II型猪圆环病毒检测试剂盒的研制

猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)属圆环病毒科圆环病毒属成员[1]。PCV分两种血清型,即PCV 1 和 PCV 2,其中 PCV 1 由 Tischer 等[2] 于1974年检测到,对猪没有致病性;PCV 2 可引起部分断奶仔猪和育肥猪的断奶仔猪多系统综合征( postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)[3]。目前,该病呈世界分布,给养猪业造成巨大的经济损失。本研究通过分析已发表的 PCV 2的基因序列,找出 PCV 2 的特异性片段,研制了检测PCV 2的试剂盒。检测临床疑似病料,结果表明该试剂盒使用方便、快速、敏感、特异,符合国内的养殖场…     

猪Ⅱ型圆环病毒四川分离株鉴定及其ORF2基因序列分析

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV),属于圆环病毒科(Circoviridae),圆环病毒属(Circovirus),血清型为PCV-1和PCV-2[1]。PCV-1首先由Tis-cher[2]于1974年从PK-15猪肾传代细胞系中分离获得,PCV-2首先由Clark[3]报道了是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,随即相继报道了PCV-2与PDNSS(猪皮炎与肾炎综合症)、NP(增生性坏死性肿炎)、PRDC(猪呼吸道综合征)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦有重要关联[4,5];它常与猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)或猪细小病毒(PPV)并发感染或继发细菌感染[6]。我国自从2000年郎…     

猪圆环病毒PCR检测方法的优化

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)为无囊膜的单股负链DNA病毒,是目前发现的最小的动物病毒,大小约为17nm[1]。PCV根据抗原性及基因组的不同可以分为PCV1和PCV2两种基因型,PCV1分离自猪肾细胞系PK15,它不致病,能够在PK15中稳定存在而不形成细胞病变;PCV2对猪有致病性,可引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病、猪的繁殖障碍等疾病。近年来已成为严重危害我国养猪业的主要疾病之一。但迄今为止市场上还没有商品化疫苗和特效药物防治该病,并且该病有时呈亚临床感染,所以…     

猪圆环病毒PCR检测方法的优化

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)为无囊膜的单股负链DNA病毒,是目前发现的最小的动物病毒,大小约为17nm[1].PCV根据抗原性及基因组的不同可以分为PCV1和PCV2两种基因型,PCV 1分离自猪肾细胞系PK15,它不致病,能够在PK15中稳定存在而不形成细胞病变;PCV 2对猪有致病性,可引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病、猪的繁殖障碍等疾病.     

猪Ⅱ型圆环病毒四川分离株鉴定及其ORF2基因序列分析

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV),属于圆环病毒科(Circoviridae),圆环病毒属(Circovirus),血清型为PCV-1和PCV-2[1].PCV-1首先由Tischer[2]于1974年从PK-15猪肾传代细胞系中分离获得,PCV-2首先由Clark[3]报道了是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,随即相继报道了PCV-2与PDNSS(猪皮炎与肾炎综合症)、NP(增生性坏死性肿炎)、PRDC(猪呼吸道综合征)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦有重要关联[4,5];它常与猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)或猪细小病毒(PPV)并发感染或继发细菌感染[6].     

Ⅱ型猪圆环病毒检测试剂盒的研制

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属圆环病毒科圆环病毒属成员[1].PCV分两种血清型,即PCV-1和PCV-2,其中PCV-1由Tischer等[2]于1974年检测到,对猪没有致病性;PCV-2可引起部分断奶仔猪和育肥猪的断奶仔猪多系统综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)[3].目前,该病呈世界分布,给养猪业造成巨大的经济损失.本研究通过分析已发表的PCV-2的基因序列,找出PCV-2的特异性片段,研制了检测PCV-2的试剂盒.检测临床疑似病料,结果表明该试剂盒使用方便、快速、敏感、特异,符合国内的养殖场及进出口的需要.     

载体表达的siRNA分子对猪圆环病毒2型复制的抑制作用

[目的]寻找一种基于RNA干扰技术的猪圆环病毒2型感染的防控方法.[方法]根据猪圆环病毒2型毒株基因组核苷酸序列,设计了3条特异性小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)分子,其中2条针对猪圆环病毒1型和2型复制酶基因(rep),1条针对猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因(cap),将合成的DNA片段退火形成双链,分别连接到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen载体鼠源U6启动子下游,转化大肠杆菌得到阳性克隆,测序鉴定后分别命名为Retro-SH1,Retro-SH4,Retro-SH6.用上述质粒转染PCV2感染前、后的Dulac细胞及肌肉注射PCV2感染前、后的BALB/c小鼠,应用实时定量PCR试验评价其对病毒在细胞及小鼠体内复制的抑制作用,免疫组化法检测脾脏中病毒的存在.[结果]感染PCV2前或后转染500 ng Retro-SH1,Retro-SH4,Retro-SH6质粒能有效抑制PCV2在Dulac细胞上的复制,抑制率最高可达99%以上,对10株不同来源的临床分离株在细胞中复制的抑制作用同样明显,且不同毒株间差异不大.动物试验中,肌肉注射10μg上述不同siRNA分子对小鼠体内PCV2的复制有一定的抑制作用,其抑制率在26%至99%之间.[结论]载体表达的siRNA分子可能成为防控猪圆环病毒2型感染的一种新工具.     

安徽省部分地区2016–2018年猪圆环病毒2型遗传进化分析

【背景】猪圆环病毒(Porcinecircovirus,PCV)可以引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)。【目的】了解安徽省部分地区猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异情况。【方法】采用PCR技术,对2016-2018年间安徽省部分地区猪场疑似PMWS感染的组织样品共计31份进行PCV2检测和全基因扩增,并通过DNAStar等生物信息学软件对所得到的PCV2毒株基因序列进行遗传进化分析。【结果】所得的8株PCV2安徽株与GenBank上已发表的国内外参考毒株相比较,核苷酸相似性为92.8%-99.0%,ORF2及其推导的氨基酸序列相似性分别为85.8%-99.6%和82.5%-100%。遗传进化树分析结果显示8株安徽株中有1株PCV2a,2株PCV2b,5株PCV2d,未发现PCV2c、PCV2e和PCV2f基因型。此外,通过对ORF2基因编码的氨基酸序列分析,发现各基因型Cap蛋白氨基酸序列上的位点具有其独特性。【结论】近年来PCV2在安徽地区的猪群中感染较为普遍,其中PCV2d基因型的感染病例增多,逐渐成为安徽地区的优势流行株。本研究为安徽地区的PCV2防控提供了一定的参考依据。     

PCV2病毒样颗粒疫苗的研究进展

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrom,PMWS)的主要病原,对全球养猪业造成极大的经济损失。目前的免疫策略主要基于病毒的衣壳蛋白。研究表明,猪圆环病毒衣壳蛋白具有体外自组装成病毒样颗粒的能力。本文就病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的特点及PCV2疫苗的研究现状做以综述。并探讨了基于VLP的PCV2疫苗的发展前景。     

猪1型圆环病毒全基因组克隆及其感染性初步鉴定

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)是由Tis-cher等[1]于1974年在PK-15细胞中发现,当时认为是一种细胞污染物,后被证实为一种新的病毒。病毒粒子为20面体对称,无囊膜,以滚环方式进行复制,可在PK-15细胞上生长但不引起细胞病变。其基因组是一种环状、单股副链DNA,与鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)、鹦鹉喙羽病毒(psittacine beak and feather disease circovirus,PBF-DAV)和人的TT病毒(transfusion transmittedvirus,TTV)同属圆环病毒科。猪圆环病毒有两种基因型即:PCV1和PCV2。前者广泛存在于猪源肾细胞中,在猪的组织…     

PMWS病猪猪圆环病毒2型全基因组序列分析

根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因序列,设计一对特异性引物,用PCR方法直接从5省病料中分别扩增出5个PCV2毒株的全基因组,分别命名为FujianPCV、GuangxiPCV、HainanPCV、HunanPCV和ShandongPCV。将扩增片段克隆于pMD18一T载体,进行序列测定,结果表明,除FujianPCV株核苷酸长度为1768bp,其余四株均为1767bp。应用DNAstar序列分析软件分析表明,本实验的5个PCV2分离株与世界上其它地区的PCV2分离株密切相关,核苷酸序列同源性达93％-98．8％,与PCVl毒株的序列同源性只有68．4％～70％。其中ORFl和ORF2所编码的氨基酸序列与国内外PCV2毒株比较,同源性也很高,分别为98．1％499．4％和88％99．1％。     

Molecular cloning and characterization of an alkalophilic Bacillus sp. C125 gene homologous to Bacillus subtilis sec Y.

A 1.8 kb HindIII DNA fragment containing the secY gene of alkalophilic Bacillus sp. C125 has been cloned into plasmid pUC119 using the B. subtilis secY gene as a probe. The complete nucleotide sequence of the cloned DNA indicated that it contained one complete ORF and parts of two other ORFs. The similarity of these ORFs to the sequences of the B. subtilis proteins indicated that they were the genes for ribosomal protein L15-SecY-adenylate kinase, in that order. The gene product of the alkalophilic Bacillus sp. C125 secY homologue was composed of 431 amino acids and its M(r) value has been calculated to be 47,100. The distribution of hydrophobic amino acids in the gene product suggested that the protein was a membrane integrated protein with ten transmembrane segments. The total amino acid sequence of alkalophilic Bacillus sp. C125 secY homologue showed 69.7% homology with that of B. subtilis secY. Regions of remarkably high homology (78% identity) were present in transmembrane regions, and cytoplasmic domains (73% identity) with less homologous regions present in extracellular domains (43% identity).     

巨大芽孢杆菌分子伴侣GroES和GroEL新基因的克隆及同源性分析

巨大芽孢杆菌作为革兰氏阳性细菌的一种,是良好的重组蛋白的表达宿主.本研究利用PCR技术从巨大芽孢杆菌基因组克隆出一条1.9Kb的基因片段.核酸序列分析结果表明,该片段全长1984bp,包含2个ORF,分别与芽孢杆菌来源的GroES和GroEL基因有高度的相似性.氨基酸序列比对发现,GroES蛋白与枯草芽孢杆菌来源的GroES蛋白氨基酸序列同源性为91%,GroEL蛋白氨基酸序列同源性为90%.     

马铃薯卷叶病毒中国株（PLRV-Ch）ORF2a基因特征分析

马铃薯卷叶病毒 (ＰＬＲＶ)是正链ＲＮＡ病毒 ,属黄化病毒组[1 ] 严格虫传 ,分布广泛 ,难以控制 ,侵染马铃薯 ,给生产造成巨大损失。ＰＬＲＶ基因全长 6 0ｋｂ ,有 6个读码框架 ,其中ＯＲＦ2ａ是第二读框 ,全长 192 0ｂｐ ,编码一个 70ｋＤ的多肽。另外 ,ＯＲＦ2ａ在与ＯＲＦ2ｂ重叠处可发生移码继续转译 ,直到ＯＲＦ2ｂ的尾 ,转译产物为一条 118ｋＤ的多肽 ,该蛋白的Ｃ端与复制酶的序列具很大的同源性[2～ 4] 。Ｐｒｕｆｅｒ[5] 等和Ｋｕｊａｗａ[6] 等分别研究了ＰＬＲＶ基因组上ＯＲＦ2ａ与ＯＲＦ2ｂ重叠区附近与移码有关的滑动序列及其…     

新疆黄精凝集素基因的克隆、序列分析和表达

用百合科黄精属植物凝集素基因的保守序列为引物,从新疆黄精的叶中克隆出黄精凝集素的全长cDNA。序列分析表明, 克隆获得的新疆黄精凝集素(Polygonatum roseum agglutinin, PRA)基因完整的ORF片段大小为550 bp, 编码1 条长159个氨基酸肽链, 没有内含子, 其中N 端的28个氨基酸是信号肽。对新疆黄精凝集素cDNA 序列同源性的分析比较发现, 黄精属植物凝集素基因之间有很高的同源性(92%)。氨基酸序列比对和SWISS-MODEL同源模建分析表明, PRA由12个b-折叠片组成的b-桶结构, 具有与单子叶植物甘露糖结合凝集素相似的空间结构。重组质粒pGEX-4T-1-PRA 和pMAL-p2x-PRA, 分别转化E. coli BL21进行原核表达, 新疆黄精凝集素能够以可溶性融合蛋白形式表达, 分子量约为14 kD。构建真核表达载体pcDNA3-PRA, 免疫小鼠后获得了抗血清。免疫印迹结果显示为单一的条带, 证明该抗血清具有针对PRA抗原的专一性。新疆黄精凝集素基因的克隆、原核和真核的表达以及抗血清的制备, 为进一步研究凝集素蛋白的性质和功能, 并为植物抗病虫基因工程研究提供有用的实验材料。     

来源于蓝藻、铜绿微囊藻的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的克隆和鉴定

以已知的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的保守区为基础,自行设计一对简并引物,该对引物从形成水华的蓝藻(Synechocystis PCC6803)铜绿微囊藻FACHB 905株(Microcystis aeruginosa FACHB 905)的基因组DNA中扩增到一个476 bp的DNA片段.通过TAIL-PCR和连接介导的PCR两种方法分离该片段的侧翼序列,最后得到大小约2.5 kb的DNA片段.序列分析揭示其中有一个编码462个氨基酸的开放阅读框,我们将此开放阅读框对应的蛋白命名为Mud.该Mud蛋白的氨基酸序列与蓝藻(73%相同,87%相似)和细菌(Bacillus subtilis)(51%相同,67%相似)的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶氨基酸序列表现高度的同源性.将该mud基因克隆于p-GEX-4T-1融合表达载体并在大肠杆菌中表达GST-Mud融合蛋白,经过酶活力测定发现,GST-Mud蛋白具有一定的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶活性.用抗GST-Mud蛋白的多抗对M.aeruginosa FACHB 905的胞质蛋白组分进行Western印迹分析,结果显示一条分子量大小约49 kD的专一条带,这个分子量与从基因推断出的蛋白分子量大小基本一致.综上所述,我们认为从微囊藻克隆到的Mud蛋白基因是尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因,该酶在其他生物如植物和细菌中参与多糖合成,是多糖合成的关键酶之一,而在藻类中对尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶开展研究却是首次报道.     

新疆黄精凝集素基因的克隆、序列分析和表达

用百合科黄精属植物凝集素基因的保守序列为引物,从新疆黄精的叶中克隆出黄精凝集素的全长cDNA。序列分析表明, 克隆获得的新疆黄精凝集素(Polygonatum roseum agglutinin, PRA)基因完整的ORF片段大小为550 bp, 编码1 条长159个氨基酸肽链, 没有内含子, 其中N 端的28个氨基酸是信号肽。对新疆黄精凝集素cDNA 序列同源性的分析比较发现, 黄精属植物凝集素基因之间有很高的同源性(92%)。氨基酸序列比对和SWISS-MODEL同源模建分析表明, PRA由12个b-折叠片组成的b-桶结构, 具有与单子叶植物甘露糖结合凝集素相似的空间结构。重组质粒pGEX-4T-1-PRA 和pMAL-p2x-PRA, 分别转化E. coli BL21进行原核表达, 新疆黄精凝集素能够以可溶性融合蛋白形式表达, 分子量约为14 kD。构建真核表达载体pcDNA3-PRA, 免疫小鼠后获得了抗血清。免疫印迹结果显示为单一的条带, 证明该抗血清具有针对PRA抗原的专一性。新疆黄精凝集素基因的克隆、原核和真核的表达以及抗血清的制备, 为进一步研究凝集素蛋白的性质和功能, 并为植物抗病虫基因工程研究提供有用的实验材料。     

传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因克隆及在E.coli中的表达

核衣壳蛋白基因 (N基因 )是传染性支气管炎病毒的重要结构基因 .根据已报道的序列设计引物 ,利用RT PCR技术从病毒RNA中扩增和克隆到了N基因的cDNA ,并测定了核苷酸序列 .克隆的N基因片段ORF全长 12 30bp ,编码 4 0 9个氨基酸 .将该片段序列与其他IBV病毒株比较 ,核苷酸的同一性为 87 0 %～ 98 6 %,氨基酸的同一性为 91 0 %～ 98 1%.将该cDNA亚克隆到pBV2 2 0表达载体 ,转化大肠杆菌DH5α菌株 ,Western印迹检测 ,获得了分子量约 4 5kD表达蛋白     

巨大芽孢杆菌分子伴侣GroES和GroEL新基因的克隆及同源性分析

巨大芽孢杆菌作为革兰氏阳性细菌的一种,是良好的重组蛋白的表达宿主.本研究利用PCR技术从巨大芽孢杆菌基因组克隆出一条1.9 Kb的基因片段.核酸序列分析结果表明,该片段全长1 984 bp,包含2个ORF,分别与芽孢杆菌来源的GroES和GroEL基因有高度的相似性.氨基酸序列比对发现,GroES蛋白与枯草芽孢杆菌来源的GroES蛋白氨基酸序列同源性为91%,GroEL蛋白氨基酸序列同源性为90%.     

Cloning and characterization of a Bacillus subtilis gene encoding a homolog of the 54-kilodalton subunit of mammalian signal recognition particle and Escherichia coli Ffh.

By using a DNA fragment of Escherichia coli ffh as a probe, the Bacillus subtilis ffh gene was cloned. The complete nucleotide sequence of the cloned DNA revealed that it contained three open reading frames (ORFs). Their order in the region, given by the gene product, was suggested to be ORF1-Ffh-S16, according to their similarity to the gene products of E. coli, although ORF1 exhibited no significant identity with any other known proteins. The orf1 and ffh genes are organized into an operon. Genetic mapping of the ffh locus showed that the B. subtilis ffh gene is located near the pyr locus on the chromosome. The gene product of B. subtilis ffh shared 53.9 and 32.6% amino acid identity with E. coli Ffh and the canine 54-kDa subunit of signal recognition particle, respectively. Although there was low amino acid identity with the 54-kDa subunit of mammalian signal recognition particle, three GTP-binding motifs in the NH2-terminal half and amphipathic helical cores in the COOH-terminus were conserved. The depletion of ffh in B. subtilis led to growth arrest and drastic morphological changes. Furthermore, the translocation of beta-lactamase and alpha-amylase under the depleted condition was also defective.