纳米粒子载体对灰飞虱RNAi效率的影响

【目的】筛选针对灰飞虱Laodelphax striatellus RNAi的dsRNA高效纳米递送载体。【方法】使用壳聚糖、碳量子点(carbon quantum dot, CQD)和lipofectamine 2000作为代表性纳米粒子,分别与dsRNA进行混合,形成稳定的3种不同复合颗粒,利用光谱法检测其dsRNA装载率。以灰飞虱膜结合型海藻糖酶基因LsStre为靶标基因来测试3种纳米粒子的RNAi效率。用不同纳米粒子包裹的dsLsStre喂食后,通过荧光实时定量PCR(qPCR)检测喂食后2 d灰飞虱2龄若虫中LsStre mRNA表达水平,并检测和计算灰飞虱2龄若虫在6 d内的校正死亡率,以裸dsLsStre引起的2龄若虫死亡率为对照,评价3种纳米载体对LsStre的RNAi增效作用。【结果】3种纳米载体均能负载dsEgfp,且这3种纳米载体复合dsEgfp的效率均在95%以上。3种纳米材料对灰飞虱2龄若虫的毒性均较弱。同未用纳米粒子包裹的裸dsLsStre喂食组(对LsStre表达量的抑制率为46%)相比,壳聚糖和CQD能够显著提高LsStre的RNAi效率(对LsStre表达量的抑制率分别为78%和84%),而lipofectamine 2000不能显著提高LsStre的RNAi效率(抑制率为52%)。壳聚糖和CQD可以有效提高喂食dsLsStre对灰飞虱2龄若虫的致死效应,在连续喂食6 d后,灰飞虱2龄若虫的校正死亡率分别达到76%和82%,与直接用裸dsLsStre处理的对照组校正死亡率(35%)相比,增效系数分别达到2.17和2.34,lipofectamine 2000的增效能力最弱,其与dsLsStre的复合颗粒处理引起灰飞虱2龄若虫死亡率为38%,增效系数为1.09。【结论】壳聚糖和CQD纳米载体能够显著提高灰飞虱对于喂食dsRNA的敏感性,而lipofectamine 2000的RNAi增效作用较弱。研究结果有助于评价纳米载体在灰飞虱RNAi中的增效作用,为进一步开发和筛选有效的RNAi纳米载体,实现害虫绿色防控,提供了理论依据和应用策略。     

马铃薯甲虫N-β-丙酰多巴胺水解酶基因的克隆及功能分析

【目的】通过RNAi技术分析明确对马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata黑色素形成重要的N-β-丙酰多巴胺(NBAD)水解酶基因的功能。【方法】NBAD水解酶基因通过马铃薯甲虫转录组数据分析和RT-PCR克隆获得,分别利用序列比对和系统发育分析确定该基因的完整性和系统发育;通过q PCR检测其在马铃薯甲虫各发育阶段和4龄幼虫不同组织及成虫精巢和卵巢中的表达量;采用喂食幼虫dsRNA的方法,观察该基因在马铃薯甲虫幼虫的生长发育过程中对体色的影响,并测定保幼激素和蜕皮激素对该基因表达的影响。【结果】克隆得到马铃薯甲虫NBAD水解酶基因,命名为Ldtan(Gen Bank登录号:KY221866),其编码蛋白的氨基酸序列与鞘翅目赤拟谷盗Tribolium castaneum和山松大小蠹Dendroctonus ponderosae同源蛋白的氨基酸序列的一致性最高,聚为一支。Ldtan在马铃薯甲虫4龄幼虫腹神经索(99.36±0.95)、后肠(17.79±3.11)和表皮(9.21±0.12)中的相对表达量较高;在幼虫期随幼虫生长发育表达量逐渐升高,在成虫期的表达量最高。通过喂食2龄幼虫Ldtan的dsRNA能有效降低靶标基因的表达量,使幼虫体色变深呈一定的棕褐色,并且具有一定的致死效应。通过RNAi技术干涉保幼激素合成和信号途径相关基因,发现Ldtan表达量降低,而干扰蜕皮激素合成和信号途径相关基因,Ldtan表达量增加。【结论】结果提示Ldtan参与了马铃薯甲虫的黑色素合成,并且蜕皮激素和保幼激素可能影响其表达。     

马铃薯甲虫结节性硬化复合物基因LdTSC1和LdTSC2基因的克隆及功能分析

【目的】通过RNAi技术明确马铃薯甲虫TOR上游的关键信号集成节点及类胰岛素信号通道下游基因结节性硬化复合物TSC1和TSC2的功能。旨在为探明马铃薯甲虫类胰岛素信号转导提供更多理论支持。【方法】在NCBI(美国国家生物技术信息中心)获取马铃薯甲虫LdTSC1/2序列,分别利用多重序列比对和系统发育分析确定该基因的完整性和系统发育关系;采用喂食幼虫dsRNA的方法,观察该基因的调低对马铃薯甲虫幼虫生长发育、糖脂代谢的影响。【结果】克隆得到马铃薯甲虫TSC1编码蛋白的氨基酸序列与鞘翅目白蜡窄吉丁直系同源蛋白的氨基酸序列的自展一致度为100%,聚为一支;TSC2编码蛋白的氨基酸序列与鞘翅目白蜡窄吉丁和赤拟谷盗的同源蛋白氨基酸序列的自展一致度为100%,聚为一支。通过分别喂食2龄幼虫LdTSC1/2的dsRNA能有效降低靶标基因的表达量,幼虫出现体重减轻,化蛹率和羽化率显著下降,葡萄糖的吸收转化效率降低,海藻糖含量升高和甘油三酯均减少。【结论】下调2龄幼虫LdTSC1/2的表达量,导致试虫出现抑制了糖脂代谢、脂肪体减少、体重减轻以及发育延迟;结果表明LdTSC1/2调控了马铃薯甲虫幼虫的糖脂代谢过程,显著影响幼虫化蛹和蜕皮过程。     

RNAi介导的GdHsp60和GdHsp70基因沉默对沙葱萤叶甲幼虫抗寒性的影响

【目的】本研究旨在比较不同RNAi方法对沙葱萤叶甲Galeruca daurica幼虫热激蛋白基因(GdHsp60和GdHsp70)的沉默效率,以选择一种可高效降低靶基因表达水平的研究方法,明确这两个热激蛋白在沙葱萤叶甲幼虫抗寒性中的作用。【方法】分别通过饲喂法和显微注射法进行RNAi沉默沙葱萤叶甲1和2龄幼虫的GdHsp60和GdHsp70,采用qPCR检测GdHsp60和GdHsp70的沉默效率;通过显微注射法分别 对GdHsp60和GdHsp70进行RNAi后24 h,用热电偶法测定沙葱萤叶甲2龄幼虫过冷却点和结冰点,生物测定沙葱萤叶甲2龄幼虫暴露于不同低温条件下(-6~-14℃) 2 h的半致死温度(Ltemp₅₀)以及在-5℃低温条件下处理不同时间后的半致死时间(Ltime₅₀)。【结果】用饲喂法和显微注射法进行RNAi均可以降低GdHsp60和GdHsp70的表达水平,但显微注射法的沉默效率更高。与对照组(显微注射dsGFP)相比,沙葱萤叶甲2龄幼虫分别显微注射dsGdHsp60和dsGdHsp70 24 h后,GdHsp60和GdHsp70的表达水平均降至最低,分别降低了84.15%和92.38%。在沙葱萤叶甲2龄幼虫中,显微注射dsGdHsp60 24 h后其过冷却点、结冰点、Ltemp₅₀及Ltime₅₀值分别-10.56±0.42℃,-7.66±0.56℃,-8.33℃和49.25 h,显微注射dsGdHsp70 24 h后其过冷却点、结冰点、Ltemp₅₀及Ltime₅₀值分别为-9.08±0.23℃,-6.09±0.28℃, -8.20℃和52.21 h,而对照组的分别为-14.71±0.11℃,-13.94±0.09℃,-10.63℃和87.13 h。与对 照组(显微注射dsGFP)相比,在沙葱萤叶甲2龄幼虫分别显微注射dsGdHsp60和dsGdHsp70 24 h后过冷却点 、结冰点和Ltemp₅₀显著上升,而Ltime50值显著缩短。【结论】显微注射法可作为沙葱萤叶甲Hsp相关基 因RNAi的主要干扰方法;沉默GdHsp60和GdHsp70基因均会显著降低了沙葱萤叶甲幼虫的抗寒能力。     

RNA干扰:脑学习和记忆的可能机制

dsRNA介导同源靶基因沉默的RNA干扰 (RNAi)是转录后基因水平沉默的主要作用方式 ,具有普遍的生物学意义。RNAi是dsRNA介导的核酸酶作用于dsRNA(>2 6nt)同源不成熟mR NA的酶解过程 ,mRNA降解为 2 1 2 3nt的dsRNA而使基因表达沉默。RNAi所具有的特性和脑学习和记忆的特征 ,提示RNAi可能是RNA介导的脑记忆移转的潜在机制     

四种鳞翅目害虫精氨酸激酶基因的表达谱及基于RNAi的功能分析

【目的】精氨酸激酶(arginine kinase, AK)(EC 2.7.3.3)是昆虫体内重要的磷酸原激酶(能量代谢调节因子),也是唯一能够形成有效ATP的磷酰基供体,起着与脊椎动物中肌酸激酶相同的作用。本研究旨在了解鳞翅目害虫AK基因的表达和功能。【方法】利用qRT-PCR方法测定AK基因在大螟Sesamia inferens、二化螟Chilo suppressalis、甜菜夜蛾Spodoptera exigua和斜纹夜蛾Spodoptera litura 这4种鳞翅目害虫不同发育阶段和3龄幼虫不同组织中的表达谱;通过终点法检测了这4种害虫不同发育阶段和幼虫不同组织中的AK酶活性;采用RNAi技术抑制该基因的表达并分析其功能。【结果】AK基因在大螟、二化螟、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾这4种鳞翅目昆虫的不同发育阶段和3龄幼虫不同组织中均有表达,说明该基因的表达不具有发育时期和组织特异性。不同发育时期和3龄幼虫不同组织中AK酶活性与基因表达量变化趋势大体一致。注射以AK基因为靶标的dsRNA 6 d后,4种害虫体内AK基因的mRNA表达下降30%~50%,AK酶活性降低30%左右;14 d后幼虫的死亡率达50%左右,显著高于对照组幼虫的死亡率。【结论】AK基因在上述4种鳞翅目害虫中为组成型表达,RNAi抑制AK基因的表达可导致4种害虫的幼虫死亡,研究结果为开发以AK基因为靶标的鳞翅目害虫防治新技术提供了理论依据。     

RNAi和取食不同品种水稻后白背飞虱多铜氧化酶4基因的表达差异及生物学效应

【目的】分析RNAi及取食不同品种水稻后白背飞虱Sogatella furcifera多铜氧化酶4(multicopper oxidase 4, MCO4)基因的表达差异和生物学效应,以期为该基因的功能研究提供理论依据。【方法】通过生物信息学技术方法分析白背飞虱MCO4基因的核苷酸和氨基酸序列;利用RNAi技术沉默白背飞虱3龄若虫的MCO4基因,检测显微注射法和饲喂法的沉默效率,研究该基因被干扰后对白背飞虱3龄若虫存活率的影响;白背飞虱成虫取食不同抗性水稻品种24 h后,采用RT-qPCR检测其体内MCO4基因表达量的变化,并统计其体重。【结果】白背飞虱MCO4基因的核苷酸序列全长为2 166 bp,编码721个氨基酸。显微注射法进行MCO4基因的RNAi可成功沉默白背飞虱的MCO4基因,且沉默效率远高于饲喂法。MCO4基因被RNAi沉默后白背飞虱3龄若虫存活率显著低于正常若虫的。与取食水稻感虫品种TN1相比,取食水稻抗虫品种IR26的成虫MCO4基因表达量显著增加,且成虫体重显著降低。【结论】显微注射法可以更好地干扰白背飞虱MC04基因的表达。沉默MCO4基因对白背飞虱3龄若虫的存活率有显著影响,我们推测MCO4基因在白背飞虱取食水稻中具有重要的作用。     

中蜂囊状幼虫病毒RdRp基因dsRNA干扰的研究

中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)可以引起中蜂幼虫死亡,给中蜂的养殖造成严重的威胁。其RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)是病毒复制中必不可少的中心酶,控制着病毒的复制和翻译过程。本研究以CSBV RdRp基因为靶标,选取两个干扰区域RdRp-1和RdRp-2,并构建相应的dsRNA表达载体,获取dsRNA后进行RNAi实验,通过qRT-PCR检测CSBV RdRp基因的表达情况。实验结果显示:干扰片段RdRp-1不能显著下调RdRp基因的转录,而干扰片段RdRp-2可显著性下调RdRp表达并具有剂量依赖性,当添食2μg dsRdRp-2时,在72 h RdRp基因表达下调了85%,CSBV的衣壳蛋白VP1基因下调表达78%,幼虫死亡率降低60%,表明RdRp基因可以作为RNA干扰的靶标用于CSBV防治,本研究为后期在养蜂场进行蜜蜂病毒病的防治奠定了基础。     

家蚕吡哆醛激酶基因干扰降低转氨酶基因的转录表达

【目的】维生素B₆在氨基酸代谢中是多种酶的辅酶,维持氨基酸代谢的正常运行。磷酸吡哆醛（pyridoxal-5′-phosphate, PLP）是维生素B₆的主要辅酶形式,吡哆醛激酶（pyridoxal kinase, PLK）是PLP的重要生成酶,本研究试图明确PLK基因与PLP依赖酶之间转录水平的调节关系。【方法】本研究采用RNA干扰（RNA interference, RNAi）方法对家蚕 Bombyx mori 的PLK基因进行干扰,通过体外合成PLK基因的3个干扰片段（siRNA1, siRNA2和siRNA3）,将siRNA从体腔注入5龄第3天的家蚕幼虫体内诱导RNAi。利用荧光定量PCR测定不同干扰片段、不同时间点及不同组织中PLK基因表达量的变化;并测定家蚕体内磷酸丝氨酸转氨酶（phosphoserine aminotransferase, SerB）和天门冬氨酸氨基转移酶（asparate aminotransferase, AST）基因的表达量。【结果】注射干扰片段后48 h干扰效果达到最佳。3个干扰片段干扰效果从高到低依次为siRNA1, siRNA2和siRNA3。RNAi效果最好的是中肠组织,其PLK基因的相对表达量下降了55%。RNA干扰PLK基因后,后部丝腺中SerB和AST基因相对表达量分别下降了90%和29%。【结论】本研究通过RNAi实现了家蚕PLK基因干扰,并进一步证明了家蚕PLK基因和SerB基因及AST基因存在联动调节关系。     

昆虫RNA干扰中双链RNA的转运方式

昆虫RNA干扰主要指外源双链RNA诱发的,通过阻碍特定基因的翻译或转录,引起内源目标信使RNA沉默的机制。由于RNA干扰的特异性,RNA干扰技术主要应用于昆虫功能基因组和害虫防治的研究。本综述主要对双链RNA引起昆虫体内RNA干扰研究中双链RNA转运的3种方法(显微注射法、喂食法及浸泡与转染法)进行介绍和讨论。这3种方法中,显微注射法能将精确数量的双链RNA迅速转运到目标组织,更适合实验室基因功能的研究;喂食法操作简单快速,适合高通量的基因筛选;浸泡与转染法也适合大规模的基因筛选,但更常见于细胞研究中。     

白背飞虱气味结合蛋白SfOBP11与寄主选择行为的相关性研究

【目的】研究白背飞虱Sogatella furcifera气味结合蛋白的生物学功能,筛选与寄主植物气味感知过程相关的关键基因,为研发基于RNAi的白背飞虱防控策略提供理论依据。【方法】利用显微注射法对触角中特异性高表达的SfOBP11进行RNA干扰,并使用实时荧光定量PCR检测干扰效率,最后采用H型嗅觉选择仪观察白背飞虱对寄主水稻识别能力的变化。【结果】SfOBP11 mRNA相对表达水平在注射48 h后显著下降,但试虫的存活率未受影响。注射SfOBP11 dsRNA的若虫对寄主水稻的识别能力降低。【结论】SfOBP11可能在白背飞虱识别寄主水稻挥发物的过程中发挥重要作用。     

LncRNA63及其共表达基因Hr3在家蚕中的表达和功能分析

【目的】本研究旨在通过对一个新的长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)及其共表达基因在家蚕Bombyx mori中的表达和功能进行分析,进一步阐明lncRNA在调控家蚕变态发育中的分子机制。【方法】基于前期家蚕脂肪体转录组测序数据,我们发现在蜕皮激素20E(2 μg/μL)处理5龄幼虫早期的脂肪体中lncRNA63表达显著上调,家蚕激素受体基因Hr3与之共表达。利用qRT-PCR对lncRNA63和Hr3在家蚕不同发育时期(4-5龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(头、体壁、血淋巴、中肠、马氏管、脂肪体、丝腺、精巢和卵巢)和2 μg/μL 20E处理2, 6, 12和24 h后5龄幼虫脂肪体中的表达谱进行分析;采用核质分离检测和原位杂交技术检测lncRNA63在家蚕BmN细胞中的定位;利用dsRNA干涉家蚕5龄幼虫个体中lncRNA63的表达,并利用qRT-PCR检测RNA干涉lncRNA63对头、丝腺、脂肪体和体壁中Hr3表达的影响。【结果】qRT-PCR结果表明,lncRNA63和Hr3在家蚕羽化前的蛹末期有一个表达高峰;二者在家蚕5龄幼虫头、体壁和丝腺中都有较高表达;lncRNA63和Hr3在2 μg/μL 20E处理2, 6和12 h的家蚕5龄幼虫脂肪体中较对照组(无水乙醇处理组)都显著上调,24 h下降到与对照组相当水平,二者的表达趋势完全一致。LncRNA63主要定位于BmN细胞核,但20E可诱导lncRNA63的核质迁移。利用dsRNA干涉lncRNA63表达后,Hr3的表达显著下调。【结论】20E不仅可调控lncRNA63的表达,还可诱导lncRNA63的核质迁移;lncRNA63可通过调控共表达基因Hr3的表达参与家蚕的变态发育过程。     

家蚕RNAi效率相关核酸酶基因对RNAi效率的影响

【目的】鳞翅目(Lepidoptera)昆虫消化系统存在的核酸酶是导致RNAi低效的主要原因之一，本研究旨在探索家蚕Bombyx mori RNAi效率相关核酸酶(RNAi efficiency-related nuclease, REase)BmREase对家蚕RNAi低效的影响。【方法】利用RT-PCR对家蚕BmREase cDNA全长序列进行同源克隆和生物信息学分析，并采用最大似然法进行系统发育分析；利用qRT-PCR检测BmREase在游走期家蚕不同组织(头、表皮、脂肪体、中肠、气管、马氏管和丝腺)中的特异性表达。通过向游走期家蚕注射BmREase,家蚕蜕皮激素受体(ecdysone receptor, EcR)基因BmEcR,超气门蛋白(ultraspiracle, USP)基因BmUSP和细胞因子sp?tzle1(BmSpz1)基因BmSpz1的dsRNA进行RNAi,分析干扰BmREase表达后是否可以提高靶基因dsRNAs的干扰效率。【结果】RT-PCR扩增得到家蚕BmREase(GenBank登录号：XM＿021350017.2)全长cDNA序列，其ORF长2 241...     

灰飞虱海藻糖酶基因的克隆及RNA干扰效应

RNA干扰（RNAi）不但可以用于研究基因的功能, 还可以通过沉默靶标基因干扰特定的生命过程。因此, 通过深入研究, 发掘高效专一性靶基因和RNAi技术, 有可能开辟针对性的害虫RNAi防控新途径。本研究通过灰飞虱Laodelphax striatellus转录组数据分析并结合RACE技术, 克隆了灰飞虱两种海藻糖酶的全长基因, 分别命名为LSTre-1和LSTre-2, 其GenBank登录号分别为JQ027050和JQ027051。它们均具有海藻糖酶基因的典型特征, 与已报道的其他昆虫的海藻糖酶基因具有很高的相似性, 并表现出一定的虫种亲缘关系。其中LSTre-1为水溶性海藻糖酶基因, 全长2 042 bp, 开放阅读框编码602个氨基酸, 前端有25个氨基酸的信号肽, 但无跨膜结构域; LSTre-2为膜结合型海藻糖酶基因, 全长2 619 bp, 开放阅读框编码618个氨基酸, 前端有26个氨基酸的信号肽, 有2个疏水性跨膜结构域。利用喂食法研究2种海藻糖酶基因dsRNA对灰飞虱的致死效应, 发现靶向水溶性酶基因的干扰效应略高于靶向膜结合型的, 但两种海藻糖酶基因的dsRNA都可以显著抑制灰飞虱海藻糖酶基因的表达, 降低其活力, 还能显著抑制试虫的生长, 大幅增加试虫死亡率。 结果提示, 通过适宜途径干扰海藻糖酶基因可以开发防治灰飞虱的新途径。     

小菜蛾抑制性谷氨酸受体的RNA干扰

谷氨酸门控的氯离子通道（glutamate-gated chloride channels, GluCls）或抑制性谷氨酸受体（inhibitory glutamate receptor, IGluR）是阿维菌素类药剂（avermectins）主要的作用靶标, 目前人们对于昆虫的IGluR知之甚少。本实验采用RNA干扰（RNAi）技术对小菜蛾Plutella xylostella IGluR的功能进行了初步研究。结果表明： 小菜蛾2龄和3龄幼虫中双链RNA（dsRNA）的最佳注射量分别为50.6 nL和71.3 nL。实时荧光定量（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）检测结果表明, 2龄和3龄幼虫在注射dsRNA 36 h和24 h后IGluR基因的转录后水平分别下降了32.67%和49.30%。幼虫发生RNA干扰后对阿维菌素的敏感性结果显示, 注射了IGluR dsRNA的幼虫死亡率显著低于对照。结果说明, 小菜蛾IGluR是阿维菌素的潜在靶标之一, 为进一步阐明小菜蛾对阿维菌素靶标抗性机理奠定了基础。     

利用RNAi技术沉默小菜蛾类钙粘蛋白基因

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种调控基因表达的方法, 其通过体外合成一段与内源靶基因同源的双链RNA（dsRNA）或siRNA, 导入生物体内, 使内源靶基因中同源mRNA降解, 从而达到阻抑基因表达的目的。类钙粘蛋白（cadherin-like protein）是位于昆虫中肠刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles, BBMV)上与钙粘蛋白(cadherin)结构相似的物质, 是多种昆虫体内Bt杀虫蛋白的受体。本研究利用基因特异引物通过RT-PCR扩增了小菜蛾类钙粘蛋白基因的2个片段（CAD1和CAD2）, 合成相对应的双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）; 并将dsRNA通过显微注射导入小菜蛾3龄幼虫体内, 测定了不同靶位点、不同剂量、不同检测时间对目的基因mRNA表达量的影响。结果表明: 将70 nL CAD1对应的dsRNA注射到幼虫体内48 h后, 基因表达量显著下降, 72 h后恢复。免疫印迹检测结果表明, 类钙粘蛋白在注射dsRNA 48 h后幼虫BBMV中的含量明显下降。本实验成功实现了小菜蛾类钙粘蛋白基因的沉默, 该体系的成功建立为利用RNAi技术分析小菜蛾及其他鳞翅目昆虫基因的功能提供了参考。     

利用RNAi技术研究果蝇心脏发育基因的功能

RNAi是近两年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法。它通过导入一段与内源基因同源的双链RNA序列（dsRNA）,使内源mRNA降解,从而达到阻抑基因表达的目的。目前已在线虫、果蝇、臭虫、真菌及植物等生物中建立RNAi技术,用于研究某些特定基因或已知基因在特定发育时期的功能。对于难于获得突变体的基因或生物体,RNAi技术尤其有效。虽然果蝇心脏发育基因wingless和tinman在果蝇心脏发育的早期功能已经清楚,它们都与果蝇心脏前体细胞的形成有关,但它们在果蝇心脏发育的后期功能仍有待进一步研究。实验运用RNAi技术,分别将tinman和wingless的dsRNA注入果蝇的早期胚胎,得到了这两个基因的dsRNA干扰表型,与两个基因的突变体表型非常相似,都表现为果蝇心脏前体细胞不能形成或心脏管缺失。尤其是tinman基因的dsRNA,还引起了肠中胚胎层缺失和体壁肌肉组织的紊乱,而wingless基因的dsRNA却只影响心脏的形成,而不影响肠中胚层,说明dsRNA干扰具有非常强的特异性,因而不失为研究果蝇心脏发育基因功能的有效方法。     

暗黑鳃金龟UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因的克隆、原核表达及功能分析

【目的】本研究旨在阐明暗黑鳃金龟Holotrichia parallela UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因HpUAP的序列特征和功能。【方法】通过PCR方法从暗黑鳃金龟2龄幼虫中扩增HpUAP全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;构建pET30a-HpUAP重组表达载体,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达;利用qRT-PCR检测HpUAP在暗黑鳃金龟幼虫不同发育阶段(1-3龄幼虫)和3龄第2天幼虫不同组织(体壁、中肠、直肠、回肠、马氏管和脂肪体)中的表达量。利用RNAi沉默暗黑鳃金龟2龄幼虫体内HpUAP基因后,观察其生长发育和存活情况,并测定RNAi 72 h后其HpUAP表达量和体壁几丁质含量。【结果】PCR扩增获得暗黑鳃金龟HpUAP 全长cDNA序列(GenBank登录号: MW676788),开放阅读框长1 461 bp,编码486个氨基酸残基,蛋白分子量约为53.9 kD。系统进化分析发现HpUAP与似牛嗡蜣螂Onthophagus taurinus UAP的氨基酸序列以较高的置信度聚为一个分支。经IPTG诱导可表达53.9 kD的HpUAP蛋白,与预期大小一致。发育表达谱结果表明HpUAP在1龄第1天和3龄第1天暗黑鳃金龟幼虫中表达量较高,组织表达谱结果表明HpUAP在暗黑鳃金龟3龄第2天幼虫中肠和体壁中表达量较高。HpUAP RNAi导致暗黑鳃金龟2龄幼虫生长与行动缓慢,体表颜色加深并皱缩;RNAi处理72 h后,与对照组（dsGFP注射组）相比,dsHpUAP注射组HpUAP表达量下降了93.06%,死亡率增加了40%左右,表皮几丁质含量下降了约29%。【结论】结果说明HpUAP参与几丁质代谢,在暗黑鳃金龟幼虫的生长发育过程中起关键作用。     

光滑鳖甲肽聚糖识别蛋白ApPGRP的表达与功能分析

【目的】旨在研究光滑鳖甲Anatolica polita肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)基因ApPGRP表达模式及其对下游免疫相关基因的表达调控,以及重组蛋白ApPGRP与细菌的结合能力。【方法】构建原核表达载体pET-28a-ApPGRP,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),诱导表达并纯化重组蛋白His-ApPGRP,分别测定其与金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和肽聚糖(peptidoglycan, PGN)的结合能力。金黄色葡萄球菌S.aureus刺激后,利用qRT-PCR检测光滑鳖甲6龄幼虫体内ApPGRP、抗菌肽基因ApAttacin2和ApAttacin1、防御素基因ApDefensin、丝氨酸蛋白酶基因ApSP和丝氨酸蛋白酶抑制剂基因ApSerpin等免疫相关基因的表达水平;采用RNAi技术沉默光滑鳖甲6龄幼虫体内ApPGRP基因的表达,并利用qRT-PCR分别检测RNAi处理以及RNAi后再用S.aureus刺激时幼虫体内上述基因的表达水平变化。【结果】通过原核表达获得了重组蛋白His-ApPGRP,其具有结合金黄色葡萄球菌和肽聚糖的能力。注射金黄色葡萄球菌后,检测的光滑鳖甲6龄幼虫免疫相关基因(ApSP除外)的表达都显著上调;RNAi沉默光滑鳖甲6龄幼虫ApPGRP后,其他免疫相关基因表达量均显著降低,其响应金黄色葡萄球菌刺激后的表达量也显著低于对照组。【结论】这些结果表明,ApPGRP在光滑鳖甲免疫防御中起着识别外源微生物,激活信号通路并调控抗菌肽表达的作用。     

增效醚对二化螟幼虫7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶和羧酸酯酶活性的影响

【目的】通过研究二化螟Chilo suppressalis细胞色素P450酶活性特征及增效醚(piperonyl butoxide,PBO)对二化螟幼虫7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶(ECOD)和羧酸酯酶(Car E)活性影响的时间效应,为有效进行二化螟的防治及抗药性治理提供基础的研究数据。【方法】采用以7-乙氧基香豆素为底物的荧光比色法,测定了不同龄期二化螟ECOD活性,并研究了经PBO(0.69μg/头)点滴处理后24 h内每隔1 h二化螟4龄幼虫ECOD及Car E活性的变化。【结果】二化螟的ECOD活性从1龄幼虫至蛹期呈现出先升高后降低的变化趋势,其中ECOD活性在4龄幼虫期升至最高值14.11±1.01 pmol/mg pro·min,而在蛹期降到最低值(1.34±0.11 pmol/mg pro·min)。PBO处理对二化螟4龄幼虫ECOD活性的影响具有随时间而变化的抑制-诱导-抑制的动态效应:在处理后4-9 h,PBO对ECOD活性具有抑制作用,其中在处理后6 h时的抑制作用最强,抑制率达到21%;在处理后10-11 h,PBO诱导了ECOD活性升高;在处理后15-17 h,又表现为抑制作用。PBO处理二化螟后10-12 h和18-20 h对二化螟的Car E活性具有诱导作用,而在14-17 h和20-21 h表现为抑制作用。【结论】不同龄期二化螟幼虫及蛹的ECOD活性存在一定差异。PBO点滴处理对二化螟4龄幼虫的ECOD和Car E活性具有时间依赖的抑制或诱导效应。