羧酸酯酶A2在大肠杆菌中的表达及特征分析

本研究采用RT-PCR法从抗性蚊虫(Culex quinquefasciatus)中克隆了羧酸酯酶A2的全长cDNA,对其进行了序列测定,并构建了融合表达质粒pET-ESTA2。转化大肠杆菌BL21后,在异丙基硫代牛乳糖苷(IPTG)的诱导下,使羧酸酯酶A2在大肠杆菌内得到表达。表达产物经亲和层析纯化获得了1条带的重组蛋白。与报道的从蚊虫体内纯化的羧酸酯酶相比,从表达产物中纯化的羧酸酯酶Km与其一致,但从表达产物纯化的羧酸酯酶的Vm比蚊虫中纯化的羧酸酯酶的Vm高。表明用亲和层析纯化的羧酸酯酶A2比从蚊虫中提取的纯度高。羧酸酯酶A2表达纯化及特征分析为其应用奠定了基础。     

东亚飞蝗羧酸酯酶基因的克隆和原核表达

羧酸酯酶是昆虫体内重要的代谢解毒酶系,其主要功能是水解和结合内源性和外源性含有酯键的有毒物质,减缓其到达靶标部位的时间。东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)是我国重要的农业害虫,对其羧酸酯酶基因克隆和表达有助于深入探索杀虫剂代谢毒理机制。本研究首先对羧酸酯酶基因(CarE4)进行了克隆,并将其插入到pCold TF DNA Vector中,在大肠杆菌中进行了原核表达,最后用疏水层析和离子交换层析方法对目的蛋白进行了纯化。本文成功建立了羧酸酯酶蛋白原核表达和纯化技术体系,为进一步研究东亚飞蝗羧酸酯酶的生理功能、结构特点和作用原理提供了基础资料。     

Cloning and prokaryotical expression of CarE gene in Locusta migratoria manilensis

羧酸酯酶是昆虫体内重要的代谢解毒酶系,其主要功能是水解和结合内源性和外源性含有酯键的有毒物质,减缓其到达靶标部位的时间.东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis (Meyen)是我国重要的农业害虫,对其羧酸酯酶基因克隆和表达有助于深入探索杀虫剂代谢毒理机制.本研究首先对羧酸酯酶基因(CarE4)进行了克隆,并将其插入到pCold TF DNA Vector中,在大肠杆菌中进行了原核表达,最后用疏水层析和离子交换层析方法对目的蛋白进行了纯化.本文成功建立了羧酸酯酶蛋白原核表达和纯化技术体系,为进一步研究东亚飞蝗羧酸酯酶的生理功能、结构特点和作用原理提供了基础资料.     

A型肉毒毒素轻链的原核表达、纯化及活性鉴定

目的:在大肠杆菌中表达、纯化A型肉毒毒素轻链(Bo NT/A LC),研究其生物学活性。方法:根据Gen Bank中报道的Bo NT/A LC基因序列设计特异引物,从肉毒梭菌中扩增Bo NT/A LC基因片段,构建重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,IPTG诱导目的蛋白高效表达,表达产物经Ni螯合亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,并利用相应底物对纯化产物进行生物活性分析和酶活动力学测定。结果与结论:构建了重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,原核表达获得高水平可溶性重组Bo NT/A LC,纯化得到纯度较高的蛋白质,重组Bo NT/A LC的酶活略高于A型肉毒毒素全毒素,可作为试剂用于Bo NT/A LC抑制剂高通量体外检测方法研究。     

重组人α2a干扰素的高效表达与纯化

构建了人α2a型干扰素的表达载体,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量平均为10~ IU/L菌液。还对其表达产物进行了纯化。经盐酸胍裂解菌体、硫酸铵沉淀、酸化处理,再经阴、阳离子交换层析和单克隆抗体亲和层析,使表达产物纯化了1072倍,比活性达1.2×IO~ IU/mg蛋白,达到序列纯,回收率达54％。表达产物N端21个氨基酸序列分析结果与IFN-α2a cDNA推导的序列相符合。     

HIV-1p24蛋白在大肠肝菌中的高效可溶性表达、一步纯化及抗原性分析

合成引物扩增HIV 1p2 4基因 ,并将其克隆到 pQE 30质粒中 ,使其在大肠杆菌E .coliM 15中以IPTG诱导高效表达 ,经SDS PAGE分析 ,该表达产物约占菌体总蛋白 2 0 % ,并且以可溶蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中。经镍离子柱亲和层析一步纯化 ,洗脱产物中 p2 4蛋白纯度达95 %。ELISA分析表明 ,该蛋白可与HIV感染者血清发生特异性免疫反应。以此蛋白交联Sepharose 4B ,亲和层析纯化HIV感染者血清中的抗体 ,用所得抗体与HIV确认试剂反应 ,发现该纯化抗体仅与确认试剂中的 p2 4蛋白反应。上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性HIV 1p2 4蛋白 ,该蛋白具有良好的抗原性     

尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2Ⅱ的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒酸性磷酯酶 A2 ( A.a APLA2 )基因克隆至温敏表达载体 p BLMVL2 ,在大肠杆菌 RR1中成功诱导表达 .表达产物 A.a APLA2 约占细菌蛋白质总量 2 5 % ,并以包涵体形式存在 .纯化包涵体后 ,将产物变性、复性 ,然后用 FPLC Superose TM1 2纯化 ,产物经过 SDS- PAGE检测只有单一条带 .对纯化后的表达 A.a APLA2 进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定 .结果显示 ,A.a APLA2 的酶活性处于变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶 A2 和碱性磷脂酶A2 的酶活性之间 ,没有抑制血小板聚集活性 ,只有微弱溶血活性 .最后对 PLA2 的结构与这些活性的关系进行了讨论     

流行性感冒病毒M2蛋白可溶性表达及其免疫原性的研究

流行性感冒（流感）的M2蛋白是其保护性抗原之一,在几科所有甲型流感病毒中高度保守,因此可以用来研究具有交叉保护能力的流感疫苗。然而M2分子在病毒颗粒中含量非常少,用从病毒中纯化的方法很难获得足够的免疫原。在原核表达时发现,M2蛋白对宿主菌具有很强的毒性作用,导至其死亡,因此很难获得高表达。在本研究中,采用RT－PCR方法从病毒感染的MDCK细胞中克隆了A1／PR／8／34毒株的M2基因,然后通过基因工程手段缺失了M2蛋白的跨膜区26－55位氨基酸的编码序列,将其克隆以pET-32a中,与硫氧还蛋白融合,在大肠杆菌中获得了高效表达,并且表达产物以可溶形式存在,不形成包涵体。利用硫酸铵盐析结合金属离子鏊和柱亲和层析的方法纯化了表达的融合蛋白。免疫荧光实验表明,融合蛋白免疫小鼠后产生的抗血清能够与流感病毒感染的细胞发生特异性的结合,证明表达产物具有流感病毒M2蛋白的抗原性。     

重组幽门螺杆菌ureA,ureB低温表达、纯化及抗原鉴定

目的：建立经济有效的方法,从大肠杆菌表达,纯化重组幽门螺杆菌尿素酶A、B亚单位。方法：含重组表达质粒pGEX-2T/ureA,pGEX-2T/ureB大肠杆菌分别在不同浓度IPTG、不同温度条件下作诱导培养,以SDS-PAGE分析表达产物,采用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层分离纯化表达产物,以Western-blotting和ELISA对纯化产物作抗原性分析鉴定。结果：IPTG诱导浓度为0.1mmol/L;诱导温度为28℃,含重组质粒大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST-ureA、GST-ureB各约占总表达产物的78%和87%,经亲和层析,得纯度90%以上的GST-ureA约为14mg/L。GST-ureB约为18mg/L;融合蛋白呈ureA、ureB抗原性反应。结论：建立了低温诱导及纯化高纯度ureA、ureB基因表达产物的方法,所得纯化产物具有ureA、ureB抗原活性,为进一步的应用研究打下基础。     

大鼠CRIP2蛋白的表达和分离纯化

目的:获得大鼠crip2基因片段,并在大肠杆菌中表达、纯化大鼠CRIP2(cysteine-rich intestinal protein 2)蛋白。方法:从大鼠主动脉组织中提取总DNA,RT-PCR扩增出相应大小的crip2 DNA片段,与pGEM-T-easy载体连接后测序;将测序正确的crip2按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET A,将连接产物转化大肠杆菌BL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6×His融合蛋白,通过镍柱进行纯化。结果:PCR获得的crip2序列与GenBank报道的一致(为707 bp);重组融合蛋白在大肠杆菌BL21中以可溶形式高效表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析,在相对分子质量为27×103处有特异的蛋白条带,经镍柱纯化后,得到了高纯度的CRIP2融合蛋白。结论:克隆了大鼠crip2基因片段,并在大肠杆菌BL21中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度的CRIP2融合蛋白。     

结核分枝杆菌Rv3369基因的表达和纯化

在大肠杆菌中高效表达结核分枝杆菌Rv3369蛋白,获得纯化的重组蛋白rRv3369。通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增Rv3369基因;以质粒pET28a为表达载体,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3);以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,通过SDS-PAGE鉴定rRv3369在大肠杆菌中的表达,确定rRv3369在大肠杆菌中的表达形式;采用Ni-NTA His.Bind Resin来纯化重组蛋白。重组质粒pET28a-Rv3369中目的基因测序结果与报道序列相同。分子量约19.5kDa,表达量约占菌体总蛋白的18%,纯化后的重组蛋白样品经SDS-PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为90%以上,每100mL培养菌可获得1.56mg左右的重组蛋白。用亲和层析法纯化的重组蛋白纯度较好。     

Fusion expression of mutated cecropin CMIV in E. coli

A cDNA coding mutated cecropin CMIV from Bombyx mori was synthesized according to its amino acid sequense using E .coli biased codons .The gene was cloned into the fusion expression vector pEZZ318 and was expressed in E .coli HB101.The fusion protein produced was purified by affinity chromatography to yield 26 mg/L fusion product .The anti-bacterial activities of recombinant cecropin CMIV were recovered after cleavage by chemical method.     

重组人钙网蛋白的克隆与原核表达

［摘要］目的: 克隆人钙网蛋白（calreticulin,CRT）并在E.coli中原核表达和纯化。方法：采用RT-PCR 法从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人钙网蛋白cDNA,构建CRT原核表达质粒（pET-15b/CRT）并转化E.coli 的Rossetta菌株。IPTG诱导后,表达蛋白在变性条件下经Ni-NTA 树脂亲和层析纯化,然后透析复性。分别用SDS-PAGE和Western blotting法鉴定CRT表达和纯化状态。结果：从A549细胞总RNA中成功获得人CRT cDNA克隆,重组质粒pET-15b/CRT构建正确。转化pET-15b/CRT的E.coli Rossetta诱导性表达重组人CRT蛋白,该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化。结论：成功建立了CRT原核表达和纯化的实验方法,该方法为后续的CRT蛋白功能研究奠定了基础。     

禽多杀性巴氏杆菌P1059成熟黏附蛋白的原核表达、纯化和抗原性检测

目的：建立rCPM36在大肠杆菌中的表达体系,纯化表达产物并检测其抗原性。方法：运用PCR方法从禽多杀性巴氏杆菌国际标准株P1059基因组中扩增出编码36kDa成熟黏附蛋白的cpm36基因,构建原核表达载体pQE30-cpm36,转化到大肠杆菌M15中并诱导表达目的蛋白,用镍离子螯合层析柱纯化目的蛋白及制备其抗体,Western印迹分析其抗原性。结果：SDS-PAGE结果显示目标蛋白以可溶性形式表达在大肠杆菌M15细胞质中,其相对分子质量为37kDa,Western印迹结果表明表达蛋白具有良好的抗原性。结论：成功构建出原核表达载体并实现了目的蛋白表达,用镍离子螯合层析柱纯化得到具有抗原性的蛋白,为进一步开展禽多杀性巴氏杆菌黏附因子和保护性抗原的研究奠定基础。     

重组人β防御素3在大肠杆菌中的表达和活性分析

防御素是生物界广泛分布的一类低分子短肽,具有广谱高效的杀菌、抗肿瘤作用,并且不易使微生物产生抗药性,具有很高的应用价值,其中最引人注目的是β防御素[1,2].人β防御素3(humanβ-defensin3,hBD3)是最近发现的第3种人源性β防御素,与其它人防御素相比,在抗菌活性等方面具有明显优势,是所有防御素中抗菌能力最强的之一[3~7],具有独特的研究和开发价值.为了得到高效表达hBD3的工程菌株,本实验按照细菌对密码子的偏爱,人工合成了hBD3的寡核苷酸片段,构建了其表达载体.经IPTG诱导、分离纯化和肠激酶切割,得到了与天然hBD3活性基本相同的…     

重组人半乳凝集素-1的原核表达、纯化及生物活性检测

目的:在大肠杆菌中表达半乳凝集素-1(galectin-1),并进行纯化及生物活性检测。方法:将人半乳凝集素-1基因克隆至带有His融合标签的原核表达载体pQE-30上,转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,表达产物经亲和层析纯化后,进行Western印迹鉴定,并用红细胞凝集试验检测其生物学活性。结果:双酶切鉴定和核苷酸序列测定表明重组表达质粒pQE-30-Galectin-1构建正确;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,且具有良好的红细胞凝集活性。结论:在大肠杆菌中表达了重组人半乳凝集素-1,且具有良好的生物活性。     

Studies on chemical synthesis of human cystatin A gene and its expression in Escherichia coli

A synthetic gene containing the coding sequence for the human cysteine proteinase inhibitor, cystatin A, was obtained by enzymatic assembly of 20 oligodeoxyribonucleotides which had been chemically synthesized by the solid phase phosphoramidite method. It was cloned into an Escherichia coli plasmid. The expression plasmid for cystatin A was constructed by introducing the synthetic gene downstream of the tac promoter of an E. coli plasmid which is a derivative of pKK223-3 with high copy number. The gene was expressed in E. coli JM109 without IPTG-induction. The expression of cystatin A was detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the E. coli JM109 lysate, followed by immunoblotting using rabbit antiserum raised with human epidermal cystatin A and alkaline phosphatase-conjugated goat anti-rabbit IgG. The result showed that the molecular weight of the expression product is identical with that of the authentic protein and the antigenic properties are also the same. Furthermore, the expression product purified with a CM-papain Sepharose affinity column and FPLC system with a Mono-Q column showed the same inhibitory activity for various cysteine proteinases. Also, purified recombinant cystatin A was found to have identical amino acid composition, NH2-terminal amino acid sequence, and peptide-map on reverse phase HPLC with those of the authentic inhibitor.     

猪瘟病毒E2蛋白A3BCD主要抗原结构域的原核表达

目的：对猪瘟病毒E2蛋白A3BCD进行原核表达,以期获得具有抗原活性的表达产物。方法：利用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nPCR）技术从河南省近期流行猪瘟病毒野毒株中扩增得到E2基因,并将其克隆至pUCm-T载体,构建克隆载体pUCm-TE2;利用PCR方法扩增E2基因的主要抗原域A3BCD,克隆至pET-32a（＋）载体,构建表达载体pET-32aE2-2,转化到大肠杆菌Rosetta（DE3）中,用IPTG进行诱导表达,对诱导产物进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果：SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约35000处出现预期条带,表达产物主要以包涵体形式存在;Western-blotting检测表明,表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带;用8mol／L尿素（pH8.0）溶解包涵体,经Ni-NTA亲和层析法纯化,获得纯度较高的目的蛋白,ELISA检测表明能与猪瘟抗体阳性血清发生特异性反应。结论：重组质粒pET-32aE2-2转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,解除了由于稀有密码子造成的表达限制,表达量得到提高;表达产物为硫氧还蛋白和E2-2的融合蛋白,易于纯化,且具有活性,为研制猪瘟抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础。     

Expression of cDNAs encoding wild-type and mutant neuromodulins in Escherichia coli: comparison with the native protein from bovine brain

Murine cDNA that encodes neuromodulin, a neurospecific calmodulin binding protein, was inserted into the plasmid pKK223-3 for expression in Escherichia coli. After being transformed into E. coli strain SG20252 (lon-), the expression vector directed the synthesis of a protein that was recognized by polyclonal antibodies raised against bovine neuromodulin. The recombinant protein expressed in E. coli was found to be tightly associated with insoluble cell material and was extractable only with guanidine hydrochloride or sodium dodecyl sulfate. Following solubilization with guanidine hydrochloride, the protein was purified to apparent homogeneity by a single CaM-Sepharose affinity column step with a yield of 0.2 mg of protein/L of E. coli culture. The availability of the purified recombinant neuromodulin made it possible to answer several specific questions concerning the structure and function of the protein. Despite the fact that murine neuromodulin is 12 amino acid residues shorter than the bovine protein and the recombinant protein expressed in E. coli may lack any posttranslational modifications, the two proteins displayed similar biochemical properties in almost all respects examined. They both had higher affinity for CaM-Sepharose in the absence of Ca2+ than in its presence; they were both phosphorylated in vitro by protein kinase C in a Ca2+- and phospholipid-dependent manner; neither form of the proteins was autophosphorylated, and the phosphorylated form of the proteins did not bind calmodulin. The recombinant neuromodulin and neuromodulin purified from bovine brain had similar, but not identical, affinities of calmodulin, indicating that the palmitylation of the protein that occurs in animal cells is not crucial for calmodulin interactions.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)