A和C结构域糖基化位点对凝血八因子的分泌及活性的影响

在血液来源和血液制品安全隐患制约下,基因工程重组凝血八因子已开始替代天然八因子用以治疗血友病等病症,但目前高效表达重组八因子的方法在我国仍有技术瓶颈.该项目利用定点突变技术,通过PCR、质粒抽提、转染以及产物检测这四个步骤来研究重组凝血八因子在A和C结构域添加糖基化位点对八因子表达及活性的影响.结果表明,在重组八因子A结构域Bip结合位点外端增加糖基化位点能够促进八因子的细胞外分泌量,而在Bip结合位点内的突变则不但大大减少了八因子的胞外分泌也使八因子活性几乎全部丧失.与A结构域不同,在八因子C结构域增加糖基化位点的结果表明,无论在蛋白C结合区之内或之外增加糖基化位点不但不能大幅提高八因子的胞外分泌,也使八因子活性基本丧失.这些结果说明只有在A结构域外缘的非Bip结合区进行糖基化改造,才有可能提高八因子分泌并保持其活性.     

重组人凝血因子Ⅷ表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的:构建含有B区缺失型(△760aa-1639aa)人凝血因子Ⅷ(B domain-deleted human FⅧ,BDDhFⅧ)的真核表达质粒,转染HepG2细胞使其稳定表达人凝血因子Ⅷ。方法:将BDDhFVIII基因片段插入pcDNA4/v5-his空载体中构建重组真核表达质粒,测序正确后电转入HepG2细胞,经Ni-NTA纯化,利用Western blot检测凝血因子Ⅷ在HepG2细胞中的表达,持续培养获得稳定表达BDDhFⅧ蛋白的细胞株。结果:经限制性酶切和测序鉴定均证实重组真核表达质粒pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ成功构建,在转染HepG2细胞后,Western blot检测证实人凝血因子Ⅷ可以在HepG2细胞中正确表达。结论:成功构建了人凝血因子Ⅷ的稳定细胞株,并能在HepG2细胞表达目的蛋白。     

NOD1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建天然免疫胞内识别受体核苷酸寡聚域1(NOD1)真核表达质粒。方法:NOD1基因片段经PCR扩增获得,经酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,对挑选出的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒pflag-NOD1转染293T细胞,用Western印迹检测目的蛋白的表达,同时用NF-κB的萤光素酶报告基因检测NOD1蛋白的活性。结果:pflag-NOD1可以在真核细胞293T中表达,并可以增强NF-κB报告基因的转录活性。结论:构建了重组质粒pflag-NOD1,在细胞中表达NOD1后能够提高NF-κB转录的生物活性,为进一步研究NOD1的功能奠定了基础。     

GP73及其糖基化修饰对肝癌细胞HepG2炎症相关分子信号通路的影响

目的:通过构建高尔基体膜蛋白73(GP73)氨基酸序列109、144位糖基化位点双突变真核表达质粒,研究GP73及其糖基化修饰对肝癌细胞炎症相关分子信号通路的影响。方法:根据GP73的DNA序列,设计合成2对针对GP73氨基酸序列109、144位糖基化位点突变的PCR引物,以本实验室构建的野生型质粒pc DNA3-Flag-GP73为模板,构建GP73的109、144位糖基化位点双突变质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM);用脂质体将此双突变质粒转染293T细胞,用糖蛋白染色和免疫印迹检测该质粒在细胞中的表达情况,用双萤光素酶报告基因实验检测GP73及其糖基化修饰对Hep G2细胞中NF-κB转录激活的影响。结果:糖蛋白染色和免疫印迹结果证实构建的双突变质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM)能够表达GP73双糖基化位点突变的蛋白,且糖基化位点的突变使GP73的糖基化修饰完全缺失;双萤光素酶报告基因实验结果表明,野生型GP73能够激活Hep G2细胞中NF-κB的转录活性,而双糖基化位点突变会使GP73失去此激活作用。结论:构建了GP73双糖基化位点突变的真核表达质粒pc DNA3-Flag-GP73(DM)。GP73参与激活肝癌细胞炎症信号通路,糖基化修饰对于GP73发挥此作用是必不可少的。     

信号肽及化学通透剂对环糊精葡萄糖基转移酶胞外分泌的影响

【目的】研究不同的信号肽和化学通透剂对重组环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)胞外分泌的影响,提高CGTase的胞外分泌量。【方法】扩增地芽孢杆菌CHB1(Geobacillus sp.CHB1)的CGTase基因,构建带有地芽孢杆菌CHB1自身信号肽、Omp A、Pel B信号肽和不带信号肽的4种重组质粒;比较4种重组质粒对重组CGTase胞外分泌的影响,筛选最优的信号肽;考察甘氨酸、Triton X-100、SDS和Tween 80四种化学通透剂对重组CGTase胞外分泌的影响,确定最佳的化学通透剂及其浓度。【结果】Omp A信号肽介导的分泌效果最好,胞外酶活达到7.44 U/m L,分别是Pel B、CHB1信号肽的2.04倍和11.27倍,不带信号肽的重组质粒菌胞外检测不到酶活;携带Omp A信号肽的重组质粒菌发酵48 h,同时添加浓度为0.6%的甘氨酸和0.3%的Triton X-100,胞外酶活达最大到14.27 U/m L;SDS和Tween 80对该酶的胞外分泌具有明显的抑制作用。【结论】Omp A信号肽的介导效果最佳,同时添加浓度为0.6%和0.3%的甘氨酸和Triton X-100可以有效促进胞外分泌,为该重组酶的高效胞外分泌提供了一种有效的方法。     

FNDC5真核表达载体的构建及其N-连接糖基化修饰位点的预测

为构建小鼠FNDC5的真核表达载体p EYFP-N1-FNDC5,预测FNDC5的N-连接糖基化修饰位点。在质粒p EYFP-N1的多克隆位点插入小鼠FNDC5构建真核表达载体p EYFP-N1-FNDC5,用脂质体转染He La细胞。转染48 h后,用免疫印迹法检测融合蛋白的表达,使用激光共聚焦显微镜观察FNDC5融合蛋白的亚细胞定位。利用Net NGlyc 1.0 Server程序,预测FNDC5蛋白N-连接糖基化修饰位点。结果显示:与对照组相比,真核表达载体p EYFP-N1-FNDC5能够表达FNDC5融合蛋白,且FNDC5融合蛋白定位于细胞膜。FNDC5的Ⅲ型纤连蛋白结构域区存在两个N-连接糖基化修饰位点。上述结果表明FNDC5真核表达载体构建及表达成功,FNDC5存在N-连接糖基化修饰位点。     

人表皮生长因子受体结构域蛋白的原核表达、纯化及活性检测

目的:构建人表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ED)和胞内激酶结构域(PKD)的原核表达载体,获得纯化的GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增EGFR的ED和PKD基因编码序列,将其正确插入p GEX-KG载体,重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose4B珠子纯化融合蛋白。结果:构建得到GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出与预期位置相符的目的蛋白,经Western印迹检测,融合蛋白成功表达;纯化得到融合蛋白GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD。结论:克隆了GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD基因,并获得了活性良好的GST-EGFR-ED和GST-EGF-PKD融合蛋白,为研究EGFR在肿瘤中的作用奠定了实验基础。     

人高密度脂蛋白受体胞外片段在甲醇酵母中的表达

高密度脂蛋白受体在胆固醇逆向运输中起重要作用,并且其可以做为动脉粥样硬化的新型治疗靶点。为了构建以竞争性受体-配体相互作用为基础的体外高通量药物筛选模型,在甲醇酵母中表达了高密度脂蛋白受体胞外结构域。应用RT-PCR方法从人肝癌Bel-7402总RNA中扩增了编码高密度脂蛋白受体胞外结构域的基因片段,此基因片段测序证实后亚克隆至甲醇酵母分泌表达质粒pPIC9K中。经测序验证读码框正确后将重组质粒电转至Pichia pastorisGS115中。应用PCR方法确定目的基因的整合和Mut^ 表型。重组菌株用1％甲醇诱导5天后取发酵上清进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果表明,在分子量约64.5kDa处有sHDLR表达。随后应用Dil-AcLDL为配体证明了表达的sHDLR具有结合其配体AcLDL的生物学活性。     

高表达Snail蛋白诱导黑色素瘤EMT细胞模型的构建及鉴定

目的:构建稳定表达Snail蛋白的可用于肿瘤上皮-间质化研究的肿瘤细胞模型.方法:采用亚克隆方法从质粒pCMV6-mSnail中PCR扩增小鼠Snail基因,连接至表达质粒pL-tdTomato-Neo,筛选重组质粒并经双酶切及测序鉴定.构建成功的重组质粒pL-tdTomato-mSnail转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选稳定细胞株.采用荧光定量PCR和Western blot技术检测胞内Snail及上皮/间质标志物的变化.建立裸小鼠皮下移植瘤模型,活体成像系统观测移植瘤.结果:重组质粒pL-tdTomato-mSnail成功构建,其稳定转染株B16/dT-mSN胞体发出强烈红色荧光.胞内Snaill水平显著上调,E-钙粘蛋白下调,波形蛋白表达上调,呈现典型的上皮-间质化表型.结论:成功获得稳定高表达小鼠Snail蛋白的EMT细胞模型,且可用于体内外荧光成像观测,为研究Snail蛋白在介导肿瘤EMT过程中的生物作用提供了重要的实验工具.     

铜绿假单胞菌LasR基因反义核酸原核表达载体的构建及对该菌毒力的影响

PCR扩增LasR基因,用反向克隆法构建LasR基因反义核酸原核表达载体pUCP18/lasRantisense并转化铜绿假单胞菌,经酶切、PCR及测序鉴定重组载体.RT-PCR检测LasB基因和LasI基因mRNA的表达,NAD法测定外毒素A的活性,紫外分光光度计测定绿脓菌素的产生水平.用转化pUCP18/lasRantisense质粒菌株感染大鼠呼吸道并进行病理组织切片检查.PCR扩增出约720bp片段,与GenBank(No:NC_002516)报道的基因片段大小一致,构建了LasR基因反义核酸原核表达载体pUCP18/lasRantisense,并成功转化铜绿假单胞菌,且有效表达,使转化菌的毒力因子弹性蛋白酶、外毒素A和绿脓菌素表达水平均降低.与标准株感染的大鼠比较,转化pUCP18/lasRantisense质粒菌株感染的大鼠支气管炎症明显减轻.上述结果表明,LasR基因反义核酸原核表达载体pUCP18/lasRantisense可以降低铜绿假单胞菌的毒力.     

突变人CD59分子真核表达体系的构建和功能的初步研究

构建突变人CD59分子(HMCD59)真核表达体系,探讨HMCD59糖基化前后抗补体活性的变化。采用重组PCR定点诱变技术在CD59易于糖基化的位点构建CD59突变基因,克隆入真核表达质粒pALTER-MAX。利用阳离子脂质体将重组质粒和pcDNA3共转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。G418压力筛选稳定转染细胞克隆,检测筛选HMCD59蛋白高表达株。免疫印迹技术(Western blot)检测出HMCD59蛋白分子量约为20kDa。2,7-二羧乙基-5,6羧基荧光素(BCECF)释放实验初步证实HMCD59具有抗补体活性,糖基化后抗补体活性明显降低,为进一步研究糖尿病血管增殖症的发生机制提供了线索。     

在枯草杆菌芽胞表面展示P74蛋白膜外肽段

目的:对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)囊膜蛋白P74膜外肽段与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)CotC与进行融合表达,制备表面展示有P74蛋白的重组芽孢,为深入研究该重组芽孢的功能提供基础.方法:将CotC基因与BmNPV P74膜外编码序列进行融合,构建表达CotC-P74融合蛋白的重组质粒pJS700-p74.通过双交换使该重组质粒中的CotC-P74表达盒整合到枯草芽胞杆菌染色体淀粉酶基因位点,并对发生同源重组后的菌株进行筛选和PCR鉴定.结果:PCR结果表明CotC-P74成功地整合到枯草芽孢杆菌基因组上,通过作者实验室制备的P74多抗对诱导后的重组芽孢衣壳总蛋白进行Western blot分析,结果在49 kDa位置处能杂交到一条特异的蛋白带.结论:P74蛋白胞外肽段成功地展示在枯草芽胞杆菌芽胞表面.     

枯草芽胞杆菌fmbj SrfAC-A结构域的活性测定

[目的]在体外研究surfactin合成酶的A结构域,为获得新的surfactin类似物奠定基础.[方法]本文从枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)fmbj中克隆出surfactin合成酶第7个模块的A结构域基因(SrfAC-A),与表达质粒pET-23a相连后在大肠杆菌表达系统中表达,用Ni-NTA亲和柱对重组蛋白SrfAC-A进行分离纯化后测定其活性.[结果]克隆所得的A结构域对Ile有选择活性,而对其他氨基酸基本无活性.[结论]Surfactin合成酶中的A结构域能在体外独立行使其选择底物氨基酸的功能.     

小鼠淋巴细胞抗原CTLA-4的胞外肽段表达及纯化

目的: 真核细胞表达小鼠淋巴细胞抗原CTLA-4胞外段肽,研究表达肽段与抗原呈递细胞B7分子结合后减轻小鼠淋巴细胞刺激后的增殖抑制,从而启动T淋巴细胞进一步增殖。方法:从小鼠脾脏淋巴细胞获得总RNA,通过逆转录PCR扩增出CTLA-4全长基因,克隆并测序。依据胞外段序列和真核表达载体pcDNA3.1序列,合成引物扩增胞外片段,两者经内切核酸酶处理、连接构建重组表达pcDNA3.1载体,重组质粒经测序验证后,采用lipofectamine 2000转染入小鼠肝癌细胞Hepa1-6,经G418筛选获得稳定表达细胞株。结果:获得小鼠CTLA-4胞外段真核表达载体和小鼠肝癌细胞Hepa1-6稳定表达转染细胞株,制备了CTLA-4胞外肽段,经His标签抗体和小鼠CTLA-4抗体Western blot检测表达蛋白带均呈阳性。结论:获得CTLA-4胞外段肽,为进一步研究该肽的作用打下基础。     

EH-L-Fc在CHO细胞中的表达、纯化及活性分析

目的:为延长重组新蛭素(EH)的半衰期,制备通过连接肽连接的重组新蛭素与IgG1Fc的融合蛋白EH-LFc,并对其进行功能分析。方法:采用重叠PCR技术构建Eh-L-Fc融合基因,克隆至表达载体pcDNA3.1,用脂质体将重组表达载体转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中,G418抗性筛选稳定克隆株;Western印迹检测培养上清中EH-LFc蛋白的表达,用有限稀释法对G418抗性筛选出的混合克隆单克隆化,通过Protein A亲和层析柱纯化融合蛋白,Lowry法检测蛋白浓度,SDS-PAGE、HPLC法检测目的蛋白纯度,质谱法分析相对分子质量,凝血因子Ⅹa裂解融合蛋白后采用纤维蛋白凝块法测定其抗凝活性。结果:构建了重组表达载体pcDNA3.1-Eh-L-Fc,并获得稳定表达EHL-Fc的细胞株。表达产物的相对分子质量为72 168,HPLC检测亲和层析获得的EH-L-Fc纯度达93.9%。完整的EH-L-Fc无抗凝活性,经凝血因子Ⅹa裂解后其抗凝比活性为96.6 ATU/mg。结论:获得稳定表达EH-L-Fc的CHO细胞株和较高纯度的重组融合蛋白,且该重组融合蛋白经凝血因子Ⅹa裂解后可释放抗凝活性。EH-L-Fc融合蛋白的获得为研究新蛭素的长效剂型奠定了重要基础。     

TRIM25及其缺失突变体真核表达载体的构建及表达

目的:扩增先天性免疫中具有重要功能的泛素连接酶TRIM25及其不同结构域的cDNA,构建带有不同标签的融合蛋白载体并进行细胞表达。方法:以TRIM25 cDNA为模板,PCR扩增不同结构域cDNA,扩增产物及载体经酶切、连接后,转化大肠杆菌DH5α,挑克隆,提取重组质粒后酶切鉴定、测序,将测序正确的重组质粒转染293细胞,用Western印迹对融合蛋白的表达进行鉴定。结果:TRIM25、Two-BOX结构域、SPRY结构域以正确读框插入Flag-pcDNA3.0,TRIM25以正确读框插入pCMV-Myc,RING结构域、CDD结构域、Two-BOX结构域以正确读框插入pEGFP-c1,上述重组质粒能够在293细胞中表达。结论:构建了TRIM25及其突变体的重组表达质粒并获得表达,为研究不同RNA病毒通过与TRIM25作用抑制宿主功能提供了基础。     

拟南芥硫酯酶基因在毕赤酵母中的表达

硫酯酶在生物体内能催化水解脂酰酰基载体蛋白和饱和脂肪脂酰链,对中链脂肪酸(Medium chain fatty acids,MCFAs)的积累起着关键作用。为获得具有生产中链脂肪酸能力的工程菌,以拟南芥c DNA为模板,PCR扩增得到其脂酰-ACP硫酯酶基因At Fat A,经Eco RⅠ/XbaⅠ双酶切后连接至同样双酶切的质粒中,获得重组质粒p PICZαA-At Fat。将重组质粒电击转入毕赤酵母GS115中,通过Zeocin抗性筛选,挑选出阳性克隆子并摇瓶发酵诱导,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析获得明显目的蛋白条带,首次成功构建At Fat A的真菌表达系统。气质联用法检测发酵产物胞外游离脂肪酸,发现毕赤酵母At Fat A重组菌株比起始GS115菌株胞外游离MCFAs(主要是辛酸)产量增加51%,MCFAs产量占胞外总脂肪酸产量的28.7%,而野生菌中这一比例仅有18.1%,这为日后生产安全无毒害的MCFAs探索了一条新的途径。     

复制缺陷型腺病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在体内外的高效转移和表达

为了构建含人凝血因子Ⅷ基因的重组腺病毒载体系统,首先构建了含ＦⅧ（Ｂ结构域缺失型）的载体质粒ｐＡｄ－ｈＦⅧ和插入内含子结构的ｐＡｄＩ－ｈＦⅧ,经脂质体介导,证明两质粒的目的基因均能在ＣＯＳ－７细胞中表达有凝血活性的ＦⅧ因子,其中经纯化的载体质粒ｐＡｄ－ｈＦⅧ与ｐＢＨＧ１０经脂质体介导,共转染至２９３包装细胞,经同源重组和Ｅ１蛋白反式互补,形成Ｅ１／Ｅ３缺失型重组腺病毒载体颗粒Ａｄ－ｈＦⅧ．ＰＣＲ检则到病理２９３培养液上清的病毒ＤＮＡ中具有目的基因扩增片段,证明病毒ＤＮＡ含有ＦⅧ基因．经扩增、纯化、滴度测定,用于感染离体细胞ＣＯＳ－７、Ａ５４９、Ｌ９２９、２９３．证实该病毒能在上述细胞中高效转移和表达目的基因,其表达量具有一定范围内的剂量依赖性．ＣＯＳ－７细胞中,ＭＯＩ＞１０００时,有细胞毒效应,表达量反而下降．经耳缘静脉注射Ａｄ－ｈＦⅧ至家兔后,１～４周能测到一定水平的ＦⅧ蛋白,１周内升至最高峰．免疫组化研究表明感染的离体细胞和家兔肝等组织均有ＦⅧ表达,其中肝脏表达最高．为甲型血友病的基因治疗开辟了新途径     

以杆状病毒为载体表达可溶性55kD人肿瘤坏死因子受体

从培养的HeLa细胞中提取总RNA,通过反转录PCR技术, 从该总RNA中扩增了约530 bp的shTNFR55基因的cDNA,将cDNA克隆至转移载体pAcGp67B的多角 体蛋白基因启动子的下游与转移载体构建成重组转移质粒pAcTNFR。pAcTNFR与杆状病毒AcNP V的DNA共转染昆虫细胞sf9,通过同源重组形成含有shTNFR55基因的重组病毒。经空斑分析 和DNA斑点杂交获得了纯化的重组病毒AcNPVTNFR。采用肿瘤坏死因子(TNF)敏感的L929细 胞检测表达产物的生物学活性。结果表明表达产物可以中和TNF对L929的细胞毒性。蛋白配 基印迹(Ligand blot)分析表明表达产物分子量约在20～25kD之间,有三条带。     

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)cDNA的克隆、表达和活性测定

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (TRAIL)能选择性诱导肿瘤细胞凋亡 .为利用基因工程技术获得重组TRAIL蛋白可溶性片段 (sTRAIL) ,设计 1对引物 .利用PCR技术特异性扩增出sTRAIL的cDNA ,克隆于质粒pGEM 3Zf( )的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .经测序证明序列正确后克隆于表达质粒pBV2 2 0的EcoRⅠ和PstⅠ位点 ,转化大肠杆菌DH5α .转化菌株经温度诱导 ,SDS PAGE检测和Western印迹鉴定 ,获得重组sTRAIL的高水平非融合表达菌株 .表达量占菌体总蛋白的 2 0 % .对其表达产物进行了初步纯化 ,SDS PAGE结果显示纯度可达 90 %以上 .用L92 9细胞测定其生物学活性表明 ,重组蛋白在体外能明显诱导肿瘤细胞凋亡