cDNA微阵列技术研究NaHCO3胁迫下星星草基因表达谱

为研究NaHCO3胁迫下星星草基因的表达,分别将荧光染料Cy5-dCTP和Cy3-dCTP用反转录方法标记在处理和对照星星草cDNA上制成探针,并与载有星星草基因的cDNA芯片进行杂交。通过对芯片的杂交信号强度分析来研究基因的表达情况。分析结果显示,共有25个基因在NaHCO3胁迫处理前后差异表达,其中17个基因在NaHCO3胁迫下表达下调,8个基因在NaHCO3胁迫下表达上调。生物信息学分析表明这些基因的功能涉及了信号传导与转录调控、细胞防御、细胞代谢等多个方面。从而获得了NaHCO3胁迫下星星草的基因表达谱,定量地阐述了NaHCO3胁迫和非胁迫条件下星星草基因的差异表达情况。     

岸蟹（Carcinus maenas）金属硫蛋白cDNA及其基因的克隆

利用已知的Ｃ．ｍａｅｎａｓ金属硫蛋白氨基酸序列资料,用全简并的ＰＣＲ引物,从鳃组织总ＲＮＡ中扩增出两种金属硫蛋白ｃＤＮＡ片断,并将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体中,序列测定表明,其中一种ｃＤＮＡ片断核苷酸序列和推知的Ｃ．ｍａｅｎａｓ金属硫蛋白核苷酸序列完全吻合;另一种ｃＤＮＡ片断则在３’端有较大变异。根据前者ｃＤＮＡ片段序列设计特异性引物,扩增并克隆了其编码区全长ｃＤＮＡ和其编码基因,测序结果表明,岸蟹     

小鼠金属硫蛋白ⅠcDNA编码序列的克隆及其在昆虫细胞中的表达

将质粒ＰＢＸ－ＭＴ上的小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ片段切下作为模板,通过ＰＣＲ方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒ＰＢＳ－ＳＫ中,经ＤＮＡ序列测定后证明其克隆序列正确,再将ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ编码序列插入到转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点之间,通过磷酸钙／ＤＮＡ共转染方法将其导入昆虫细胞Ｓｆ９中,以Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＤｏｔＥＩＡ方法对表达产物进行了检测,表达量为１ｍｇ＝     

差异显示技术研究NaHCO3 胁迫下星星草基因表达

用差异显示技术研究NaHCO3胁迫下星星草(Puccinellia tenuiflora)基因的表达。经Reverse Northern检测, 获得了7个差异表达的基因片段。其中, 6个为胁迫后诱导表达, 1个为胁迫后抑制表达。序列同源性分析表明, 胁迫诱导表达的6个基因片段中, 1个与钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)基因同源性较高,其余5个可能为新序列, 胁迫后抑制表达的基因片段与假定的adaptor蛋白基因同源性较高。本研究为进一步研究星星草的抗盐机理奠定了基础。     

差异显示技术研究NaHCO3胁迫下星星草基因表达

用差异显示技术研究NaHCO3胁迫下星星草(Puccinellia tenuiflora)基因的表达.经Reverse Northern检测,获得了7个差异表达的基因片段.其中,6个为胁迫后诱导表达,1个为胁迫后抑制表达.序列同源性分析表明,胁迫诱导表达的6个基因片段中,1个与钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)基因同源性较高,其余5个可能为新序列,胁迫后抑制表达的基因片段与假定的adaptor蛋白基因同源性较高.本研究为进一步研究星星草的抗盐机理奠定了基础.     

羊驼皮肤cDNA文库构建及鉴定

采用原核表达载体pet-32-a 构建了羊驼皮肤组织cDNA文库。双链cDNA采用Universal Ribo Clonec DNA Synthesis System合成,并经过琼脂糖分级胶回收,去除了小于400 bp的片断;通过酶切载体的去磷酸化和插入片断的磷酸化,提高了重组率,蓝白斑筛选结果全部为阳性;库扩增后检测容量达2.25×107。随机挑取阳性克隆进行单引物测序分析,七个测序样品中获得两个与毛发生长相关的EST(expression sequence tag),分别为S100钙离子结合蛋白A3基因(S100 calcium binding protein A3,S100A3)的部分序列和高硫角蛋白关联蛋白基因(high sulfur keratin-associated protein,KRTAP3-3)的部分序列,说明所构建的文库具有较高的代表性。     

斑节对虾金属硫蛋白基因cDNA克隆与表达分析

采用RACE-PCR方法从斑节对虾(Penaeus monodon)总RNA反转录产物中获得了502 bp的金属硫蛋白(Pm-MT)基因cDNA序列。该序列包含69 bp 的5非编码区(UTR)和256 bp 的3非编码区(UTR)以及177 bp的开放阅读框(ORF), 可编码58个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸含量丰富, 不含芳香族氨基酸, 存在有无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列CKCXXXCXCX, 预测的分子量约为6.05 kD, 理论等电点7.75。序列比对分析表明Pm-MT与北美淡水蟹(Pacifastacus leniusculus)的相似性高达91.4%, 与美国龙虾(Homarus americanus)的同源性最高为84.5%。实时定量PCR显示在所检测组织中, Pm-MT的mRNA在卵巢的表达量最高, 其次为胃、肠、心脏、脑和肝胰腺; Pm-MT的mRNA在斑节对虾6个不同发育期的卵巢中的表达量都很高, 其中在Ⅱ期卵巢中的表达量最高。实验所得结果以期为Pm-MT进一步在卵巢发育的功能研究提供基础材料。       

盐碱地星星草根cDNA文库的构建及初步分析

以盐碱地原位取材的星星草根为材料,利用SMART技术构建了cDNA文库。扩增后文库的滴度为1.747×109CFU/mL,插入片段分布在0.5-2 kb之间,重组率为92%。文库ESTs序列的初步分析表明,从盐碱地星星草根的cDNA文库中筛选到耐盐相关基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶2基因和钙牵蛋白基因的EST片段。该文库可用于进一步从中筛选星星草耐盐基因。盐碱地星星草根cDNA文库的构建为揭示星星草耐盐分子机制、挖掘星星草耐盐基因、培养耐盐植物奠定了重要基础。     

差异显示技术研究NaHCO_3胁迫下星星草基因表达

用差异显示技术研究NaHCO3胁迫下星星草(Puccinelliatenuiflora)基因的表达。经ReverseNorth-ern检测,获得了7个差异表达的基因片段。其中,6个为胁迫后诱导表达,1个为胁迫后抑制表达。序列同源性分析表明,胁迫诱导表达的6个基因片段中,1个与钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)基因同源性较高,其余5个可能为新序列,胁迫后抑制表达的基因片段与假定的adaptor蛋白基因同源性较高。本研究为进一步研究星星草的抗盐机理奠定了基础。     

cDNA微阵列技术研究干旱胁迫下星星草基因的表达

运用cDNA微阵列技术研究干旱胁迫下星星草基因的表达。制备了载有660条星星草单一基因的cDNA微阵列。分别对干旱胁迫和对照星星草的mRNA进行荧光标记,并与载有星星草基因的cDNA微阵列进行杂交,通过芯片的杂交信号强度分析,共获得22个下调表达和17个上调表达的基因。BLASTX分析表明这些基因按功能可以分为脱水保护、信号转导与调控、活性氧清除、代谢、核糖体蛋白等几大类。发现了一些与干旱胁迫相关的功能未知基因和新基因。     

星星草铁蛋白基因PtFer的克隆及表达分析

目的:从星星草中克隆一个铁蛋白相关基因,分析其序列特征及基因表达模式。方法与结果:构建星星草RACE cDNA文库,根据GenBank中报道的铁蛋白基因EST序列设计引物,利用RACE方法克隆得到星星草铁蛋白基因PtFer的全长cDNA序列(GenBank登录号为HM125047);序列分析表明,PtFer的核苷酸序列长度为751 bp,开放读框为336 bp,编码111个氨基酸残基,预测蛋白质相对分子质量为12.8×103。其蛋白质序列具有铁蛋白的特征性保守区域,与水稻属同一进化分支,与其他禾本科植物铁蛋白的序列相似性达80%以上。Northern杂交分析表明,PtFer的表达量随Na2CO3的浓度和时间的增加而升高,并在12～24 h内持续保持较高的表达水平。结论:用分子生物学及生物信息学技术克隆并分析了星星草铁蛋白基因PtFer的全长cDNA序列及编码蛋白的结构,并初步探索了盐碱胁迫下其表达模式,为研究植物耐盐碱机理奠定了基础。     

Difference Between Salt(NaCl)and Alkaline(Na2CO3)Stresses on Puccinellia tenuiflora(Griseb. )Scribn. et Merr. Plants

Eight-week-old plants of Puccinellia tenuiflora (Griseb.) Scribn. et Merr. growing in pots filled with vermiculite were stressed by treating with 12.5–800 mmol/L solutions of neutral satt(NaC1) or basic salt(Na2CO3). Strain indexes such as relative growth rate etc. were determined. There was a significant difference between the two kinds of stresses. Maximum stress value that P. tenuiflora plants can tolerate is 60 mmol/L for the neutral salt and 200 mmol/L for the basic salt Na2CO3. Under NaCl-stress, great amount of proline accumulated, and citric acid content gradually decreased. But under Na2CO3-stress, proline content did not raise too much and citric acid content obviously increased with the increasing stress value. Under both stress conditions, Na+ content increased and K+ content decreased with the increasing stress value, but the effect of NaCl-stress on K+ content in roots and shoots was much less than that of Na2CO3-stress. In both stresses, the elevation of electrolyte leakage rate of leaf orchestrated with the change of stress value. This finding represented the only similarity among the strain indexes determined in both stresses.     

Na2CO3胁迫对星星草叶肉细胞超微结构的影响

利用透射电镜技术对Na2CO3胁迫下星星草叶肉细胞超微结构进行了观察。结果表明：未胁迫的叶肉细胞排列疏松,各种细胞器结构完整,叶绿体含少量淀粉粒和脂质球。轻度盐胁迫（2g/L,4g／LNa2CO3）对叶肉细胞超微结构影响较小。中度盐胁迫（6g／L,8g／L Na2CO3）引起叶肉细胞超微结构的变化,叶绿体类囊体肿胀,基粒紊乱,不含淀粉粒,脂质球数量增加,叶绿体由原来的梭形或椭球形变成圆球状;部分线粒体嵴消失,出现晶体结构;中央大液泡破裂;核逐渐降解。高度盐胁迫（10g／L,12g／LNa2CO3）下,叶绿体片层结构消失,脂质球数量增加,体积变大,被大量的膜片层所包围,叶绿体内、外膜消失,叶肉细胞中看不到叶绿体的存在;膜片层包围线粒体;叶肉细胞中可见大量的泡状结构和膜片层,叶肉细胞死亡。上述结果表明,细胞器特别是叶绿体膜结构的破坏与盐胁迫叶肉细胞最终死亡密切相关。     

星星草耐盐碱生理机制再探讨

用不同浓度Na2CO3处理星星草幼苗,7d后测定叶片相对电导率、渗透势、光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）、蒸腾强度（Tr）、水分利用效率（WUE）等生理指标,以研究星星草抗盐碱的生理机制。结果表明,低浓度Na2CO3胁迫下,星星草幼苗可通过渗透调节来减轻细胞所受的伤害,因而膜透性受影响较小,相对电导率上升较少,而Gs基本保持不变,Pn、Tr还有所促进,WUE有所增加,这些结果说明,星星草幼苗对低浓度碱性盐具有一定抗性;但犀星草幼苗的这种抗性有一定限度,随着Na2CO3胁迫浓度的增加,Gs、Tr、Pn依次受到抑制,最终膜透性急剧增加,说明星星草幼苗已受损严重,这些变化具有较强的顺序性。     

松嫩草原碱茅(Puccinellia tenuiflora)热值和能量动态的研究

碱茅植株热值的季节变化出现3个峰值,并依次降低,最大值在5月初。茎、叶、穗和立枯体热值的季节变化不规则,茎和叶最大值均在5月初,最小值茎在7月初,叶在6月初;穗最大值在7月中旬,最小值在6月初;立枯体最大值在8月初,最小值在7月中旬。在整个生长季表现为穗热值＞叶＞茎＞立枯体。碱茅种群地上部能量现存量的季节变化,呈单峰曲线,峰值出现在9月初,为6967.75kJ/m^2。不同季节能量在各器官中的分配比率为,5月份为叶＞茎;6月份为茎＞叶;7月初至中旬为茎＞叶＞穗＞立枯体;8月初至9月初为茎＞叶＞立枯体＞穗;9月中旬为立枯体＞叶＞茎＞穗。能量现存量垂直结构,地上部为从地表至20cm高度逐渐增加,最大值在10－20cm层占地上部能量现存量的36.13%,然后逐渐下降,地下部的变化规律为随着浓度增加能值逐渐减小,最大值在0－10cm层占地下部能量现存量的69.01%。     

星星草营养器官适应盐胁迫的结构特征

采用0．6％Na2CO3胁迫处理星星草[Puccinellia tenuiflora（Turcz．）Scribn．et Merr．]幼苗,光镜和电镜观察其根和叶的显微和超微结构。结果表明,星星草根的表皮向外突出形成密集的根毛;外皮层由1～2层细胞组成,排列较紧密;中皮层薄壁细胞排列疏松,形成发达的通气组织;内皮层呈典型的五面加厚;中柱鞘排列紧密,其壁加厚;初生木质部与初生韧皮部相间排列,初生木质部为5～7原型,中央为后生木质部导管,无髓存在。叶的表皮有表皮毛和丰富的蜡质层;叶上表皮泡状细胞数目较少,且深陷;气孔下陷,其下有较大的气室;叶脉有大、中、小3种维管束,大、中型维管束为C3型,小型维管束为C4型。星星草可能是介于C3和C4植物之间的类型,具有耐盐碱及耐干旱特征。