菠菜铁氧还蛋白的简易分离方法

用DEAE纤维素（DE－52）从菠菜叶片的抽提液中吸附蛋白,再以NaCl分级洗脱得到含铁氧还蛋白（Fd)的分部,此Fd制剂具有特征性的Fd氧化还原吸收光谱和催化体叶绿体光还原NADP的活性。     

阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因的原核表达

目的在原核细胞中表达阴道毛滴虫铁氧还蛋白(ferredoxin,Fd)基因。方法构建阴道毛滴虫Fd基因的原核表达重组质粒pUC19-Fd,转化大肠埃希菌JM109感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达。结果经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)分析,重组质粒在大肠埃希菌中表达出Fd。结论在大肠埃希菌中表达出了Fd。     

Fd的制备及其参与的HPLC—荧光法检测PaO活力研究

PaO体外活力测定需要Fd作还原剂。通过丙酮沉淀法、DEAE柱层析等制备菠菜Fd,并将其应用于HPLC—荧光法研究PaO催化的Pheide α降解反应。结果表明：经DEAE柱层析纯化得到的是氧化型Fd,而未经DEAE柱层析得到的是还原型Fd,还原型Fd可以参与Pheide α降解反应,色谱峰面积可以表示PaO的活力;FCC的HPLC洗脱时间是5．1min,遮光条件下FCC的半衰期是34．66min,PaO在20℃催化Pheide α降解的活力较高。小麦幼苗离体暗诱导衰老过程中PaO活力变化幅度较大,暗处理5d其活力增加24．47倍,“PaO”Chl降解途径在麦类作物叶片衰老过程中普遍存在。     

铁氧还素对二溴百里香醌抑制光合电子传递的解抑现象

铁氧还素(Fd)能解除二溴百里香醌(DBMIB)对光合电子传递的抑制作用。DBMIB的抑制效果与反应系统中的Fd和DBMIB的浓度,以及两者混合后的保温时间有关。Fd—DBMIB动态差示吸收光谱显示Fd与DBMIB之间有直接的化学作用。因此,在用DBMIB来研究有Fd参与的光合电子传递实验时,都须注意两者间的直接作用。     

严格厌氧菌铁氧还蛋白的研究进展

铁氧还蛋白(ferredoxin,Fd)是一类含有铁硫簇的小分子蛋白质,广泛存在于自然界中,参与生物体内的呼吸、发酵、固氮、二氧化碳固定和制氢等生理过程.Fd对于严格厌氧的细菌尤为重要,是因为这类细菌的能量代谢高度依赖于低氧化还原电势的生物组分,而Fd能够利用铁硫中心灵活调节其氧还电势,适应低电势需求.本文选取厌氧细菌...     

从菠菜叶绿体分离纯化Fd-NADP还原酶

叶绿体光合电子传递链光系统I(PSI)还原端的成员,包括非血红铁硫蛋白Ferredoxin(Fd)和Fd—NADP~+还原酶。此酶是一种水溶性的黄素蛋白,它调节光还原的Fd到NADP~+之间的电子传递,暗中催化Fd和 NADP~+的可逆氧化还原,故又称作Fd—NADP~+氧化还原酶,它又有转氢作用,通过此酶可还原 NAD,FMN,FAD,吲哚染料等。还原酶和 Fd,NADP~+有强亲和力,Fd和 NADP~+以1:1的比例与还原酶形成复合物。还原酶的分子量为40000,含1FAD/分子蛋白,是一电子或二电子受体。     

菠菜铁氧还素(Ferredoxin)的制备

Davenport和Hill于1952年首先发现铁氧述素(简称Fd),当时他们称它为正铁血红蛋白还原因子(Methemoglobinreduction factor)。菠菜Fd含有97个氨基酸残基,分子量为13000(有的报导为12000)。每分子Fd含有两个铁原子和两个硫原子;铁与胱氨酸     

抗胃癌单抗3H11可变区氨基端序列对抗体活性的影响

采用RT-PCR方法,利用第一骨架区通用引物扩增重链Fd段和κ链的基因,克隆到Fab表达载体中,在大肠杆菌中获得了表达但未检测到抗原结合活性.根据已克隆的3H11 VL、VH的真实序列,重新设计κ链及Fd段5′端引物,分别将骨架区引物在κ链及Fd段5′端所造成的氨基酸残基改变纠正为原始序列,构建分别含有矫正后κ链或矫正后Fd以及二个链均得到矫正的Fab表达载体,这些载体在大肠杆菌中均获得类似水平的表达,对任何一个链的矫正均可部分恢复Fab段胃癌细胞的结合活性.结果说明在构建小分子抗体时,PCR引物引入的轻、重链可变区氨基端氨基酸残基的改变可严重影响所表达抗体的抗原结合活性.     

阴道毛滴虫多克隆抗体的制备及Fd基因的原核表达

目的 将阴道毛滴虫铁氧还蛋白（ferredoxin,Fd）基因在大肠埃希菌中诱导表达。方法制备阴道毛滴虫可溶性抗原,多点注射免疫家兔,获得的血清用ELISA测定其抗体效价。将原核表达重组质粒pET3C-Fd转化入大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达。结果制备出抗阴道毛滴虫多克隆抗体,抗体效价在1：8000以上,用于免疫印迹实验。经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）分析,重组质粒在大肠埃希菌中表达出Fd。结论在大肠埃希菌中表达出了Fd。     

半合成抗体库的构建及抗Tie2 Fab抗体的筛选*

构建一个半合成抗体库 ,不经免疫制备人源抗Tie2Fab抗体。通过RT PCR方法 ,从人脐带血淋巴细胞总RNA扩增轻链基因及重链VH段基因 ,将轻链基因插入pCOMb3载体中 ,得人轻链质粒库 ;从HBsAb的Fd段基因制备含有不同长度随机化CDR3的FR3 CDR3 J CH1片段 ,然后将VH段基因与随机化的CDR3融合 ,得到Fd基因片段 ,再将其插入轻链质粒库中 ,得半合成人Fab质粒库。通过多次建库 ,获得总容量为 2×10⁷的半合成抗体库。其Fd段和轻链基因的重组率为     

抗破伤风类毒素单抗可变区基因的克隆及在大肠杆菌中表达的三种工程抗体

我们采用RT-PCR,从小鼠杂交瘤细胞中扩增并克隆了抗破伤风类毒素(TT)抗体轻、重链可变区,重链Fd区基因,测定了其VH、Vk序列。并在大肠杆菌中表达了Fd片段,ELISA分析的结果表明Fd片段具有抗原结合的能力,但特异性很差。进一步采用SOE,和PCR技术,将VH、VK基因与ScFv连接片段组装成单链抗体(ScFv)基因片段,以及将人重链CH1和Fab基因连接片段组装成Fab基因片段。将它们分别插入含噬菌体fd外壳蛋白3基因的phagem-id pHEN 1中,在辅助噬菌体M 13-VCS作用下,噬菌体表面表达了抗TT的噬菌体单链抗体(phage-ScFv)与噬菌体Fab(phage-Fab),经ELISA检测,表明它们都能与TT特异结合。     

半合成抗体库的构建及抗Tie2 Fab抗体的筛选

构建一个半合成抗体库 ,不经免疫制备人源抗Tie2Fab抗体。通过RT PCR方法 ,从人脐带血淋巴细胞总RNA扩增轻链基因及重链VH段基因 ,将轻链基因插入pCOMb3载体中 ,得人轻链质粒库 ;从HBsAb的Fd段基因制备含有不同长度随机化CDR3的FR3 CDR3 J CH1片段 ,然后将VH段基因与随机化的CDR3融合 ,得到Fd基因片段 ,再将其插入轻链质粒库中 ,得半合成人Fab质粒库。通过多次建库 ,获得总容量为 2× 1 0 7的半合成抗体库。其Fd段和轻链基因的重组率为 5 0 %。经 3轮淘洗 ,从噬菌体抗体库中筛选到与Tie2抗原特异结合的噬菌体克隆。测序确定抗体基因序列     

蓝细菌Anacystis nidulans R-2 藻胆体中43 kD蛋白细胞定位的初步研究

高盐浓度条件下分离了蓝细菌Anacystis nidulans R-2的藻胆体, 藻胆体中存在一种43 kD的蛋白。Western blotting 分析表明, 该蛋白能与蓝细菌Fd:NADP+氧还酶中FNR结构域的抗体发生反应, 解聚的藻胆体具有FNR黄递酶的活性, 初步证明该43 kD蛋白就是Fd:NADP+氧还酶。TritonX-114分相实验表明, 这种43 kD的蛋白不能进入TritonX-114相。对藻胆体的部分解聚合实验表明, 富含外周杆的组分中不存在43 kD的蛋白。     

蓝细菌Anacystis nidulans R-2藻胆体中43 Kd蛋白细胞定位的初步研究

高盐浓度条件下分离了蓝细菌Anacystis nidulans R-2的藻胆体,藻胆体中存在一种43kD的蛋白。Western blotting分析表明,该蛋白能与蓝细菌Fd：NADP氧还酶中FNRE占构域的抗体发生反应,解聚的藻胆体具有FNR黄递酶的活性,初步证明该43kD蛋白就是Fd：NADP氧还酶。Triton X-114分相实验表明,这种43kD的蛋白不能进入Triton X-114相。对藻胆体的部分解聚合实验表明,富含外周杆的组分中不存在43kD的蛋白。     

一种新型肿瘤血管抗体Fab的基因克隆与表达

鼠单克隆抗体AA98是我室研制的一株新型抗肿瘤血管抗体,体内实验证明它可以抑制血管生成,抑制肿瘤生长。从分泌抗体AA98的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用逆转录PCR(RT-PCR)分别扩增重链Fd及轻链κ,并进行序列测定。将Fd和κ链依次与噬菌粒pComb3H连接,构建pComb3H-AA98Fab表达载体。在大肠杆菌中表达了AA98Fab。免疫印迹表明该Fab片段识别分子量为100kD的蛋白,具有原抗体AA98的抗原特异性。AA98Fab是研究抗体AA98作用机理的工具,也为制备重组免疫毒素,尝试肿瘤血管靶向治疗实验打下了基础。     

Kinetics of thymocyte developmental process in fetal and neonatal mice

Kinetics of thymocyte development in vivo during embryogenesis was pursued. The early development of thymocytes in the fetal and neonatal BALB/c mice was discontinuous, with four waves of cell proliferation occurring at fetal day (Fd) 14 to 17, Fd 18 to day (D) 1 after birth, D 2 to D 5 and D6 thereafter. The first three proliferation waves coincided with the generation of CD4^hiCD8^hi (DP), TCR CD4^hiCD8^-/^loCD8^int/hi(CD4 SP), and TCR CD4^-/^loCD8^int/hi (CD8 SP) thymocytes, respectively. The transition from DN to DP cells was further investigated and it was found out that there were two differential pathways via im-mature single positive (ISP) cells in the BALB/c mice, each functioning at different fetal ages. One is via TCR^-CD4^-CD8^ cells, occurring between Fd 15 and Fd 17 and the other is via TCR^-CD4^ CD86-cells,occurring from Fd 17 until birth. In contrast, the TCR^-CD4^-CD8^ pathway dominated overwhelminglyin the C57BL/6 mice. These findings shed new light on the hypothesis that the differential pathway pref-erence varies with mouse strains. With respect to the shift in the intensity of CD4 and CD8 expression onthymocytes from fetal to adult mice, the TCR CD4^hiCD8^-/^lo, and TCR^ CD4^-/^loCD8^int/hi subsets might be equivalent to the medullary type TCR^ CD4/CD8 SP cells.     

ATP,Fe-S原子簇在固氮酶催化反应中的作用——模型研究

由无机钼盐与某些巯基化合物或巯基蛋白组成的固氮酶模型系统,以NaBH_4作还原剂,催化还原固氮酶的底物乙炔为乙烯。催化活性受ATP显著的促进。ATP的作用不能完全用质子酸来解释,因为催化活性的促进受ATP浓度、不同种类缓冲液和不同离子强度的影响。 在所有Mo-SH催化剂中,Mo-Fd催化活性最高。并且,在PH≌9.0左右的条件下,与固氮酶相仿,也能利用Na_2S_2O_4为还原剂,催化还原乙炔。当除去天然Fd的Fe-S辅基以后,剩下的蛋白部分再与无机钼盐配位络合,催化活性下降,而且不再能利用Na_2S_2O_4为还原剂。因此,Fd的特殊作用与它分子中含Fe-S原子簇相关。     

人源性抗腮腺炎病毒噬菌体抗体库的构建

应用噬菌体表面呈现技术,从腮腺炎病毒抗体阳性者淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增出抗体重链Fd和轻链基因,经XhoI/SpeI、SacI/XbaI双酶切,先后克隆入噬粒载体pComb3中,再电转化大肠杆菌XL1-blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染。从分离出的淋巴细胞中共提取高质量RNA约110μg,经逆转录、PCR,分别扩增出约700 bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接,在2.5 kV、200 Ω、25μF的条件下电转化,转化率为2.48×107。最终得到库容量为6.4×106,滴度为7.8×1013 cfu/L的噬菌体抗体库。所构建的抗腮腺炎病毒特异性噬菌体抗体库容量中等大小,能满足从中筛选抗HN蛋白噬菌体抗体的需要。     

Granier原始公式计算树干液流速率的适用性分析——以毛白杨为例

热扩散探针(TDP)在林木蒸腾研究中应用极广,其测定数据的计算精度直接影响对林木和林分耗水的精准定量。Granier原始公式(Fd=0.0119K1.231, Fd为液流速率(cm·s–1), K为温差系数)是计算TDP测定数据的标准方法,但其准确性备受质疑。为系统了解Granier原始公式的适用性和明确对其校正的必要性,该研究以毛白杨(Populus tomentosa)为实验材料,采用室内茎段法和整树容器法,针对不同型号的TDP探针评估Granier原始公式的精度,并对比不同方法校正公式的应用效果。与茎段法实测值相比,Granier原始公式计算的液流速率平均低估52.3%–61.4%。通过茎段法和整树容器法得到的校正公式分别为Fd=0.0362K^1.870和F_d=0.0105K^0.976;且一种方法下得到的校正公式,在其他方法条件下应用时存在较大偏差。与Granier原始公式相比,整树容器法校正公式计算的大田生长状态下的7株林木的平均液流速率没有显著变化,但茎段法和其他研究中得到的毛白杨校正公式的计算结果均显著变大。...