bm TOL序列与其他昆虫TO的氨基酸序列一致性差别较大。家蚕Bm TOL与果蝇Dm TO的相似性为25.10%,与烟草天蛾的相似性为19.69%,与冈比亚按蚊的相似性为25.78%,与埃及伊蚊的相似性为23.53%,与黑花蝇的相似性为28.17%,与意大利蜜蜂的相似性为23.05%,与苹浅褐卷蛾的相似性为21.18%。系统进化树分析表明,所有选用昆虫TO形成两个大的分支:苹浅褐卷蛾Ep TO1、烟草天蛾Ms TO、意大利蜜蜂Am TOL、果蝇Dm TO和黑花蝇Pr TOL聚为一个分支,埃及伊蚊Aa TO、冈比亚按蚊Ag TOL-2和家蚕Bm TOL聚为另一大分支。q PCR结果显示,Bmtol基因在家蚕头部、表皮和精巢有较高表达,其他组织表达量很低或没有。在JHA处理的5龄家蚕的头部,Bmtol基因在处理后0 h、24 h、48 h、72 h和96 h的表达量差异不明显。结论:Bm TOL蛋白属于JHBP家族,具有JHBP家族的典型结构;组织表达谱和JHA处理结果暗示,Bm TOL属保幼激素结合蛋白(JHBP),在家蚕中除保幼激素结合之外还参与其他多种生理功能。     

家蚕翅原基细胞的凋亡和自噬分析

【目的】家蚕Bombyx mori翅原基在生长分化过程中伴随着造血器官和翅囊等组织的消失。本研究旨在分析家蚕翅原基生长分化过程中是否存在细胞凋亡和细胞自噬。【方法】制作蛹期0 d翅原基石蜡切片,利用TUNEL法检测细胞凋亡情况;提取5龄第3天、5龄第6天、上簇第1天、预蛹期、蛹期0 d及蛹期第3天的翅原基总RNA,反转录成c DNA,利用定量PCR检测凋亡和自噬相关基因的表达水平;检测了细胞凋亡相关的Caspase 3和细胞自噬相关的酸性磷酸酶活性。【结果】TUNEL染色发现蛹期0 d的翅原基出现部分细胞凋亡现象;细胞凋亡相关基因Caspase 3和Nc主要在5龄幼虫期有高水平表达,细胞凋亡抑制因子IAP主要在幼虫末期有较高水平的表达;Caspase 3酶活性在上簇第1天出现峰值;细胞自噬相关基因Atg5,Atg6,Atg8和Atg12主要在幼虫末期有较高水平的表达;酸性磷酸酶活性也主要在幼虫末期较高。【结论】在幼虫期可能存在细胞凋亡,抑制了翅原基细胞的增殖,进而阻止了翅原基的生长分化;在幼虫末期可能同时存在细胞凋亡和自噬,促进翅囊等的退化,同时阻止了翅原基细胞的增殖,推动了翅原基向蛹翅的发育。     

家蚕中肠特异启动子P56的克隆及活性分析

中肠是家蚕的消化器官,也是抵御外界病源入侵的生理屏障。为克隆和鉴定新的家蚕中肠特异启动子,首先利用RT-PCR检测家蚕组织特异表达候选基因Bm P56的表达特性,发现该基因只在中肠组织表达。进一步克隆该基因上游调控序列P56,构建由该序列驱动红色荧光蛋白基因DsRed表达的转基因载体p Bac[P56DsRed SV40,3×P3EGFP],经显微注射和荧光筛选获得转基因家蚕。表达分析显示,报告基因DsRed只在转基因家蚕中肠组织表达,与Bm P56的表达特征一致,说明克隆的上游调控序列P56是有活性的家蚕中肠特异启动子。     

家蚕血细胞特异表达新基因Bm04862的鉴定及表达

通过家蚕组织芯片数据筛选得到家蚕血细胞特异表达基因Bm04862,并首次对该基因进行了克隆与鉴定。应用RACE技术获得该基因全长,并对其进行生物信息学分析。Bm4862基因开放阅读框819 bp,共编码273个氨基酸残基,预测其为跨膜蛋白;通过q RT-PCR技术对其时空表达情况进行分析;结果显示Bm04862基因在家蚕血细胞中特异高表达,并在4龄眠期和预蛹2 d时达到表达高峰;构建Bm04862真核表达载体,转染Sf9细胞分析其蛋白的亚细胞定位情况,结果表明其定位于细胞核膜和部分细胞质中。此外,用大肠杆菌刺激蚕体24 h后,Bm04862基因表达水平显著上调,表明大肠杆菌可以诱导该基因的表达,由此推测该基因可能参与家蚕的免疫应答。这为深入研究该基因在家蚕免疫反应中的功能提供了参考。     

家蚕Fox转录因子在精巢中的表达特征及BmFoxL2在精巢发育中的功能初探

Fox家族蛋白广泛存在于植物以外的物种中,是一类与发育相关的重要转录因子.但是不同Fox基因在鳞翅目昆虫家蚕Bombyx mori精巢中的表达特征,以及BmFoxL2亚家族蛋白在精巢发育中的功能未知.本文检测了家蚕12个BmFox基因在家蚕精巢中的表达量,发现BmFoxL2-2的表达量最高,BmFoxL2-1次之.Bm...     

家蚕BmChd64基因的克隆与表达定位分析

Chd64是含有钙结合蛋白同源（Calponin homology,CH）结构域的蛋白,在果蝇蜕皮激素与保幼激素信号通路中发挥重要作用。本研究以家蚕Bombyx mori为研究对象,利用PCR克隆了与果蝇Drosophila melanogaster DmChd64同源的BmChd64基因,与表达载体pET-28a连接后,成功获得体外原核表达的BmChd64蛋白,并对其进行了亚细胞定位分析。家蚕BmChd64基因开放阅读框（ORF）的序列为567 bp,编码188个氨基酸,预测分子量大小为20.9 kDa,理论等电点为8.41,编码的蛋白在第27~130个氨基酸处存在CH结构域。同源性比对与进化分析显示,BmChd64与赤拟谷盗Tribolium castaneum和果蝇的Chd亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示,BmChd64在家蚕5龄游走期的不同组织中均有表达,且在翅原基中的表达趋势与家蚕体内蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）滴度变化规律一致。亚细胞定位结果显示,BmChd64在细胞核与细胞质中均有分布,细胞核内荧光信号较强,且在细胞核外围较弱,推测细胞质中BmChd64也可入核,最终定位在细胞核中。研究结果表明BmChd64可能主要通过20E信号通路调控翅原基等的变态发育,这为进一步完善20E调控昆虫变态发育的分子机制提供了实验基础。     

利用优化改造的家蚕杆状病毒表达系统提高NS1表达产量

为优化家蚕杆状病毒表达系统,提高外源基因的表达产量。文中通过同源重组技术,用串联的氯霉素基因(Cm)表达盒和绿色荧光蛋白基因(egfp)表达盒将其替换,从而获得Chitinase和Cystein Protease两个基因缺失的家蚕杆状病毒载体。通过转座,将多角体启动子控制的家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)ns1基因表达盒,定点插入到改造后的该分子载体中。将重组载体转染Bm N细胞,获得能表达家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)NS1的缺失型重组病毒;另外,将多角体启动子控制的ns1基因转座到野生型Bm-bacmid中,获得能表达Bm BDV NS1的野生型重组病毒。将这两种病毒分别皮下注射家蚕,对感染后的家蚕血液中NS1表达水平进行比较,发现缺失Chitinase和Cystein Protease重组病毒感染的家蚕血液中,NS1的表达量是对照组的3倍,从而建立了一种高效表达可溶性NS1蛋白的方法,为靶蛋白的结构与功能研究奠定基础。     

猴Fertilinβ氨基端93肽基因的克隆及其在大肠杆菌中表达

Fertilin是一种异二聚体精子表面蛋白.业已证明,它在精卵反应中起着重要作用.成熟的Fertilinβ亚基的氨基端93肽含有与整联蛋白结合的整联蛋白配体区.该整联蛋白配体区与蛇毒整联蛋白配体区高度同源,它们能与细胞表面的整联蛋白相结合.在此我们报道猴成熟Fertilinβ氨基端93肽基因的克隆和在大肠杆菌中的表达.用RT-PCR方法获得mmFβNTP93基因,克隆入表达载体pT7-7/hCGβ的EcoRI和BamHI位点,该基因与hCGβ基因一起表达融合蛋白mFβNTP93-hCGβ,Western blotting结果显示,融合蛋白的表观分子量为33kDa,能与抗hCG抗体专一性结合.由于mFβNTP93基因与hCGβ基因相连,因此我们推测,mFβNTP93基因已获得表达.     

家蚕FoxG转录因子的鉴定及其在精巢发育中的功能初探

[目的]Fox家族蛋白是调控动物发育的关键转录因子.本文分析了鳞翅目昆虫家蚕Bombyxmori的BmFoxG亚家族蛋白在精巢发育中的作用,为基于生殖系统的家蚕性状优化或害虫不育技术的开发提供理论依据.[方法]利用PCR克隆家蚕BmFoxG-1 和 BmFoxG-2基因;通过生物信息学工具对BmFoxG蛋白的结构及理化性质进行分析;采用qPCR技术检测BmFoxG基因在家蚕不同发育阶段的精巢中的表达变化;在家蚕Bm12细胞株中过表达BmFoxG-1,并通过qRT-PCR分析BmFoxG-1调控的靶基因.[结果]本文克隆获得了 BmFoxG-1(933 bp)和 BmFoxG-2(702 bp)两个基因.BmFoxG-1 和 BmFoxG-2蛋白均包含保守的Forkhead结构域,但BmFoxG-1蛋白在C端多出约60个氨基酸.BmFoxG-2基因在家蚕不同发育时期的精巢中的表达量均较低;BmFoxG-1 的表达均显着高于BmFoxG-2,且随着发育时期而变化,暗示BmFoxG-1参与精巢的发育.生殖细胞发育基因BmVasa、BmCyclinA等多个细胞周期基因以及精子鞭毛发育相关基因BMSK0009828在不同发育阶段的精巢中的表达趋势与BmFoxG-1类似,且BmFoxG-1在家蚕细胞中的过表达可以显著上调BmVasa、BmCyclinA和BMSK0009828等精巢发育相关基因的表达.[结论]我们推测BmFoxG-1蛋白可能通过调节精巢细胞周期或生殖细胞的功能来调节家蚕精巢的发育.     

DNA甲基转移酶参与调控斜纹夜蛾和家蚕幼虫的生长

DNA甲基化是真核生物生长发育过程中基因表达的一种重要调控机制。本研究以鳞翅目农业害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura和模式昆虫家蚕Bombyx mori为材料,研究了甲基化对幼虫生长的影响。研究结果表明,注射甲基化抑制剂5-Aza-d C后,不正常斜纹夜蛾比对照增加了36%,家蚕的增加了58.8%,不正常虫的生长发育缓慢、体型变小。斜纹夜蛾DNA甲基转移酶Sldnmt1 RNAi获得了相似的结果,不正常幼虫率比对照增加了35%。检测家蚕Bmdnmt1的m RNA水平,发现Bmdnmt1在5龄期的翅原基、脂肪体、表皮和中肠均有表达,其表达量在翅原基中的为最高;在翅原基和脂肪体中,Bmdnmt1的含量在5龄初期比在预蛹期的要高。初步分析了甲基化抑制剂处理后的家蚕脂肪代谢相关基因的表达,发现脂肪酶和乙酰辅酶A结合蛋白的m RNA水平在注射5-Aza-d C后48 h显著下调。研究结果初步表明了DNA甲基化参与调控了鳞翅目幼虫的生长发育,脂肪代谢可能是DNA甲基化调控的其中一个通路。     

家蚕前部丝腺特异表皮蛋白Bm11721的鉴定及表达

家蚕的丝腺是其丝蛋白合成和分泌的器官,根据其形态和功能的不同分为前部、中部和后部丝腺,前部丝腺不具有合成丝蛋白的能力,是丝蛋白构象发生转变的场所。剪切力在丝蛋白构象转变中起到重要的作用,其在家蚕前部丝腺主要由前部丝腺逐渐变细的管腔结构和富含几丁质及表皮蛋白的坚硬的内壁提供。鉴定家蚕前部丝腺新的几丁质结合蛋白,并调查其在家蚕幼虫不同组织的表达特征。通过几丁质亲和层析的方法在前部丝腺筛选并鉴定到一个新的具有几丁质结合功能的表皮蛋白Bm11721,其编码基因编号为BGIBMGA011721(Gen Bank Accession No.NM-001173285.1)。利用原核表达系统成功表达了该蛋白,通过Ni-NTA亲和层析的方法获得了Bm11721的重组蛋白并制备了多克隆抗体。组织表达分析发现无论是转录水平还是蛋白水平Bm11721均只在前部丝腺特异表达,且Bm11721蛋白在5龄期的前部丝腺中恒定表达。免疫荧光定位结果显示Bm11721蛋白定位在前部丝腺的内膜中,推测其可能与前部丝腺的机械硬度有关,为丝蛋白的构象转变提供剪切力。     

家蚕鞣化激素基因对翅展及繁殖力的调控作用

[目的]昆虫鞣化激素(Bursicon)是由神经系统分泌的一种异源二聚体神经肽,对昆虫表皮鞣化、翅展等功能具有调控作用.本研究旨在探究鞣化激素基因与家蚕Bombyx mori翅发育及对繁殖力相关基因的关系,明确其对翅展和繁殖力的调控作用.[方法]采用RNAi技术,分别注射Bursicon基因的dsRNA(dsBmBur...     

家蚕类泛素化翻译后修饰蛋白NEDD8的cDNA克隆、表达分析和亚细胞定位

【目的】NEDD8是一种重要的蛋白质翻译后修饰蛋白,对底物蛋白的功能具有重要的调节作用。本研究旨在探索家蚕Bombyx mori中NEDD8的功能。【方法】利用RT-PCR技术,从家蚕Bm N细胞中克隆了家蚕NEDD8完整的开放阅读框。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测家蚕NEDD8在不同发育阶段、5龄第3天幼虫不同组织中以及Bm NPV感染Bm N细胞后的相对表达量。通过构建GFP融合表达的重组Bm NPV(B.mori nucleopolyherovirus)感染家蚕Bm N细胞,在共聚焦显微镜下观察NEDD8在细胞中分布情况,用GFP抗体进行Western blot验证。【结果】克隆获得了NEDD8基因。序列分析表明,家蚕NEDD8高度保守,与家蚕泛素蛋白氨基酸序列一致性最高。qRT-PCR分析结果表明,NEDD8在家蚕的不同组织中均有表达,其中头部中表达量最高,其次是丝腺中,而在精巢和卵巢中表达量最低;在家蚕5龄第3天幼虫始到化蛹后第3天NEDD8的表达量开始逐渐增加,化蛾后降至低水平;在家蚕杆状病毒感染Bm N细胞的早期和极晚期NEDD8的表达量都有明显增加。GFP-NEDD8融合表达定位显示NEDD8在Bm N细胞内普遍存在,分布于整个细胞中,并且在感染48 h后存在细胞质内的聚集现象。【结论】NEDD8编码序列在物种间高度保守;NEDD8在家蚕幼虫头部中表达量最高,在化蛹阶段表达量逐渐增加;NEDD8在Bm N细胞内普遍存在并且可能与参与Bm NPV复制。本研究所得结果为进一步研究NEDD8在家蚕中的生物学功能及修饰底物蛋白的作用机制奠定了基础。     

家蚕雌激素相关受体基因的克隆与表达分析

【目的】黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 雌激素相关受体（estrogen-related receptor, ERR）通过调节糖酵解过程进而控制果蝇的能量代谢。本研究在克隆家蚕Bombyx mori ERR 基因 (BmERR) 的基础上,对其分子特性和系统演化进行生物信息学分析, 并检测该基因在家蚕生殖腺中的表达,为进一步研究ERR功能奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆 BmERR 基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR检测该基因在停食后家蚕幼虫生殖腺中的表达情况。【结果】BmERR 基因全长cDNA序列为1 296 bp,编码431个氨基酸残基;具有ERR蛋白家族典型的结构特征;系统进化分析显示BmERR与其他昆虫ERR氨基酸序列一致性较高;半定量 RT-PCR 检测表明,BmERR 在家蚕上簇到化蛾期间的精巢和卵巢中均有表达,表达具有时期特异性,化蛹第1天达到表达高峰。【结论】本研究首次从鳞翅目昆虫中克隆获得ERR cDNA序列。ERR基因在家蚕生殖腺中表达量无明显性别差异,但具有发育时期特异性。