绿色荧光蛋白标记的葡萄糖转运蛋白4稳定表达细胞系的建立

目的:建立稳定表达EGFP标记的葡萄糖转运蛋白4的CHO细胞系,为研究GLUT4在CHO细胞中的转运调节机制奠定基础。方法:采用分子克隆方法构建GLUT4-EGFP的融合蛋白,在FLP-in的CHO细胞系中表达,潮霉素筛选后得到稳定的细胞系。结果:通过共聚焦显微镜的检测,证明了此稳定细胞系的阳性率达到了99%。定位研究表明大部分GLUT4以囊泡形式分布在CHO细胞胞浆内,但是质膜上也有少量的GLUT4。结论:建立了一个稳定表达GLUT4-EGFP的CHO细胞系,为进一步研究GLUT4的转运提供了一个很好的细胞模型。     

新物种诱导多能干细胞的研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESC）在人类遗传病学研究、疾病模型建立、器官再生以及动物物种改良和定向变异等方面的地位是其他类型的细胞不可取代的。但是,由于实验技术和体外培养条件的限制,除了小鼠、恒河猴和人之外,大鼠、猪、牛、羊等其他哺乳动物的ES细胞系被证明很难获得。先后有多个研究小组报道了他们利用新兴的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS细胞）技术成功建立大鼠和猪的iPS细胞系的研究成果。迄今为止,这两个物种是在未成功建立ES细胞系之前利用iPS技术建立多能干细胞系的成功范例。这些研究对于那些还未建立ES细胞的物种建立多能干细胞系提供了一种新的方案,也将给这些物种的胚胎干细胞的建立、基因修饰动物的产生以及人类医疗事业的促进和发展带来新的希望。     

家蚕胚胎细胞系BmE-SWU1的建立及其生物学特性

对家蚕反转期胚胎组织进行一年多的原代培养,分离筛选出了高繁殖细胞群体,建立了BmE-SWU1细胞系。该细胞系以梭形和近圆形细胞为主,杂以少量多突起和巨型细胞。细胞系的倍增时间在28℃时为57.6h,染色体呈短杆状或颗粒状,染色体数目异倍化,具有典型鳞翅目昆虫细胞系的染色体特征。BmE-SWU1细胞系对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)高度敏感,半数组织培养感染剂量(TCID50)为2.92415×10-7。     

小鼠胚胎干细胞(ES-8501细胞)建系过程的核型及特性分析

小鼠胚胎性癌(EC)细胞系的细胞核型大多数异常,对用于分析EC细胞与胚胎细胞之间的关系和进行嵌合体研究等都是不利的。人们都期望能有正常核型的胚胎细胞系的建立。近年来Evans和Kaufman以及Martin等人先后用不同方法直接从小鼠的内细胞团(ICM)细胞建立了多潜能的胚胎干细胞(erabryonicstem eells,简称ES细胞),也有人称之为EK     

家蚕胚胎细胞系BmE-SWU2的建立及其生物学特性研究

家蚕反转期胚胎组织经过一年多的原代培养,建立了BmE-SWU2细胞系。该细胞系细胞呈短梭形或圆形,细胞较小,属上皮型贴壁生长细胞系;细胞生长速度快,铺平率高于80%,繁殖力强,细胞群体倍增时间为51.8 h。BmE-SWU2细胞系的二倍体细胞（2n=56）比例达到89.76％,属二倍体细胞系,其染色体具有鳞翅目昆虫染色体的典型特征,中期染色体呈短杆状或颗粒状。BmE-SWU2细胞系对BmNPV高度敏感,TCID₅₀为1.581×10^-7。     

建立人类异常染色体核型的成纤维细胞系及滋养层细胞系

从自然流产绒毛或者中期妊娠羊水中分离细胞体外培养, 建立人类异常染色体核型成纤维细胞系及滋养层细胞系.中期妊娠羊水染色体诊断或自然流产绒毛染色体诊断过程中, 行G显带细胞核型分型, 对于发现异常核型的细胞, 进行分离、培养、传代、冻存、复苏及鉴定, 建立细胞系, 用PowerPlex 16系统行DNA-STR基因型检测.建立1株来自羊水的21三体成纤维细胞系, 以及7株来自绒毛的滋养层细胞系, 核型分别为47, XX 21; 69, XXX; 69, XXY; 47, XY 12; 47, XX 5; 48, XY 21, 22; 47, XY 18.所有细胞系体外传代均超过10代, 冷冻复苏率大于50%, 核型维持稳定, DNA-STR基因检测能对人细胞系进行个体识别.人异常染色体核型的成纤维细胞系和绒毛膜滋养层细胞系的建立,可以为探讨异常染色体产生机制及相关的分子遗传学研究提供细胞来源.     

四个达摩凤蝶新孵幼虫细胞系的建立及其生物学特性

【目的】建立达摩凤蝶 Papilio demoleus Linnaeus新孵幼虫细胞系,并对其生物学特性进行研究。【方法】使用改良配方的Grace培养基并辅以20%胎牛血清,通过原代和传代培养建立达摩凤蝶新孵幼虫细胞系。通过显微观察、细胞活力分析、核型分析和分子鉴定,获得4个新建细胞系的生物学特性数据。使用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组分泌型碱性磷酸酶杆状病毒(AcMNPV-SEAP)。使用有限稀释法测定达摩凤蝶细胞系对AcMNPV-SEAP的半数组织培养感染剂量(TCID₅₀), 比较达摩凤蝶细胞系对AcMNPV-SEAP的敏感性。【结果】建立了4个贴壁生长的达摩凤蝶新孵幼虫细胞系(RIRI-PaDe-1, RIRI-PaDe-2, RIRI-PaDe-3及RIRI-PaDe-4),且均传至60代以上。形态学方面,细胞系RIRI-PaDe-1和RIRI-PaDe-4较为相近,均由圆形、梭形以及多边形细胞组成,细胞系RIRI-PaDe-2主要为圆形细胞,而RIRI-PaDe-3主要为类似表皮细胞和纤维状细胞。细胞增殖动力学方面,4个细胞系的群体倍增时间分别为69.77, 67.42, 81.48及65.43 h。核型分析显示4个细胞系染色体数量均呈正态分布,其中RIRI-PaDe-2, RIRI-PaDe-3以及RIRI-PaDe-4的染色体数目分布区间比较接近,在45~97条之间,RIRI-PaDe-1的染色体条数相比偏少,在36~90条之间。通过比对4个达摩凤蝶细胞系和虫卵的细胞色素c氧化酶亚基I(COI)基因序列,证明4个新建细胞系来源于达摩凤蝶组织。比较4个细胞系对AcMNPV-SEAP敏感性发现RIRI-PaDe-3对此病毒较为敏感,可作为重组杆状病毒表达的宿主。【结论】虽然4个新建达摩凤蝶细胞系的来源相同,具有相同的遗传背景,但其生物学特征仍有明显差异,具有进一步研究的价值。     

EBV转化的人乳头瘤病毒感染者B淋巴母细胞系的建立及应用

建立EB病毒(EBV)转化的B淋巴母细胞系(LCL),应用此细胞系作为抗原递呈细胞筛选抗原特异性的T细胞克隆。收集人乳头瘤病毒(HPV)感染者外周血20份,分离外周血单个核细胞(PBMC),利用Pan T细胞试剂盒去除PBMC中的T细胞,获得non-T淋巴细胞,EBV病毒转化non-T淋巴细胞。应用转化的LCL细胞作为抗原递呈细胞,ELISPOT筛选可能的HPV抗原特异性的T细胞克隆。成功建立18个LCLs,建株成功率为90%。转化成功的LCL细胞体积增大,聚集成团状或簇状。建株失败的两份标本,用于转化的non-T淋巴细胞数少于2×106。应用LCL细胞作为抗原递呈细胞筛选出64个HPV抗原特异性的T细胞克隆。成功建立LCLs,此细胞系细胞可作为体外研究HPV特异性免疫反应的刺激细胞。     

一株棕尾别麻蝇胚胎细胞系的建立及其特性分析

双翅目昆虫细胞系广泛应用于遗传学、发育生物学、分子生物学、人和动物体病原学以及昆虫抗微生物肽的研究。本研究建立了一株新的棕尾别麻蝇Sarcophaga peregrina胚胎细胞系。该细胞系的原代培养始于2008年11月17日, 取材于棕尾别麻蝇晚期胚胎组织, 在Shields & Sang M3昆虫培养基中于28℃恒温培养, 在第26天进行第1次传代, 至今已历时21个月, 传代72次, 生长状态稳定, 被命名为Sp-E-HNU11。该细胞系的细胞形态主要呈梭形和近圆形, 杂以少量巨型细胞, 紧密贴壁生长。细胞群体倍增时间为42 h。染色体数目一般为10条或12条, 为二倍体或亚二倍体细胞系; 除一对颗粒状微型染色体外, 其他染色体呈短杆状。细胞系的β-萘酯酶和谷草转氨酶同工酶谱上分别显示出1条和3条酶带。随机引物扩增多态性 (random amplified polymorphic DNA, RAPD) 分析结果显示, 该细胞系与小菜蛾细胞系Px-E-HNU12、草地贪夜蛾细胞系IPLB-Sf-9和家蚕细胞系Bm-21E-HNU5呈现明显不同的带型特征。 Sp-E-HNU11细胞系的建立为昆虫抗微生物肽及其他相关的研究工作增添了新的研究工具和生产载体。     

拟南芥悬浮细胞系的玻璃化法超低温保存

悬浮培养细胞系是植物生理生化研究的好材料之一。为了保持细胞系的遗传稳定性,需要采用超低温保存技术。玻璃化法是一种不用程序降温仪的超低温保存技术。本文报道了从模式植物拟南芥建立悬浮细胞系并对其进行玻璃化法超低温研究。细胞经过合理的预培养处理和保护剂处理,直接投入液氮贮存。复温后的细胞能恢复生长,恢复生长的细胞保持着植株再生能力。国外,拟南芥悬浮细胞系的程序降温法保存和包埋脱水法保存已经报道,玻璃化法保存尚未见报道。     

基于CRISPR/Cas9系统建立SNX11基因敲除A549细胞系

为了建立SNX11基因稳定敲除A549细胞系,本研究通过构建针对人SNX11基因的特异性打靶慢病毒载体,将该慢病毒感染A549细胞系,使用嘌呤霉素对慢病毒感染阳性的A549细胞进行筛选,利用梯度稀释法获得单细胞并扩增培养,提取细胞基因组DNA,PCR扩增后进行测序验证,同时提取细胞蛋白后利用Western Blot方法进行蛋白敲除验证,最后进行细胞活性检测和脱靶效应评估。最后,本研究获得了一株SNX11基因敲除A549细胞系;通过脱靶效应评估,结果显示最可能的20个脱靶位点均不存在脱靶现象;该基因敲除对细胞增殖活性没有影响。本研究成功构建了一株SNX11基因敲除A549细胞系,为SNX11蛋白的功能研究建立了细胞模型。     

不同组织来源的细胞建立诱导多能干细胞系的研究

目的:比较不同组织来源的细胞生成iPS细胞的效率,获得高效制备iPS细胞的组织类型.方法:通过四种逆转录病毒(OCT4/SOX2/KLF4/c-MYC)转染羊水细胞、绒毛细胞和皮肤成纤维细胞,建立不同组织来源的iPS细胞系.结果:我们建立了羊水、绒毛细胞和皮肤细胞三个不同组织来源的iPS细胞系,并对其多能性基因Oct4、Nanog以及分子表面标记Tra-1.60以及体外分化为三个胚层能力进行鉴定,发现利用羊水细胞建立iPS细胞的效率显著高于绒毛细胞和皮肤细胞.结论:羊水细胞可能是制备iPS细胞的理想细胞类型.     

稳定表达牛催乳素基因的小鼠乳腺上皮细胞系的建立

在乳腺上皮细胞体外培养时,为了使其状态接近泌乳期,需要在培养基中添加催乳素.由于催乳素价格昂贵,使得乳腺上皮细胞的体外培养成本颇高.建立在体外培养过程中不需要添加催乳素蛋白的乳腺上皮细胞系,能为在细胞水平研究乳腺细胞相关基因提供诸多方便.利用慢病毒载体的整合特性,建立稳定整合了牛催乳素cDNA(bPRL)表达盒的小鼠乳腺上皮细胞系(HC11细胞系).经10代次以上的传代以后,通过定量PCR检测,证明平均每个细胞中含有2.6个外源的bPRL基因,其表达量为HC11细胞中管家基因β-肌动蛋白(β-actin)表达量的14%左右.另外,先前的研究结果表明催乳素能在HC11和泌乳期的小鼠乳腺上皮组织中有效促进山羊β-酪蛋白启动子启动外源基因的表达.之后的实验证实整合了催乳素基因的HC11细胞(bPRL-HC11细胞系)也有此功能.因此,bPRL-HC11细胞系可以为体外研究乳腺生物反应器提供良好的细胞模型.     

高转移鼠源性淋巴瘤细胞模型的建立及其生物学特性的研究

该文建立了高转移性小鼠淋巴癌细胞模型,并对其进行了生物学特性研究.LC1和LC2两个细胞系来自同一个小鼠淋巴瘤.通过细胞形态学观察,用常规的细胞生长曲线检测法、染色体核型分析、体外成球实验、侵袭和转移实验及体内成瘤实验检测细胞系的生物学特性及体内外致瘤能力.LC1细胞生长速度低于LC2细胞,LC1细胞的群体倍增时间为(...     

一种可高效转染的青鳉肌肉细胞系的建立与应用

在哺乳动物细胞系中转基因的效率相对较高而在鱼类细胞系中相对较低, 为了获得鱼类高效转基因细胞系, 我们从模式鱼类青鳉(Oryzias latipes)中分离和构建了肌肉细胞系OLM。该细胞系类似于纤维细胞, 在28℃ DMEM和10%的胚胎牛血清中培养了超过88代。通过染色体分析, 它属于两倍体并含有48条染色体。在脂质体介导下, 报告基因的转染效率可以达到40%, 在测试的其他鱼类细胞中转染效率最高。此外还构建了稳定转染转基因或者非编码RNA的细胞系。OLM细胞对常见的病毒SVCV、GCRV、SGIV等不敏感。综上所述, 研究在青鳉中建立了一种能高效转染的肌肉细胞系, 它适用于鱼类瞬时和稳定的转基因研究。     

表达犬CD150的Vero细胞系的建立

目的建立表达CD150基因的非洲绿猴肾细胞系Vero-CD150,提高犬瘟热病毒的分离效率。方法分离健康犬血液中的白细胞,并克隆编码CD150的基因,构建真核表达质粒pIRES-CD150,将该质粒转染Vero细胞系,经过克隆化筛选获得Vero-CD150细胞系。利用RT-PCR、流式细胞仪（FCM）进行鉴定,同时对临床检测为阳性的自然发病犬,取肝、肺、脾脏等脏器为病料,接种于Vero-CD150细胞系。结果RT-PCR和流式细胞仪皆检测到CD150在Vero细胞中能够稳定表达;与Vero细胞系相比,Vero-CD150细胞系的生长特性相似;接种病料后,感染细胞不仅产生明显的细胞病变,且用RT-PCR可检测到病毒核酸。结论本试验使CD150基因能在体外转入正常的非洲绿猴肾细胞系Vero中,获得稳定表达CD150基因的Vero细胞亚克隆,并使后者结合CDV的能力明显增强。该细胞系的建立,为更有效的分离犬瘟热病毒打下了基础,可用于进一步研究。     

利用草鱼CIK细胞和MTT法测定镉和铬毒性试验的优化

本文利用主要养殖鱼类草鱼的肾脏细胞系CIK为靶细胞,从MTT法的细胞接种浓度、MTT 浓度及温育时间等几个重要参数,研究了对CIK细胞应用MTT法进行化合物毒性测定的条件,并根据最适条件,测定了氯化镉(CdCl2) 和重铬酸钾(K2Cr2O6) 对草鱼CIK细胞的毒性,建立了一种利用鱼类细胞系(草鱼CIK细胞) 进行化合物毒性测定的方法。由于每种细胞系各具有不同的生物学特性及对有毒物质不同的敏感性,因此该测定方法的建立,在水产养殖环境毒理的领域中,将具有一定的应用价值。       

一种可高效转染的青鳉肌肉细胞系的建立与应用（英文）

在哺乳动物细胞系中转基因的效率相对较高而在鱼类细胞系中相对较低,为了获得鱼类高效转基因细胞系,我们从模式鱼类青鳉(Oryzias latipes)中分离和构建了肌肉细胞系OLM。该细胞系类似于纤维细胞,在28℃DMEM和10%的胚胎牛血清中培养了超过88代。通过染色体分析,它属于两倍体并含有48条染色体。在脂质体介导下,报告基因的转染效率可以达到40%,在测试的其他鱼类细胞中转染效率最高。此外还构建了稳定转染转基因或者非编码RNA的细胞系。OLM细胞对常见的病毒SVCV、GCRV、SGIV等不敏感。综上所述,研究在青鳉中建立了一种能高效转染的肌肉细胞系,它适用于鱼类瞬时和稳定的转基因研究。     

油桐尺蠖血球细胞系的建立及其对多角体病毒敏感性的测定

建立了稳定生长的油桐尺蠖幼虫血球细胞系,称为WIV-BS-02细胞系,原代培养始于1981年4月,至今已传至第83代,细胞系的群体倍增时间为48～72小时,形状有圆形和梭形两种,具有鳞翅目昆虫的典型染鱼体。比较了6种培养液和3种培养温度对细胞生长的影响,观察了同源油桐尺蠖核型多角体病毒感染后,光学显微镜下的细胞病理变化及电镜下病毒的形态发生,测定了细胞培养物对油桐尺蠖的体外培养细胞和幼虫的感染性。     

人胚胎角膜上皮细胞系的建立和生物学特性

为构建角膜基础研究的稳定载体和操作平台,通过合法渠道获得人胚胎,并对角膜上皮细胞进行了分离培养。经反复传代,初步建立了人胚胎角膜上皮细胞系,并对其生物学特性进行了研究。结果显示,培养细胞具有较典型的上皮细胞特征。细胞生长较快,最快时两天可传代一次。K19和PCNA在各代胚胎角膜细胞均有表达,K19的表达部位位于胞浆,而PCNA的表达部位位于胞核。处于细胞周期中S期的细胞比例大约为11%￣23%。染色体核型分析表明各代细胞染色体的数目和形态相似。因此,人胚胎角膜上皮细胞适合于建立相对稳定的细胞系。培养细胞具有分化上的幼稚性和较强且稳定的增殖能力,细胞生长状态良好,而且该细胞系的遗传特征较为稳定。