慢病毒靶向携带Survivin siRNA抗肺腺癌的体内研究

目的:探讨慢病毒载体介导的靶向survivin基因小干涉RNA(survivin-siRNA)对裸鼠移植人肺腺癌的体内抑瘤活性。方法:构建表达survivin-siRNA的慢病毒载体和移植人肺腺癌裸鼠模型,肿瘤组织局部注射survivin-siRNA慢病毒载体,观察肿瘤体积及随时间生长变化;PI染色检测细胞凋亡;流式细胞术检测肿瘤细胞周期变化。结果:慢病毒载体介导survivin-siRNA对裸鼠肺腺癌的抑瘤率为46.07%;30～35%的肿瘤细胞凋亡;G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例则明显减少。结论:靶向survivin的RNAi能有效抑制裸鼠移植人肺腺癌的生长,诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期改变。     

Ad-ING4-IL-24 双基因共表达对人肺腺癌化疗的增敏效应

研究ING4 (肿瘤生长抑制因子4) 和IL-24 (人白细胞介素24) 双基因共表达腺病毒载体 (Ad-ING4-IL-24) 对肺腺癌的化疗增敏效应及分子机制。将Ad-ING4-IL-24感染A549肺癌细胞及联合顺铂 (DDP) 化疗药物作用,RT-PCR和Western blotting检测ING4和IL-24基因在A549肺癌细胞中的转录和表达,MTT法、流式细胞仪 (FCM) 和 Hoechst 染色法检测Ad-ING4-IL-24联合DDP (联合组) 对A549肺癌细胞的生长抑制和凋亡效应。采用A549细胞株建立人肺腺癌裸鼠模型,然后瘤体局部注射干预用药,动态测量肿瘤体积,并计算瘤重抑瘤率,免疫组化检测ING4、IL-24、bax、bcl-2、VEGF等基因的表达。结果表明,Ad-ING4-IL-24感染A549肺癌细胞后可获得成功转录和表达,体外联合组能明显抑制A549肺癌细胞生长和诱导细胞凋亡,呈现出典型细胞凋亡形态学变化。体内联合组同样能显著抑制肿瘤生长,瘤重抑瘤率达52.81％,免疫组化结果显示联合组能上调bax基因表达,同时下调bcl-2、VEGF等基因的表达。以上结果表明Ad-ING4-IL-24具有化疗增敏的作用,该作用机制可能与促进肿瘤细胞凋亡和抑制血管形成有关。     

土牛膝醇提物提取工艺优化及体外抗人肺腺癌A549细胞活性研究CSCD

土牛膝是应用广泛的药用植物,其功效众多,为研究其醇提物抗癌功效,采用Box-Behnken响应面法优化土牛膝的醇提工艺,并对醇提物进行体外人肺腺癌A549细胞毒性及细胞划痕试验。获得了最佳提取工艺为:提取温度90℃,液料比40∶1,提取时间2 h,在此条件下,土牛膝醇提物提取率为9.23%。细胞毒性试验结果显示,随着醇提物浓度的上升,A549细胞的存活率迅速下降,当醇提物浓度为256μg/mL时,对A549细胞的抑制率达94.65%,且细胞划痕结果显示醇提物对A549细胞迁移有一定抑制作用,可为研究土牛膝药用特性提供参考。     

探寻干细胞的多潜能性

研究人员鉴定了在干细胞研究中调节自我更新和分化的关键因素。多潜能干细胞能分化为“在体内生长为所有细胞类型的”子细胞，或者能被刺激分化为一种专门的状态。2006年，两个研究组分别发表了热点文章，开始揭示“控制多潜能性分化决定”的调控网络。     

肺腺癌中ALK基因重排的检测*

目的: 比较免疫组化(Ventana IHC)和荧光原位杂交技术(FISH)对肺腺癌ALK基因的检出率。方法: 收集200例肺腺癌患者的临床及病理资料,光学显微镜下复阅其HE切片,标记肿瘤部位,评估蜡块保存情况,制成9张组织芯片,分别采用Ventana IHC和FISH检测ALK基因。结果: 200例病例中,通过FISH检测ALK阳性有9例,通过Ventana IHC检测ALK阳性有11例,其中有两例表现为Ventana IHC(+)、 FISH(-),1例外院做过基因检测,为ALK阴性,EGFR阳性,服用凯美钠,效果良好,另1例未做过基因检测,遂进一步予RT-PCR检验,结果为ALK阴性。最终ALK阳性为9例,Ventana IHC的敏感性和特异性分别是100%和98.95%。结论: Ventana IHC在检测ALK基因重排上表现出较高的敏感性和特异性,可用于FISH检测前的筛选,以避免不必要的FISH检测。     

EGFR基因21外显子L858R突变肺腺癌患者化疗和靶向治疗疗效的对比研究

目的:研究化疗和靶向治疗对EGFR基因21外显子L858R突变肺腺癌患者的临床疗效和患者生存率的影响。方法:选择2012年1月~2016年1月在重庆市肿瘤医院治疗的95例EGFR基因21外显子L858R突变的肺腺癌患者,按患者治疗方式不同分为化疗组(n=54)和靶向组(n=41)。化疗组患者采用一线化疗药物进行治疗,靶向组患者采用EGFR基因靶向制剂进行治疗。在完成一个周期治疗后,比较两组患者的近期疗效及治疗过程中不良反应的发生情况。对患者进行为期1年的随访,比较其生存情况。结果:(1)化疗组患者治疗后临床总有效率为92.59%(50/54),靶向组总有效率为73.17%(30/41),化疗组显著高于靶向治疗组(P=0.010)。(2)化疗组不良反应发生率为25.93%(14/54),靶向治疗组则为19.51%(8/41),组间比较差异无统计学意义(P=0.463)。(3)在随访过程中,化疗组患者有18例死亡,36例存活,患者生存率为例66.67%;靶向组患者有24例死亡,17例存活,患者生存率为41.46%,化疗组生存率显著高于靶向治疗组(P=0.014)。结论:对于EGFR基因21外显子L858R突变肺腺癌患者而言,采用化疗治疗的疗效明显优于靶向治疗,且二者安全性相当,化疗治疗的患者预后较靶向治疗者更好。     

肺腺癌干细胞表达小细胞肺癌相关抗原的实验研究

肿瘤干细胞（cancerstem cells,csc）是指一类具有自我更新（self-renewal）能力的未分化细胞。在肺腺癌中,csc的自我更新调控机制类似胚胎干细胞,即高表达OCT4、Nanog和Sox2}潜能基因,但目前对其表型特征尚存争议。该文采用成球试验（sphere—formingassay）AkSPC—A1细胞株中富集CSC后进行分子表型分析。结果显示,此类肺球体细胞（pulmospheres）同时表达肺脏近端和远端呼吸上皮的多个谱系（1ineage）标志,包括纤毛柱状细胞标志FoxJl、非纤毛柱状细胞（即Clara细胞）标志CCSP、肺神经肉分泌细胞标志GRP、II型肺泡细胞标志SP-C及其转录调控因子TTF-1。这些肺球体细胞也能够被3株小细胞肺癌特异性单抗（2F7、483和E6）所识别。通过基因沉默技术使得肺球体细胞中OCT4表达转阴后,上述标志（除E6P外）均消失。研究结果揭示,肺癌CSC具有肺脏呼吸上皮多潜能细胞的表型特征。此外,初步研究结果发现,中药冬虫夏草（Hirsutella Hepialid of Cordyceps Sinensis）的被毛孢菌丝体中含有新颖抗癌成分,能够显著遏制肺球体细胞增殖,提示对其进行分离鉴定,将是研制开发肺癌CSC靶向药物的一个发展方向。     

Targeting of Herpes Simplex Virus 1 Thymidine Kinase Gene Sequences into the OCT4 Locus of Human Induced Pluripotent Stem Cells

The in vitro differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSC) to generate specific types of cells is inefficient, and the remaining undifferentiated cells may form teratomas. This raises safety concerns for clinical applications of hiPSC-derived cellular products. To improve the safety of hiPSC, we attempted to site-specifically insert a herpes simplex virus 1 thymidine kinase (HSV1-TK) suicide gene at the endogenous OCT4 (POU5F1) locus of hiPSC. Since the endogenous OCT4 promoter is active in undifferentiated cells only, we speculated that the HSV1-TK suicide gene will be transcribed in undifferentiated cells only and that the remaining undifferentiated cells can be depleted by treating them with the prodrug ganciclovir (GCV) prior to transplantation. To insert the HSV1-TK gene at the OCT4 locus, we cotransfected hiPSC with a pair of plasmids encoding an OCT4-specific zinc finger nuclease (ZFN) and a donor plasmid harboring a promoter-less transgene cassette consisting of HSV1-TK and puromycin resistance gene sequences, flanked by OCT4 gene sequences. Puromycin resistant clones were established and characterized regarding their sensitivity to GCV and the site of integration of the HSV1-TK/puromycin resistance gene cassette. Of the nine puromycin-resistant iPSC clones analyzed, three contained the HSV1-TK transgene at the OCT4 locus, but they were not sensitive to GCV. The other six clones were GCV-sensitive, but the TK gene was located at off-target sites. These TK-expressing hiPSC clones remained GCV sensitive for up to 90 days, indicating that TK transgene expression was stable. Possible reasons for our failed attempt to selectively target the OCT4 locus are discussed.     

OCT4 介导卵泡刺激素对永生化人卵巢上皮细胞株增殖、 凋亡和侵袭能力的影响

目的:探讨OCT4基因对卵泡刺激素作用下的永生化人卵巢上皮细胞株(Moody细胞)增殖、凋亡和侵袭能力影响。方法:将不同浓度的FSH(0、25、50、100mIU/ml)作用于Moody细胞48小时,应用Western-blot技术检测OCT4表达情况。采用慢病毒介导将重组质粒OCT4稳定转染至人卵巢上皮细胞株中,应用Western-blot法鉴定OCT4蛋白表达情况。FSH以50 mIU/ml作为工作浓度,实验对象分为4组:①siCon组,转染空载体的阴性对照组;②OCT4组:稳定转染OCT4基因的Moody细胞组;③FSH+siCon组:以FSH处理的siCon组;④FSH+OCT4组:以FSH处理的OCT4组。采用MTT比色法检测各组细胞的增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,Transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭能力的变化。结果:(1)随着FSH浓度的增加,Moody细胞中OCT4蛋白表达逐渐增高,在FSH浓度为50 mIU/ml时达最高;(2)OCT4基因成功转染至Moody细胞中,经Western-blot检测该基因在细胞中进行蛋白高表达;(3)FSH+OCT4组细胞增殖活性明显增高,同时凋亡率降低,与另外三组相比差异具有统计学意义(P<0.05);(4)在FSH作用下,转染OCT4后明显增强了细胞的侵袭能力,与另外三组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:OCT4介导了FSH对人卵巢上皮细胞增殖、凋亡、侵袭活性的调控。     

基于RNA干扰CMTM7 对肺腺癌A549细胞凋亡的影响

目的:探讨基于RNA干扰CMTM7对肺腺癌A549细胞凋亡的影响。方法:选择肺腺癌A549细胞株分为si RNA组、阴性对照组与空白对照组,在对数生长的A549细胞中转染RNA干扰CMTM7载体、脂质体空载体和不进行转染,观察A549细胞的生长、凋亡与细胞周期状况。结果:MTT实验显示si RNA转染组的抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组(P0.05),阴性对照组与空白对照组的对比无明显差异(P0.05)。流式细胞术实验表明si RNA转染组的细胞凋亡率明显高于阴性对照组和空白对照组(P0.05),阴性对照组与空白对照组的对比无明显差异(P0.05)。流式细胞术实验表明si RNA转染组的G0/G1期细胞数目较阴性对照组和空白对照组增多明显(P0.05),同时si RNA转染组的S、G2/M期细胞数目较阴性对照组和空白对照组明显减少(P0.05),阴性对照组和空白对照组对比差异无统计学意义(P0.05)。结论:RNA干扰CMTM7能够促进肺腺癌A549细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的生长,其作用机制可能通过干扰细胞周期而实现。     

肺脏的呼吸腺泡及其成体干细胞研究进展

肺脏是机体与外界环境沟通的重要脏器之一,环境有害因子如病原微生物和致癌物可以直接损伤呼吸道上皮,对这类损伤的修复功能主要由呼吸道上皮内的肺干细胞或其祖细胞承担。呼吸系统的基本结构单位是呼吸腺泡,其表面积约占呼吸系统总面积的99%以上,是呼吸系统疾病包括恶性肿瘤发病的主要区域。现有证据显示,在肺脏的胚胎发育期,呼吸腺泡源自远端干细胞,在成体肺脏内此类肺干细胞主要分布在细支气管分叉处以及细支气管与肺泡导管的连接处,其恶性转化是肺癌的主要发病机理。因此,探讨呼吸腺泡中肺干细胞的生物学特性,有助于深入了解肺癌的癌变早期分子机制并为肺癌防治提供有效靶标。     

糖浓度及BMP4对小鼠诱导型多能干细胞成骨作用的研究

诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells）技术的建立为自体组织工程治疗带来了新的希望。鉴于糖尿病患者常伴有骨再生性障碍,该研究比较了不同葡萄糖浓度下小鼠iPS细胞的成骨能力,并探讨了骨形态蛋4（bone morphogenetic protein4,BMP4）在该过程中的作用。实验结果显示：成骨诱导21d后,低糖组茜素红阳性细胞比例和成骨基INRunx2、Osteocalcin的表达水平显著高于高糖组和自发分化组（P〈0．05）;BMP4的添加提高了高糖组茜素红阳性细胞比例及Osteocalcin的表达水平（P〈0．05）,而对自发分化组细胞的成骨水平无影响。该结果表明：低葡萄糖含量对小鼠iPS细胞的骨向分化有促进作用’尽管BMP4可以提高高糖组小鼠iPS细胞的成骨能力,但仅在成骨分化条件下发挥作用。     

TAp73调节肺腺癌细胞的血管生成能力依赖P53状态

TAp73是P53家族的一员,能够调节肿瘤的生成、侵袭和转移。但是,TAp73调节肿瘤血管生成的作用备受争议。本研究将外源TAp73转染至P53基因表达状态不同的两株肺腺癌细胞系H1299(P53-null)和A549(wt P53)中,观察TAp73对肿瘤血管生成的作用并探讨与P53基因的关系。首先,使用RT-PCR和Western印迹验证转染效率。细胞划痕实验表明,TAp73在A549细胞中促进细胞迁移,而在H1299细胞中抑制细胞迁移。体外HUVEC血管形成结果表明,TAp73在A549细胞中促进细胞血管形成,而在H1299细胞中抑制细胞血管形成。同时,血管生成抑制蛋白1（VASH1）的表达水平,也分别升高或降低。 本文研究结果表明,TAp73对肺腺癌细胞血管生成的作用依赖于P53基因的状态：在野生型P53基因存在时,TAp73促进血管生成,而在缺失P53基因的情况下,TAp73抑制血管生成。本研究对于TAp73作为肿瘤的潜在治疗靶点具有重要意义。     

Intracellular Free Calcium Concentration and Cisplatin Resistance in Human Lung Adenocarcinoma A549 Cells

Human lung adenocarcinoma A₅₄₉ cells sensitive and A₅₄₉/DDP cells resistantto Cis-dichlorodiammine platinum[II] (cisplatin) exhibit differentintracellular free calcium and calcium fluorescence images labeled withFura-2/AM and Fluo-3/AM as judged by dual-excitation fluorescence assay,Miracal Imaging and Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM) of singlecells. The concentration of intracellular free calcium of the resistantA₅₄₉/DDP cells is one third that of the sensitive A₅₄₉ cells. The effluxof Rhodamine 123 in resistant A₅₄₉/DDP cells is faster than that insensitive A₅₄₉ cells. In addition, A₅₄₉/DDP cells have an increase ofPhosphatidylinositol 4-kinase (PtdIns 4-kinase) activity in the plasmamembrane. So it is tentatively suggested that the increase in PtIns4-kinase activity resulting from lower intracellular Ca²⁺concentration leads to an increase of its enzymaticproducts——PIP and PIP₂, which may stimulate the activity ofP-glycoprotein.