Rev蛋白: 抗HIV-1感染的新靶点

病毒颗粒蛋白表达调节因子(regulatorofvirionproteinexpression,Rev)是HIV-1转录过程中不可缺少的调控蛋白。Rev与病毒mRNA的Rev应答元件(revresponseelement,RRE)相互作用,加速mRNA向核外转运。Rev缺乏或者不能进入细胞核,未剪接和部分剪接的mRNA将在核内完全降解,导致HIV-1的复制被阻断。Rev在HIV-1复制周期中起着重要的反式调节作用,是寻找新作用机制和不易产生耐药性的抗艾滋病药物的新靶点。该文介绍Rev介导的核质转运过程和Rev蛋白的相关抑制剂。     

HIV-1 B’/C亚型Rev蛋白的表达、纯化与抗体制备

目的:为方便实验室工作中对HIV-1 B’/C亚型Rev蛋白的检测,制备相应的Rev蛋白及其抗体。方法:将我国HIV-1 B’/C亚型流行株的rev基因按大肠杆菌优势密码子进行改造后人工合成,在原核系统中与pET30a(+)载体中的His.Tag、Trx.Tag及S.Tag进行融合表达,目的蛋白经Ni2+金属螯合层析柱纯化后用于免疫家兔,制备多克隆抗体。结果与结论:合成基因在原核系统中融合表达得到相对分子质量约18×103的融合蛋白,目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白量的36%;用纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹及间接免疫荧光检测结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1 B’/C亚型的Rev蛋白能产生特异性反应,可用于检测HIV-1 B’/C亚型Rev蛋白的表达。     

HIV-1B′/C亚型Rev蛋白的表达、纯化与抗体制备

目的:为方便实验室工作中对HIV-1 B′/C亚型Rev蛋白的检测,制备相应的Rev蛋白及其抗体.方法:将我国HIV-1 B′/C亚型流行株的rev基因按大肠杆菌优势密码子进行改造后人工合成,在原核系统中与pET30a(+)载体中的His·Tag、Trx·Tag及S·Tag进行融合表达,目的蛋白经Ni2+金属螯合层析柱纯化后用于免疫家兔,制备多克隆抗体.结果与结论:合成基因在原核系统中融合表达得到相对分子质量约18×103的融合蛋白,目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白量的36%;用纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹及间接免疫荧光检测结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1 B′/C亚型的Rev蛋白能产生特异性反应,可用于检测HIV-1 B′/C亚型Rev蛋白的表达.     

淮阳山病毒NSs基因在THP-1细胞中的稳定表达及其对白细胞介素-6的调节作用

淮阳山病毒(Huaiyangshan virus,HYSV)是一种能引起人类发热伴血小板减少综合征的新型布尼亚病毒。NSs是淮阳山病毒的毒力因子,可能在病毒的致病中起重要的作用。本研究从构建好的含HYSV NSs基因的重组质粒pBluntNSs中扩增出NSs基因,然后克隆到慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen中构建重组质粒pHAGE-NSs;利用脂质体将pHAGE-NSs与包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,在荧光显微镜下可见大量绿色荧光,收上清,即慢病毒悬液;将慢病毒悬液感染THP-1细胞后,通过绿色荧光蛋白进行流式分选、Western blot验证获得稳定表达NSs蛋白的THP-1细胞。利用人白介素-6ELISA检测试剂盒检测NSs蛋白对白介素-6的调节作用,结果表明,NSs蛋白能激活THP-1细胞产生白细胞介素-6。     

表达HIV-1 CRF01＿AE亚型结构基因小鼠模型的建立和鉴定

目的:构建并鉴定表达HIV-1 CRF01_AE亚型结构基因的小鼠模型。方法:使用哺乳动物密码子优化的HIV-1 CRF01_AE gp160基因,通过慢病毒包装系统构建重组慢病毒LV-GFP-AE gp160,将上述重组慢病毒感染小鼠肺上皮细胞TC-1,经嘌呤霉素抗性筛选获得稳定表达gp160基因的TC-1细胞。采用RT-PCR、流式细胞术检测gp160基因在细胞内的表达稳定性,将稳定表达Gp160蛋白的TC-1-HIV AE gp160细胞接种小鼠,用免疫组化方法检测小鼠体内细胞团块中HIV Gp160蛋白的表达。结果:菌落PCR、酶切鉴定和测序表明重组质粒pLVX-AE gp160构建正确,RT-PCR、GFP荧光及流式细胞术结果均显示gp160基因能在细胞TC-1中稳定表达,免疫组化结果也表明小鼠体内接种的细胞可以稳定表达HIV Gp160蛋白。结论:建立了稳定表达HIV-1 CRF01_AE亚型Gp160蛋白的TC-1细胞及小鼠模型,为HIV-1 CRF01_AE亚型HIV疫苗的临床前研究提供了可靠的体外、体内免疫原性评价工具,为该疫苗的进一步开发奠定了坚实的实验基础。     

HIV－1载体中存在着提高转录和翻译基因的元件

目的研究HIV-1载体中的一些元件如Rev和Tat蛋白对其骨架的转录及外源基因表达水平的影响。方法将HIV-1表达GFP载体（FUGW）单独或分别与Rev蛋白表达质粒（pLP2）、Tat蛋白表达质粒（pcDNA3.1-Tat）,及表达Rev和Tat蛋白的质粒（△8．9）等摩尔共转染人293T细胞后,经实时定量RT-PCR、FACS、荧光显微镜镜检等方法检测,比较其表达量。结果Rev与RRE结合后,载体骨架及外源基因的转录是单独转染FUGW时的3倍,Tat与TAR结合后,则提高其骨架及外源基因的转录近4倍,而Rev和Tat蛋白的协同作用,其转录本则可提高至6倍。FACS和荧光显微镜镜检也显示GFP蛋白表达量明显提高。F-TPO载体（HIV-1载体乳腺特异表达促血小板生成素）与△8．9在小鼠乳腺上皮细胞HC-11共转染和表达,则TPO蛋白的表达量接近pcDNA3．1-TPO载体的8倍。结论HIV-1载体中存在着提高转录和翻译基因的元件,可提高其骨架的转录和外源基因的表达,且该现象并不依赖于细胞类型和外源基因的种类。     

HIV-1初始传播病毒Vpr基因遗传变异对诱导G2期阻滞及细胞凋亡的影响

人免疫缺陷病毒(HIV-1)急性感染过程中,病毒的遗传多样性显著减少,往往只有一株或几株病毒可以建立有效感染,这种病毒被称为初始传播病毒(Transmitted/Founder virus)。病毒蛋白R(Vpr)是HIV-1的辅助蛋白之一,在病毒复制过程中起重要作用。研究初始传播病毒Vpr基因遗传变异与生物学特征对于阐明病毒建立感染的关键环节具有重要意义。文章利用流式细胞术分析了C亚型HIV-1初始传播病毒株与慢性感染株MJ4的 Vpr蛋白诱导细胞G₂期阻滞和细胞凋亡的能力。结果显示,初始传播病毒ZM246和ZM247的Vpr诱导细胞G₂期阻滞和细胞凋亡的能力显著高于慢性感染株MJ4 Vpr。氨基酸序列分析表明,初始传播病毒Vpr在第77、85和94位上存在高频突变。研究结果提示初始传播病毒可能在病毒感染早期,通过Vpr基因的遗传突变,提升病毒诱导细胞停滞G₂期和细胞凋亡的能力,进而促进病毒在宿主体内的复制和传播。     

稳定表达呼吸道合胞病毒非结构蛋白NS1细胞的构建及其生物特性研究

获得稳定表达RSV病毒NS1基因的HEp-2-NS1细胞株并对其生物学特性进行初步研究。采用RT-PCR方法从RSV病毒中获得NS1全长基因,克隆到逆转录病毒载体pBABE-puro中,重组载体与包装质粒PIK通过磷酸钙共沉淀法转染包装细胞293FT细胞,产生的逆转录病毒颗粒感染HEp-2细胞,经嘌呤霉素筛选后得到稳定表达细胞株,用QPCR、细胞病变染色法、RT-PCR和间接免疫荧光法检测细胞中NS1 mRNA和蛋白表达情况。结果表明重组逆转录病毒载体pBABE-NS1经双酶切及测序鉴定正确;筛选获得5株阳性单克隆细胞株,QPCR结果显示HEp-2-NS1细胞有NS1基因扩增,其中d株的相对表达量是正常细胞对照组的8 483倍;在外源干扰素作用下,HEp-2-NS1细胞仍对VSV病毒保持敏感,细胞感染病毒48h后染色结果显示全部死亡;对第3代及第30代细胞的RT-PCR和间接免疫荧光法检测结果显示,导入的NS1基因在HEp-2细胞中不仅能转录成相应的mRNA而且能成功稳定地表达。成功构建了稳定表达RSV病毒非结构蛋白NS1的HEp-2-NS1改造细胞株,为建立适用于临床分离的转基因细胞提供良好的基础。     

NPM1突变基因通过MMPs参与调控白血病细胞体外侵袭

核仁磷蛋白基因(nucleophosmin,NPM1)突变是目前急性髓系白血病(AML)中突变率最高的基因改变,在白血病的发生发展过程中发挥重要的调控作用。为探讨NPM1突变参与调控白血病髓外浸润的分子机制,将表达质粒pEGFPC1-NPM1-mA转染THP-1细胞系,筛选稳定表达NPM1突变蛋白的白血病细胞株(THP-1-mA)。利用RT-PCR及Western blot分析了THP-1-mA细胞与亲代细胞间MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2表达水平的差异。结果显示,具有体外高侵袭能力的THP-1-mA组细胞MMP-2的mRNA水平和蛋白水平均明显高于两对照组,而MMP-9 mRNA表达水平虽有所增高,但蛋白表达水平却明显降低。同时,与空载体转染组和未处理组细胞相比,THP-1-mA组细胞TIMP-2的mRNA水平和蛋白水平表达显著降低,差异具有统计学意义;TIMP-1表达水平无明显改变。提示MMP-2及其抑制剂TIMP-2在NPM1突变参与调控的白血病细胞髓外浸润中可能发挥重要作用。     

人单核细胞系中HIV-1前病毒转录调节新型研究模型的建立

【目的】抗反转录病毒疗法(ART)能够有效控制人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus-1,HIV-1)的复制,但是不能将其完全清除。至2012年底,全球仍有3 500万HIV-1感染者,同年约160万人死于艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome,AIDS)及其相关疾病。HIV-1感染难以根治的主要原因之一是机体内HIV-1潜伏储存库(Reservoir)的存在。HIV-1潜伏储存库主要由CD4+T细胞和单核巨噬细胞构成,与CD4+T细胞相比,目前研究者对单核巨噬系细胞中HIV-1病毒复制机制尚不明了,且缺乏适宜的研究体系。因此,为探讨单核细胞活化或分化信号对HIV-1复制的影响,我们建立了旨在研究HIV-1前病毒转录调控机制的人单核巨噬细胞系模型。【方法】构建env区域移码突变和nef区域携带EGFP或Nano Luc报告基因的HIV-1 NLn GFP-Kp或NLn Nano Luc-Kp重组病毒,分别感染2种人单核细胞系THP-1或U937细胞。通过有限稀释法制备单克隆细胞系,利用流式细胞术或Nano Luc荧光素酶活性分析检测报告基因的表达。筛选EGFP或Nano Luc阴性表达的细胞克隆,经激活剂佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)刺激后鉴定潜伏感染的细胞克隆。【结果】研究中鉴定了4个HIV-1潜伏感染的细胞克隆。其中2个是表达EGFP的THP-1克隆,2个是以Nano Luc为报告基因的U937克隆。这些克隆在PMA刺激处理后皆有报告基因的表达,而在恒态条件下未检测到报告基因的表达。【结论】成功建立了4个HIV-1潜伏感染的人单核细胞系克隆,该模型有助于理解单核巨噬系细胞的HIV-1病毒复制机制,可能成为进一步研究HIV-1前病毒转录调控机制的有力工具。     

核移植与线粒体

线粒体是哺乳动物的产能、供能细胞器,与生长、发育、衰老和凋亡等多种细胞事件及疾病有关。哺乳动物核移植可能导致克隆胚胎及后代中线粒体的杂合性,从而影响到个体的表型甚至导致线粒体疾病。文章阐明了哺乳动物中线粒体的生物学功能及遗传特性,并分析了核移植中供体细胞和受体卵胞质两种来源的线粒体在同种胚胎细胞核移植、同种及异种体细胞核移植重构胚发育进程中的变化以及可能影响线粒体杂合性的一些因素,对其可能导致的线粒体疾病及解决方法进行了简单的阐述。

     

氟代柠檬酸对体外培养的神经胶质瘤细胞G422增殖的抑制效应

为研究氟代柠檬酸(Fluorocitrate)对体外培养的神经胶质瘤细胞生长的影响,采用MTT法研究不同的氟代柠檬酸浓度(0.0025mmol/L,0.005mmol/L,0.01 mmol/L,0.025mmol/L和0.1 mmol/L)和作用时间(36h,48h和60h)对神经胶质瘤细胞G422增殖的影响.结果发现:(1)氟代柠檬酸可抑制G422细胞的增殖,并且其抑制作用随氟代柠檬睃浓度的增加而增强;(2)高浓度(0.01 mmol/L,0.025 mmol/L和0.1 mmol/L)氟代柠檬酸对G422细胞的增殖抑制作用随作用时问的延长而增强:(3)低浓度(0.0025mmol/L和0.005mmol/L)氟代柠檬酸对G422细胞的增殖抑制作用不随作用时间的延长而改变.实验表明,氟代柠檬酸能够抑制神经胶质瘤细胞的增殖,其抑制能力随氟代柠檬酸浓度的增加和作用时间的延长而加强.     

毒蕈碱Ⅱ型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁三个品级脑中的表达（英文）

昆虫脑内胆碱能系统在中枢神经系统中起着重要作用,其与昆虫的复杂行为密切相关.本文选取有复杂行为的膜翅目社会性昆虫拟黑多刺蚁为研究材料,用免疫组织化学方法,对毒蕈碱Ⅱ型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁工蚁、雌蚁和雄蚁脑中进行定位检测.结果表明,毒蕈碱Ⅱ型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁前脑蕈形体、中央体和中腩嗅叶中普遍存在,但不同品级表达区域和强弱存在差异.这意味着毒蕈碱Ⅱ型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁视觉信息、嗅觉信息的整合输出中起着重要作用.     

昆明小鼠物体识别模型的建立及其在检测化学药物对记忆损伤中的应用

本研究的主要目的是建立昆明小鼠物体识别模型并评价该模型在安全药理学研究中的潜在应用价值。研究了昆明小鼠物体识别记忆随时间而减弱的特性,在训练结束后4h或1h,检测昆明小鼠的物体识别记忆,并评价了东莨胆碱对昆明小鼠物体识别记忆的影响。结果表明:1h间隔组昆明小鼠熟悉期探究物体的时间差和测试期探究物体的时间差存在显著差异(P<0.05),昆明小鼠在训练结束后1h记忆保持良好,可以进行物体识别;东莨胆碱组昆明小鼠熟悉期探究物体的时间差和测试期探究物体的时间差比较(P>0.05),没有显著性差异。因此,东莨胆碱损伤了昆明小鼠的物体识别记忆。用昆明小鼠建立的物体识别模型具有简单、快速、可靠等特点,在安全药理学研究中可用于检测化学药物对记忆的损伤。     

猕猴模型在HIV疫苗研究中的应用

对HIV疫苗的研究一直是国际上艾滋病方面研究的热点和难点。动物模型则为疫苗研究必不可缺少的重要工具,缺乏合适的动物模型很大程度上制约了AIDS疫苗的研究。目前在国际上SIV或SHIV感染的猕猴模型为最常用的AIDS研究模型,受猕猴背景及病毒特性等多种因素的影响,使得以上两种模型在HIV疫苗研究中仍存在一定的局限性。为了更好地发挥猕猴模型在HIV疫苗研究中的巨大潜力,开发理想的AIDS猕猴模型已成为目前HIV疫苗研究的首要任务。本文简要介绍了AIDS疫苗的研发策略、研发概况以及SIV/SHIV猕猴模型在HIV疫苗中的应用,并对其中存在的问题及其应用前景进行了探讨。     

一种通用高效的复杂载体构建的新方法

文章报道了一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法。此法是在PCR引物设计时,在目的片段5′端加上随机设计的接头,利用PCR克隆目的片段,再用T4 DNA聚合酶3′→5′外切酶活性处理PCR克隆目的片段,产生多个首尾相匹配的粘性末端,进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。以7片段拼接的水稻单交换质体定点整合表达载体pRSMGA的构建为例,应用上述方法构建只需做两次连接、转化,且其重组、转化效率高。数10次实验证明：这是一种简便、通用、高效的复杂构建载体的方法,该法至今尚未见报道。      

云南乌骨绵羊乌质性状与TYR基因多态性的相关分析

乌骨乌肉是乌骨绵羊的主要乌质性状。本文测定了乌骨绵羊、兰坪本地羊和罗姆尼羊血液TYR活性并分析了乌骨绵羊与乌骨鸡组织器官黑色素结构,结果表明：乌骨绵羊TYR活性显著高于兰坪本地绵羊和罗姆尼羊（P<0.05）;乌骨绵羊黑色素与乌骨鸡黑色素的IR光谱基本一致,黑色物质主要是真黑色素。首次克隆了绵羊TYR基因第一外显子长667 bp序列,并检测了乌骨绵羊和非乌骨绵羊TYR基因多态性。结果发现,检测的乌骨绵羊TYR基因第一外显子有两个变异位点,分别位于第64和154号编码氨基酸上,但都属于同义突变。通过对64号位置设计酶切位点检测TYR基因多态性,结果发现,该突变与乌质性状有关基因紧密连锁,TYR基因上可能存在乌质性状相关功能突变位点。另外,TYR基因多态性与毛色的表型相关极显著（P<0.01）,该基因可能也是毛色功能基因。     

CaPKR-like在鲫鱼与草鱼组织中的表达特性分析

摘要：PKR是由干扰素诱导的最重要的抗病毒蛋白之一,能抑制细胞和病毒蛋白的合成。鲫鱼PKR基因(CaPKR-like)是鱼类第一个,也是非哺乳类脊椎动物第一个报道的PKR全长cDNA序列。本研究制备了CaPKR-like N-端包含Za结构域的多克隆抗体,采用Western blots检验PKR-like在鲫鱼和草鱼组织中的表达特性。Western blots显示在未诱导的鲫鱼和草鱼中该基因表达水平非常低,但是经Poly I:C免疫一周后,在鲫鱼和草鱼等8种组织中有较强的PKR-like蛋白产生。结果暗示：CaPKR-like与哺乳类PKR有相同的组织表达特性。。     

染色体领域的研究及其进展

间期核中的染色体并不是散乱分布的,而是每条染色体占据了一块特定的核区域,即染色体领域（chromosome territory, CTs）,染色体领域在间期核中的排列与定位是经过严格组织的,并具有一定的动力学特征,染色体领域的这些严格的定位和空间组织与基因的表达调控密切相关。文章综述了这几个方面的研究进展。      

基于线粒体ND1和CO1基因序列探讨锯眼蝶-亚科主要类群的系统发生关系

研究测定了锯眼蝶亚科4族、10属共20个国产代表种的线粒体ND1和COI基因的部分序列,结合从GenBank中获得的4个国外产种类的同源序列,以凤蝶科的迪洛尔娟凤蝶、丝带凤蝶,以及娟蝶科的西猛娟蝶为外类群,通过邻接法、最大简约法、最大似然法和贝叶斯法重建了分子系统树,分析了该亚科及其主要类群的系统发生关系。分析结果表明：帻眼蝶族和锯眼蝶族具有较近的亲缘关系;黛眼蝶族不是单系群,该族中的黛眼蝶属、荫眼蝶属与眉眼蝶族具有较近的亲缘关系,带眼蝶属、藏眼蝶属、毛眼蝶属和帕眼蝶属聚合为一个独立的支系,其中带眼蝶属和藏眼蝶属在所有的分析方法中均以100%的置信度（BP=100%, PP=1.00）相聚合,笔者倾向于将它们合并为一属。