除草剂草铵膦对转基因抗草铵膦棉花生长发育的影响

【背景】草铵膦是继草甘膦之后又一种高效、广谱、低毒的非选择性除草剂,有望成为我国转基因抗除草剂棉花的主要靶标之一。目前,在抗草铵膦棉花的不同生育期使用草铵膦是否影响棉花生长发育尚不清楚。【方法】分别在抗草铵膦棉花子叶期、3~4片真叶期、现蕾期、盛花期喷施草铵膦,单次施药量分别为900和1800 g·hm-2,每个处理小区面积25.6 m2。分析草铵膦对花粉育性、棉花生长、产量及纤维品质的影响。【结果】喷施草铵膦对棉花盛花期的花粉活力、株高、茎直径、产量因子、纤维品质等各项参数均无显著性影响,在子叶期使用1800 g·hm-2的高剂量浓度处理时,籽指水平显著低于空白对照处理。【结论与意义】转基因抗草铵膦棉花对900、1800g·hm-2的草铵膦具有较好的耐受性。本研究为转基因抗草铵膦棉花的环境安全性评价提供了依据。     

抗草铵膦转基因水稻品种的快速检测方法的比较

用种子萌发生测法和分子检测法分别检测抗草铵膦转基因水稻品种 ,比较这两种方法的优劣。种子萌发生测法以芽长作为指标优于根长 ,草铵膦处理浓度可在 10mg/L～ 10 0mg/L之间。分子检测用引物对 5′ ACCATCGTCAACCACTACATCG 3′和 5′ GCTGCCAGAAACCCACGTCAT 3′或 5′ ACCATCGTCAAC CACTACATCG 3′和 5′ GAGGTCGTCCGTCCACTCCTG 3′均可扩增导入的bar基因的特异DNA片段。种子萌发生测法具有简单、易操作特点 ,而分子检测法则具有快速、专一性强、灵敏度高等特点。     

抗草丁膦和抗草甘膦转基因油菜的抗性基因向野芥菜的流动

通过人工去雄授粉和田间隔行种植试验,研究了抗草丁膦和抗草甘膦转基因油菜(Brassica napus)中的bar基因和EPSPS基因向野芥菜(B. juncea var. gracilis)流动的可能性。结果表明在人工授粉的情况下,以野芥菜为母本,分别以两种转基因油菜为父本,亲和性指数都很高,达13以上,与野芥菜自交或开放授粉条件下的亲和性指数没有明显差异,说明两种转基因油菜和野芥菜的亲和性较好。经两次除草剂筛选,人工杂交获得的所有F₁对相应的除草剂都表现出了明显的抗性,且经PCR检测扩增出了各自的特异性条带,说明人工杂交获得的所有F₁都携带了相应的抗性基因。F₁的适合度研究表明,两种F₁种子萌发率和母本都没有明显差异,营养生长明显好于母本。但花粉活力和结实率明显下降,携带抗草丁膦基因F₁的花粉活力和每角果粒数分别是32.4%和0.59粒,携带抗草甘膦基因F₁的花粉活力和每角果粒数分别是35.1%和0.58粒。经两次除草剂筛选和PCR检测,表明野芥菜和抗草丁膦油菜或与抗草甘膦油菜田间隔行种植分别能产生0.02%和0.014%的携带抗性基因的F₁杂种。以上结果表明抗除草剂转基因油菜的抗性基因具有向野芥菜流动的可能性,且bar和EPSPS基因向野芥菜流动的可能性类似,但对其可能引起的环境后果需要做进一步地深入研究。     

寡聚核苷酸介导的基因突变技术创制抗除草剂烟草新种质北大核心CSCD

为进一步优化烟草(Nicotiana tabacum)品种‘K326’的种质,该研究采用寡聚核苷酸介导的基因突变(oligonucleotide-mediated mutagenesis,OMM)技术,利用植物中支链氨基酸合成途径中第一个关键酶——乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase,ALS)突变后烟草对氯磺隆除草剂不敏感且产生抗性的特征,以及NCBI报道的ALS基因序列同源克隆了烟草品种‘K326’中的ALS基因,并根据ALS基因序列设计用于定点突变的RNA/DNA嵌合体,导入烟草品种‘K326’创制对氯磺隆除草剂具有抗性的烟草新种质。结果表明:(1)烟草品种‘K326’具有2条ALS基因,即ALS SuRA和ALS SuRB,大小分别为2004 bp和2010 bp。(2)根据2个基因的保守位点ALS SuRA 588脯氨酸位点和ALS SuRB 1719色氨酸位点设计用于ALS基因核苷酸第588位点的Chl-588嵌合体和第1719位点的Chl-1719嵌合体。(3)利用基因枪成功将这2个片段导入烟草愈伤组织,愈伤组织依次经抗性芽分化和生根,共获得氯磺隆抗性植株22株。(4)抗性植株ALS酶活性测定显示,8株抗性植株具有较强的活性,进一步对抗性植株中跨突变位点保守扩增、测序,最终确定有2株(f11和b18)分别在588、1719位点产生定点突变。综上认为,该研究在获得烟草品种‘K326’抗氯磺隆新种质同时,也为培育抗性烟草新种质提供了理想的亲本材料。     

转基因抗除草剂油菜对十字花科杂草的基因漂移

以转基因抗除草剂油菜Q3为花粉供体材料,油菜远缘杂草为花粉受体材料,在自然传粉和人工辅助授粉条件下研究甘蓝型油菜与十字花科杂草间的基因漂移频率。结果表明,以转基因油菜为父本,十字花科杂草荠菜、碎米荠、播娘蒿、诸葛菜、风花菜、遏蓝菜和菜为母本,杂交高度不亲和,基因漂移率为0 % ,无生态风险,但对野芥菜的基因漂移率高达0 .885 %。野芥菜是我国大部分地区的常见杂草,种类繁多,分布范围广,大面积种植转基因抗除草剂油菜对野生芥菜的基因污染应引起高度重视。     

连续单一除草剂应用情况下的转基因直播稻田杂草群落动态

【背景】转基因抗除草剂水稻种植将导致连年连续使用单一目标除草剂,势必会影响杂草群落结构的变化,但其变化规律至今还不十分明确。【方法】于2011~2013年,连续3年在直播种植抗草铵膦转基因Bar68-1水稻田中,使用灭生性除草剂草铵膦,持续观察期间杂草群落结构变化,并与常规选择性除草剂丙草胺—苄嘧磺隆（丙·苄）的应用情况进行对比,以揭示由于种植转基因抗除草剂水稻而使用单一除草剂对稻田杂草群落结构的影响。【结果】草铵膦和丙·苄连续使用后,杂草的物种丰富度和总杂草密度均逐年显著降低。随草铵膦使用年限增加,控草效果持续提高并达到优良水平,而常规选择性除草剂丙·苄的长期使用,致使多年生杂草双穗雀稗演替为群落的优势种,杂草密度呈逐年增加的趋势,导致生物多样性指数显著降低。【结论与意义】抗除草剂转基因水稻种植,在抗性杂草演化之前,不会因单一灭生性除草剂的应用而导致杂草群落迅速朝不良方向演替。长期的群落演替还需要进一步研究观察。     

转基因抗除草剂油菜对近缘作物的基因漂移

以转基因抗除草剂油菜 Q3和 HCN- 19为花粉供体材料 ,油菜近缘作物为花粉受体材料 ,在自然授粉条件下研究甘蓝型油菜与芸薹属近缘作物间的基因漂移频率。结果表明 ,油菜对芸薹属 6个种甘蓝、黑芥、埃芥、芥菜型油菜、白菜型油菜和甘蓝型油菜的基因漂移率分别为 0、0 .0 2 4 %～ 0 .2 4 3%、 0 .0 2 8%～ 0 .0 92 %、 0 .10 9%～ 0 .95 1%、 0 .4 79%～ 0 .879%、 1.2 5 2 %～2 .191%。且基因漂移频率受多种因素影响 ,其中与杂交亲和性、花期同步率、种植面积等高度相关。通过花粉将抗除草剂基因漂移给近缘作物 ,油菜是需要特别关注的作物     

抗芜菁花叶病毒转基因甘蓝型油菜的研究

以子叶柄为材料,建立了甘蓝型油菜（ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．）双低品种的再生体系。通过子叶柄与农杆菌（ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４）共培养,将表达载体ｐＢＴｕ中芜菁花叶病毒外壳蛋白（ＴｕＭＶ－ＣＰ）基因以整合方式导入甘蓝型油菜,然后用卡那霉素进行筛选,获得了油菜再生植株。经ＰＣＲ特异性扩增、点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析,证明再生植株基因组ＤＮＡ中整合了ＴｕＭＶ－ＣＰ基因。攻毒实验表明,有ＴｕＭＶ－ＣＰ基因插入的工程油菜对ＴｕＭＶ均有不同程度的抗性。     

油菜的遗传转化及抗溴苯腈转基因油菜的获得

以油菜(Brassica napus L.)的下胚轴和子叶为转化受体,建立了油菜的高效转化系统。在此基础上,将抗除草剂溴苯腈基因(bxn基因)导入油菜,获得了抗溴苯腈转基因油菜。分子检测实验证明,转基因油菜中含有bxn基因。转基因油菜可抗高达10~(-3)mol/L的溴苯腈。     

芥菜型油菜细胞质雄性不育系WJS01A的比较鉴定北大核心CSCD

芥菜型油菜细胞质雄性不育(CMS)系WJS01A是一种稳定不育系,其败育彻底,不受环境条件的影响。该研究从形态、细胞特征、遗传和分子生物学等方面对WJS01A进行鉴定,以揭示其败育机制,为该不育系在油菜育种中的应用提供理论基础。结果表明:(1)不育系WJS01A的花序结构与正常芥菜型油菜差异不大,但在花蕾饱满度、花朵张开度及花瓣长度和宽度方面略低于正常的芥菜型油菜;它的雌蕊发育正常,但花药、花丝缩短,致使雄蕊高度显著低于柱头,花药白化无花粉产生。(2)将WJS01A衍生的甘蓝型油菜背景不育系WNJ01A以及Polima(Pol)、Ogura(Ogu)和Kosena(Kos)不育系分别与其恢复系或保持系测交,结果显示来源于WJS01A的不育类型与Pol、Ogu和Kos等材料的恢保关系明显不同,仅Hui01可以恢复WNJ01A的育性。(3)不育系WJS01A属于无花粉囊型不育,败育时期为花药原基到孢原细胞时期。(4)线粒体不育基因多重PCR可以明显区分WJS01A、WNJ01A与Pol、Ogu、Kos,但是目前的引物组合不能区分WJS01A与正常的芥菜型油菜。(5)线粒体基因组的限制性片段长度多态性(RFLP)分析表明,在所检测的8个探针/酶组合中均可以将不育系WJS01A与其他4种细胞质雄性不育系区分开,说明WJS01A是一种显著不同于Pol、Ogu和Kos等的细胞质雄性不育类型。WJS01A的利用可以丰富和拓宽当前油菜杂种优势利用的遗传基础,为缓解当前油菜杂种优势利用中不育胞质单一性问题提供新的种质。     

根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生

用根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ）共培养法把外源基因导入甘蓝型油菜（Ｂｒａｓｓｉ－ｃａ ｎａｐｕｓＬ．）主要栽培品种“云北２ 号”,获得转基因植株。所用外植体为带有１—２ ｍ ｍ 子叶柄的完整子叶,根癌农杆菌为Ａ２０８ＳＥ（ｐＴｉＴ３７－ＳＥ, ｐＲＯＡ９３）。Ｔｉ质粒ｐＲＯＡ９３ 带有ＮＰＴⅡ及ＧＵＳ嵌合基因。共培养２ 天后转到附加２５ ｍ ｇ／Ｌ卡那霉素的分化培养基（ＭＳ＋ ４．５ ｍ ｇ／ＬＢＡＰ）上。ＡｇＮＯ３ 和羧苄青霉素促进芽的分化,头孢霉素则有抑制作用。最高转化频率为２７％ 。把分化出的茎芽切下,插入含有２５ ｍ ｇ／Ｌ卡那霉素的生根培养基中。羧苄青霉素不利于根的形成。把完整抗性植株移入盛土壤的盆中,生长状况良好。测定β－葡糖苷酸酶活性,８４％ 明显高于对照。以ＮＰＴⅡ基因作探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析,证实外源基因已插入到植物细胞基因组中     

芹菜雄性不育的创制及线粒体不育候选基因鉴定北大核心CSCD

芹菜花小、花多及花发育不一致,以及种子小等特点,限制了芹菜杂交育种及制种。为此,创制雄性不育性彻底的不育材料,对于芹菜遗传育种及制种具有积极意义。本研究以津南实芹为材料,于2017年利用辐射诱变的方法,获得一份芹菜雄性不育材料(命名为:QCBU-001)。通过多年田间研究表明,QCBU-001花药彻底肉质化,无法形成花粉,能够自由接收外来花粉,形成种子。杂交试验表明,QCBU-001杂交种子能够正常发芽生长,杂交优势明显。线粒体基因组分析表明,QCBU-001线粒体基因组长度为260,872 bp,含有52个mRNA,21个tRNA和7个rRNA。进一步与NCBI上公布的不育芹菜材料W99A和可育材料W99B线粒体基因组比对,以及设计引物对津南实芹线粒体基因克隆均表明了QCBU-001是由Cox 1发生突变导致其不育。为此,QCBU-001为芹菜CMS雄性不育材料,可用于芹菜杂交育种和制种中。     

甘蓝型油菜Fad2基因的RNA干扰及无筛选标记高油酸含量转基因油菜新种质的获得

利用已获得的油莱种子贮存蛋白——十字花科蛋白（cruciferin）基因的启动子和终止子,构建了无选择标记基因且同时具有正义及反义结构的油酰去饱和酶基因（Fad2）种子特异表达RNAi载体,并通过农杆菌介导的转化,获得了只含有油菜原有基因且Fad2基因表达受抑制的转基因植株。RT—PCR分析结果表明,在油酸含量达到83.9％的转基因植株中未检测到在非转基因植株中普遍存在的Fad2基因转录mRNA——一种典型的RNA干扰现象。通过对植株生长发育状态的观察比较,该高油酸含量转基因株系并未表现出双突变体中由于Fad2基因的失活所引起的植株抗寒能力差、发育迟缓、花蕾死亡、结实率低等不利农艺学性状。     

以草甘膦为筛选标记的大豆转基因体系的建立及抗除草剂转基因大豆的培育

抗草甘膦转基因大豆能显著提高大豆生产效率,具有重大的应用前景.本实验室前期研究建立了农杆菌介导、草胺膦为筛选剂的大豆转基因体系,转化效率在4%以上.在此基础上,利用G6-EPSPS和G10-EPSPS 2个具有自主知识产权的草甘膦抗性基因,通过优化转化体系,成功建立了以草甘膦为筛选剂的大豆遗传转化体系,转化效率达1%以上.浓度梯度实验发现,当草甘膦的筛选浓度为100 mg/L时,虽然丛生芽的再生率下降了50%～60%,但最终转化效率不受影响.进一步通过基因表达分析、Western blot、Southern blot和除草剂抗性鉴定等方法对转基因大豆进行了分子检测和验证,最后获得了分子特征明确、对草甘膦抗性稳定的抗草甘膦转基因大豆后代.结果对国内抗草甘膦转基因大豆转基因方法研究及抗除草剂新品种选育具有意义.     

小麦-冰草多粒新种质的抗白粉病和高分子量麦谷蛋白亚基组成分析北大核心CSCD

穗粒数是决定小麦产量的三因素之一,因此通过远缘杂交创造多粒新种质,对于拓宽小麦育种的遗传基础和促进育种水平的持续提高具有重要意义。本研究以通过多年多点鉴定证明具有多粒特性(粒数/穗>80)的31份普通小麦-冰草(Agropyron cristatum,2n=4x=28,PPPP)衍生后代为材料,通过田间接种白粉病生理小种E09进行抗病性鉴定、采用SDS-PAGE方法进行高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)组成分析以及株高、有效分蘖等农艺性状调查,发现26份材料表现抗白粉病,12份材料具有优质高分子量麦谷蛋白亚基组合,亚基组成为(2*,7+8,5+10)或(1,7+8,5+10)。其中,8份材料的穗粒数大于80粒、株高小于75 cm、抗白粉病且具有优质高分子量麦谷蛋白亚基组合,这为未来培育兼具高产、优质、抗白粉病小麦新品种提供了重要的物质基础。此外,对多粒、抗白粉病和优质亚基的可能来源进行了讨论。     

文心兰OnFNR基因的克隆及抗软腐病功能鉴定北大核心CSCD

为了解铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶(FNR)在文心兰抵御软腐病过程中的作用,该研究采用RACE技术从文心兰‘小樱桃’中克隆到一条OnFNR基因(登录号为KX461908),分析其序列特性和编码蛋白亚细胞定位情况,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析其在不同组织部位以及不同软腐病感病阶段的表达模式,构建OnFNR过表达载体并转化文心兰原球茎(PLBs),对转基因原球茎进行软腐病抗性评价。结果显示:(1)文心兰OnFNR基因开放阅读框长为1080 bp,预测可编码含359个氨基酸、分子量为40066.14 Da、等电点为8.72的碱性蛋白;OnFNR具有典型的FAD结合结构域和NADP+结合结构域,定位于叶绿体。(2)多序列比对和进化树分析发现,OnFNR与其他植物LFNR聚为一类,并与小兰屿蝴蝶兰LFNR的相似度最高(89.1%)。(3)qRT-PCR结果显示,OnFNR在文心兰叶中的表达量最高,其次是假鳞茎与花,根中最低;文心兰植株接种软腐病病原菌1 d后叶片和假鳞茎的OnFNR基因表达量呈现极显著下调,并且在5个感病阶段的表达量均低于健康植株。(4)成功构建过表达载体pCAMBIA1301-OnFNR,并经农杆菌EHA105侵染成功转入文心兰PLBs,获得过表达OnFNR转基因原球茎16个;在过表达OnFNR文心兰PLBs中,OnFNR与Fd基因表达均呈现极显著上调,尤其是Fd表达量上调至对照(非转基因PLBs)的3.67倍,且过表达OnFNR的PLBs在软腐病病原菌侵染第4天的存活率仍有48.88%,而对照的存活率只有6.66%。研究表明,文心兰OnFNR是一个定位于叶绿体的光合型铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶,过表达OnFNR能够明显提高文心兰植株的抗病性,推测OnFNR在植物抵抗病毒以及ROS爆发中具有重要作用,且过表达OnFNR可能通过提高LET的电子传递效率,进而提高Fd的表达量达到促进MAPK通路信号传导的效果。     

王不留行中刺桐碱的分离鉴定及抗炎活性研究北大核心CSCD

利用有机溶剂萃取、制备型薄层层析、半制备高效液相色谱三步分离法从王不留行中分离出生物碱物质,鉴定并探讨其抗炎活性。王不留行种子经石油醚脱脂、乙醇回流提取,二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取,获得水饱和正丁醇相(组分A3)。组分A3经制备型薄层层析分离,展开剂为正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5,上层),于紫外灯254 nm、365 nm下检视,分为7个组分(组分B1~B7)。含量高且峰形简单的组分B2经半制备高效液相色谱分离,甲醇-水作为流动相,获得1个单体化合物(样品I)。经HPLC分析,样品I纯度高于98%。通过化学反应、UV、IR、LC-MS、1H NMR、13C NMR多种波谱分析方法对该化合物进行结构解析,确定其分子式为C14H18N2O2,化学名称为N,N,N-三甲基色氨酸,中文名为刺桐碱(hypaphorine),属于吲哚类生物碱。再采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀的炎症模型,观察刺桐碱的抗炎效果。连续给药6 d后,刺桐碱剂量为25 mg·kg-1时,可显著抑制小鼠耳廓肿胀,肿胀抑制率为52.02%。与阿司匹林(200 mg·kg-1)的肿胀抑制率(67.48%)相比,无显著性差异。本研究首次采用一条新工艺路线获得王不留行刺桐碱,并发现其在整体水平上具有抗炎活性,有望成为化学一类新药的候选分子。     

新型抗除草剂棉花不育系Yu98-8A1的培育及鉴定

通过连续回交,将抗除草剂基因EPSPS-G6转育花粉败育彻底（无微量花粉,不育度达100%）的棉花单基因隐性控制的核不育系Yu98-8A,进而培育成抗除草剂核不育系Yu98-8A1。对该转育不育系花冠表型测量观察表明,与同质系正常可育株比较,不育株花冠较小, 不育株子房直径略大于可育株,花柱长和花柱外露长度均明显高于同质系正常可育株,花柱头外露为其最显著的表型特征;显微观察显示,不育系Yu98-8A1小孢子败育主要是在四分体形成后的小孢子发育期。小孢子败育特征表现为花粉粒无内含物、无刺突产生,最后解体、退化。PCR分子鉴定表明,抗除草剂基因EPSPS-G6转育入Yu98-8A1,除草剂抗性试验表明,该转育不育系可抗质量百分比浓度达0.3%的草甘膦。该抗除草剂核不育系的培育在棉花杂种优势利用方面有重大利用价值。     

小蓬草水浸液对2种花卉种子萌发及幼苗生长的化感作用北大核心CSCD

为揭示入侵杂草与草本花卉之间的竞争关系,以入侵植物小蓬草为供体材料,常用的花卉波斯菊、观赏油菜为受体材料,研究了小蓬草根、叶水浸提液对受体植物种子萌发、幼苗生长、抗氧化酶活性(SOD、POD和CAT)以及丙二醛(MDA)含量的化感效应差异。结果表明,(1)小蓬草浸提液对受体植物的种子萌发均具有显著化感效应,基本表现为“低促高抑”的趋势,且波斯菊、观赏油菜的种子萌发率在根、叶浸提液浓度为25 g/L时最高,在浸提液浓度为100 g/L时最低。(2)小蓬草浸提液对受体植物幼苗上下胚轴生长具有“低促高抑”的浓度效应,且浓度越大抑制作用越显著。(3)在小蓬草根、叶浸提液处理下,观赏油菜的SOD和POD活性大多显著高于对照,波斯菊SOD和POD活性则大多显著低于对照;波斯菊、观赏油菜CAT活性整体呈先缓慢升高后降低的趋势。(4)波斯菊幼苗MDA含量随小蓬草根、叶浸提液浓度的增加均呈现逐渐升高的趋势,并大多高于对照水平,而观赏油菜幼苗MDA含量随着根浸提液浓度增加而逐渐升高,却随着叶浸提液浓度的增加而降低,但大多显著低于对照水平。研究发现,小蓬草浸提液对2种花卉种子萌发和幼苗生长均表现出“低促高抑”化感作用,且综合效应强弱表现为观赏油菜大于波斯菊,根浸提液处理大于叶浸提液。     

上海地区新入侵草坪害虫早熟禾拟茎草螟的鉴定及危害

在上海发现一种取食观赏草坪矮生百慕大Cynodon dactylon的草螟科新害虫。为了明确这一新害虫的分类地位、 寄主及危害状况, 本研究在形态鉴定的基础上, 结合线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ （COI/cox1）的测序和比对方法, 对其分类地位进行了核实; 并调查了其在上海地区草坪草上的发生及危害现状。形态鉴定结果表明, 这一新害虫为原产于北美的早熟禾拟茎草螟Parapediasia teterrella, 是中国新记录属种。序列比对显示, 目标样本656 bp的cox1序列与NCBI中已提交的P. teterrellus的4个COI条形码序列覆盖率为100%, 同源性达100%, 表明分子遗传数据支持形态鉴定结果。调查发现, 早熟禾拟茎草螟寄主主要为矮生百慕大, 已在上海多个区县形成危害, 局部地区危害严重, 种群密度最高的区域达740头/m²。早熟禾拟茎草螟是中国新发现的入侵害虫, 已明确其在上海地区能定殖、 扩散, 并形成经济危害, 其入侵将威胁我国草坪产业和园林绿化的健康发展, 需引起足够重视。