AMP激活的蛋白激酶α2亚基在大肠杆菌中的克隆及表达

目的:AMP激活的蛋白激酶(AMPK)在脑内作为多功能能量感受器发挥作用,主要协调代谢和能量的需要。脑神经元中AMPKα2亚基的含量明显高于α1亚基,本研究选择α2亚基作为对象,研究其在大肠杆菌中的表达情况,为以蛋白原核表达为前提的研究技术的应用提供实验依据。方法:大鼠AMPKα2蛋白编码区片段通过PCR方法从重组pcDNA3质粒中扩增后,克隆至带有λcI基因的pBT载体,构建融合表达载体pBT-AMPKα2。通过核苷酸序列测定证实结果正确后,转化pBT-AMPKα2入大肠杆菌XL-1 Blue MR菌株,IPTG诱导目的蛋白表达。结果:Western blotting显示AMPKα2-λcI融合蛋白表达,分子量约为89ku,与预期相符合。结果还表明AMPKα2-λcI融合蛋白以可溶性蛋白和不溶性包涵体两种形式存在,前者不稳定易发生降解,生成AMPKα2和λcI蛋白,分子量分别是62ku和27ku;后者稳定不发生降解。结论:AMPKα2亚基能以AMPKα2-λcI融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达,这为今后以pBT-AMPKα2融合表达载体为工具利用大肠杆菌双杂交系统筛选AMPKα2的相互作用蛋白奠定基础。     

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK^- gE^- LacZ⁺ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK^- gE^- gI^- ORF1-ORF2⁺ ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK^- gE^- LacZ⁺ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。     

HSV-2LAT ORF1在Vero细胞中的表达特性及其对细胞活性的影响

目的:研究单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)潜伏相关转录体(LAT)开放读码框1(ORF1)的表达特点及其对Vero细胞活性的影响.方法:双酶切和测序验证本实验室构建的HSV-2 LAT ORF1真核表达载体pEGFP-ORF1,并以转染试剂盒Xfect介导其转染至Vero细胞,通过RT-PCR和绿色荧光蛋白检验其在细胞中的表达,用MTT法进行细胞活性分析.结果:重组质粒表达的融合蛋白主要集中细胞核,而空质粒表达的绿色荧光蛋白在细胞核和细胞质中分布均匀;重组质粒对Vero细胞没有损伤作用.结论:HSV-2 LAT ORF1影响了绿色荧光蛋白的分布,可降低空质粒对细胞的损伤作用;其作用位点可能主要定位在细胞核中,为阐明HSV-2 LAT ORF1在潜伏复发中的功能奠定了实验基础.     

猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑患断奶仔猪多系统消耗综合症(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF2全基因(702bp).将此片段克隆入pGEM-T easy载体,筛选获得重组质粒pTORF2,并对此质粒中的插入序列进行了测序分析,结果表明本试验克隆的ORF2与美国PCV-2分离株AF264039的核苷酸及氨基酸序列同源性均达到100%,与其他PCV-2毒株同源性分别为92.3%～98 6%和92.3%～96.6%.重组质粒pTORF2经BamH I、EcoR V双酶切,回收ORF2基因,转移入真核表达载体pSec-Tag2/HygroB的相应酶切位点之间,构建成重组质粒pSecTagORF2.此重组表达载体的构建成功为进一步研究ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SD2株ORF5/ORF6双基因真核表达载体在哺乳动物细胞中的表达

为了实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF5和ORF6基因在同一质粒中分别表达各自编码的蛋白,发挥E蛋白的病毒中和优势和M蛋白的细胞免疫优势,将构建成功的pIRES-ORF5/ORF6转移载体用脂质体法转入稳定表达的细胞CHO,经G418加压筛选获得具稳定表达的细胞株。以RT-PCR、SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。结果表明:RT-PCR检测到两种目的基因的转录;SDS-PAGE和West-ern blot检测到同时表达的两种目的蛋白;间接免疫荧光检测到目的蛋白得到表达。     

金黄色葡萄球菌前噬菌体PT1028ORF001基因的生物信息学分析及原核表达

[目的]对金黄色葡萄球菌前噬菌体的PT1028ORF001基因进行生物信息学分析,并进行原核表达,为金黄色葡萄球菌前噬菌体基因的功能研究提供参考数据。[方法]将金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌株功能未知的基因通过BLAST比对,从中发现了一个噬菌体PT1028的基因序列,将该基因命名为PT1028ORF001。使用Protparam、Prot Comp9. 0、NCBI保守结构域数据库、TMpred、Net Phos 3. 1 Server、PSIPRED、SWISS-MODEL等在线生物信息软件,分析PT1028ORF001蛋白的理化性质、亚细胞定位、保守结构域、跨膜区域、磷酸化修饰位点、二级结构和三维结构。用自行设计的引物扩增PT1028ORF001基因,扩增产物经酶切回收后与原核表达载体p ET-32a相连接,构建重组表达质粒,将该重组质粒转化E. coli TG1内,经菌落PCR鉴定后,增菌培养并提取质粒,再转化E. coli BL21 (DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测分析。[结果]PT1028ORF001蛋白由569个氨基酸组成,相对分子质量为64 671. 34 Da,等电点为8. 07,负电荷氨基酸残基总数为71个,正电荷氨基酸总数为73个,分子式:C2894H4530N762O885S16,原子总数9087个,是一种稳定的亲水蛋白质,定位于细胞膜上,与功能未知的DUF927蛋白超家族具有高度同源性,第202-223、240-258位氨基酸分别形成一个典型的跨膜区,潜在的磷酸化修饰位点共71个,二级结构中ɑ螺旋占比最高(40. 60%),其次是无规则卷曲(39. 89%),三维空间结构与二级结构预测结果相符。成功构建了表达载体p ET-32a(+)-PT1028ORF001,经IPTG诱导后重组蛋白获得了表达,蛋白相对分子质量为82. 4 k Da。[结论]PT1028ORF001基因的生物信息学分析结果以及该基因的成功克隆与表达,为深入研究该蛋白及其他金黄色葡萄球菌前噬菌体基因的功能奠定了一定基础。     

对虾白斑综合征病毒ORF220基因在昆虫细胞内的表达及其分布

对虾白斑综合征病毒厦门分离株ORF220编码真核生物GP130受体同源蛋白.将ORF220和绿色荧光蛋白编码基因融合在一起克隆到昆虫杆状病毒表达载体pFastBacI,然后与AcBacmid共同转染DH10B细胞.用PCR鉴定含有ORF220和EGFP基因的重组质粒,提取纯化重组质粒并转染昆虫细胞进行表达.结果发现,DNA转染后3-5d可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光,表明融合蛋白在昆虫系统内成功表达.用病毒上清液感染昆虫细胞进行时相观察,结果表明,ORF220蛋白在昆虫细胞的细胞质和细胞核内呈随机分布,没有特异的细胞定位.     

GST pull-down结合质谱筛选猪圆环病毒2型ORF4潜在互作蛋白

猪圆环病毒2型编码的ORF4蛋白是近年来发现的新蛋白。迄今为止,人们对ORF4所参与的细胞生物学过程知之甚少。本研究首先构建了带双标签的真核表达载体pCMV-N-Flag-GST,再将ORF4基因插入该载体中,形成pCMV-N-Flag-GST-ORF4。将质粒转染293T细胞表达ORF4后,通过GSTPull-down试验捕获细胞内潜在与ORF4互作的蛋白库。经SDS-PAGE分离及银染后,对所得的特异性条带进行质谱鉴定,筛选出5个与ORF4潜在互作的蛋白,包括丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶6催化亚基、α心肌蛋白、β肌动蛋白、SEC-14样蛋白5和肌球蛋白myosin 9。上述研究结果为深入揭示ORF4在病毒感染细胞过程中发挥的作用提供新的思路与方向。     

鼠伤寒沙门菌spvBC基因编辑株的构建

利用λRed重组系统和pBAD原核表达载体构建鼠伤寒沙门菌spvBC质粒毒力基因修饰菌株,为深入探究沙门菌毒力基因spv的功能和致病机制及宿主抗感染免疫提供工具菌。以pKD4为模板,PCR扩增含spvBC同源臂的卡那霉素抗性基因以构建同源打靶片段,再将其电转入含有质粒pKD46的鼠伤寒沙门菌中进行同源重组,随后将质粒pCP20电转导入阳性转化子,消除卡那霉素抗性基因,PCR鉴定敲除株的构建。PCR扩增含酶切位点的spvBC基因片段,扩增产物与原核表达载体pBAD/gⅢ分别双酶切后连接构建pBAD-spvBC重组质粒,PCR筛选阳性菌落并测序鉴定。将构建成功的pBAD-spvBC重组质粒电转导入spvBC敲除株中,Western blot测定不同浓度L-阿拉伯糖诱导SpvB和SpvC蛋白表达情况。PCR结果表明鼠伤寒沙门菌spvBC基因敲除成功;PCR及测序结果表明pBAD-spvBC重组质粒构建成功,Western blot结果表明13 mmol/L L-阿拉伯糖可诱导SpvB和SpvC蛋白正常表达。λRed重组系统可用于沙门菌质粒上大片段基因的敲除,pBAD原核表达载体可用于沙门菌质粒上大片段基因的回补,丰富了细菌质粒的基因修饰和编辑策略。     

对虾白斑综合征病毒ORF220基因在昆虫细胞内的表达及其分布

对虾白斑综合征病毒厦门分离株ORF220编码真核生物GP130受体同源蛋白。将ORF220和绿色荧光蛋白编码基因融合在一起克隆到昆虫杆状病毒表达载体pFastBacI,然后与AcBacmid共同转染DH10B细胞。用PCR鉴定含有ORF220和EGFP基因的重组质粒,提取纯化重组质粒并转染昆虫细胞进行表达。结果发现,DNA转染后3-5d可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光,表明融合蛋白在昆虫系统内成功表达。用病毒上清液感染昆虫细胞进行时相观察,结果表明,ORF220蛋白在昆虫细胞的细胞质和细胞核内呈随机分布,没有特异的细胞定位。     

香蕉条斑病毒云南河口分离物开放阅读框Ⅱ的原核表达、融合蛋白纯化及抗血清制备

以课题组保存的连接在pMD-18T载体上的香蕉条斑病毒河口分离物全基因组为模板,设计一对特异引物,经过PCR扩增,切胶回收,并通过与pET32(b)载体共同双酶切及T4连接酶连接,得到重组载体pET32-ORF2。将获得的重组质粒pET32-ORF2转化表达菌株E.coli BL21(DE3)感受态细胞,得到表达BSV的ORFⅡ的工程菌。经0.1mmol/L的IPTG诱导表达,超声波破碎后,获得的融合蛋白大多为包含体,但仍有少部分为可溶性蛋白可以进行后续的纯化步骤。将上述可溶性融合蛋白通过Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,获得纯度较高的融合蛋白。以纯化蛋白作为抗原免疫家兔,得到特异性抗血清。间接ELISA以及western blotting表明,所得抗血清效价和特异性都较高,可以用于检测。为BSV的快速检测以及一些相关后续理论研究工作奠定了一定基础。     

TT病毒ORF2在Cos7细胞中的表达及蛋白质定位

应用PCR方法从含有TTVirus ORF2的质粒pET-His-TTV2中扩增出606bp的蛋白质编码区,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1中以表达成GFP-VP2融合蛋白.构建出的重组质粒pEGFPTTV2经过酶切分析和PCR鉴定.用脂质体介导法将pEGFPTTV2质粒DNA转染Cos7细胞,通过RT-PCR分析,证实细胞中存在ORF2基因的转录产物.用共聚焦显微镜结合PI染色技术研究TTV VP2蛋白在细胞中的分布情况.结果表明,TTV VP2分布在细胞质中和细胞核膜内侧.因此推测VP2作为一种非结构蛋白,功能可能是参与病毒DNA的复制或转录.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性测定

应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离株S1毒株的GP5基因序列,然后通过KpnI和XhoI酶切位点把该基因克隆入经过同样双酶切的穿梭载体pShuttle-CMV中。重组穿梭载体经过酶切和PCR鉴定后进行测序,证明所克隆入的基因以正确的阅读框插入。获得的重组穿梭载体经线性化后与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183菌株。纯化的重组腺病毒质粒经酶切线性化后转染293细胞获得重组腺病毒。重组腺病毒经纯化后进行RT-PCR和间接免疫荧光鉴定,证明了用PRRSVGP5蛋白基因所构建的重组腺病毒成功的表达了GP5蛋白。猪体免疫试验后收集血清进行中和实验证明所构建的重组腺病毒在猪体内能够诱导产生中和抗体,因此我们所构建的重组腺病毒可以作为PRRSV基因工程疫苗研究候选病毒株。     

甜菜夜蛾核多角体病毒(SeMNPV)ORF100和ORF101基因的克隆、表达与纯化

目的构建甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)ORF100(Se100)和ORF101(Se101)基因的原核表达载体,表达并纯化两种蛋白.方法用PCR方法扩增Se100和Se101基因,分别将它们克隆至原核表达载体pQE-30上,转化宿主菌M15[pREP-4],用IPTC进行诱导表达,表达产物用Ni-NTA金属螯合层析法进行纯化,SDS-PAGE检测表达的目的蛋白.结果构建了分别含有Se100和Se101基因的原核表达质粒pQE100和pQE101;SDS-PAGE检测显示,表达的两个融合蛋白的分子量分别为15kDa和31kDa,比预期分子量稍大;Ni-NTA亲和层析结果显示6×His-Se100和6×His-Se101融合蛋白主要存在于pH值为4.5的缓冲液中.结论成功克隆并高效表达了Se100和Se101两个基因,有效纯化了两种蛋白,为深入进行基因的功能研究奠定了基础.     

FMDV全ORF编码基因的克隆及其腺病毒载体的构建

为研制O型口蹄疫病毒(FMDV)复制缺陷型腺病毒活载体疫苗毒株,通过RT-PCR方法获得了O型FMDV的开放阅读框(ORF)基因,并定向克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建了重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMVORF,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆得到的ORF编码基因序列与原始强毒株O型FMDV的ORF编码基因相似性达99.8%。将含有目的基因的穿梭质粒线性化后和腺病毒骨架载体pAdeasy-2共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细胞中,得到重组腺病毒质粒pAd-ORF,经PCR和酶切鉴定正确。本研究成功获得了含有现代O型疫苗用FMDV毒株的全ORF编码基因的阳性克隆,并成功构建了含有完整编码基因表达盒的重组腺病毒穿梭质粒及其腺病毒骨架质粒。     

大肠杆菌中核糖体蛋白质S12依赖链霉素突变抑制λN基因的表达

将质粒pKC101上λcI基因切除,建成新质粒pHD109。用F'cI857控制质粒pHD109上λN基因的表达。结果表明：（1）核糖体蛋白质S12依赖链霉素突变抑制λN基因的表达;（2）F’cI857对质粒pHD109上λN基因表达的调节,受温度的控制。     

水痘-带状疱疹病毒ORF43蛋白的单克隆抗体制备及初步研究

水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)是引起水痘和带状疱疹这两种临床表现不同病症的共同致病原,其基因组中ORF43是VZV在宿主细胞中复制的必需基因,但目前尚无针对VZV ORF43编码蛋白性质与功能的研究报道.本研究目的 是制备抗VZV ORF43单克隆抗体,以初步研究该蛋白在细胞内的表达与分布情况.本研究构建了VZV ORF43蛋白的原核表达质粒并在大肠杆菌中进行了该蛋白的表达,纯化蛋白免疫小鼠后,使用杂交瘤技术及克隆化筛选,获得一株特异性强、反应性好的抗VZV ORF43单克隆抗体2D3.本研究使用该抗体鉴定出VZV ORF43蛋白在质粒转染细胞与病毒感染细胞中表达的分子量大小均约为70kD,但分别呈现出细胞质和细胞核的不同亚细胞定位.以上工作为后续进一步探究该蛋白在VZV感染与致病过程中的作用奠定了基础.     

含抑制素重组质粒的减毒猪霍乱沙门氏菌C500遗传稳定性研究

为了分析研究含抑制素重组质粒pVAX-IS-asd(以下简写为pXAIS)的crp(cAMP受体蛋白)和asd(天冬氨酸β-半乳搪脱氢酶)基因双缺失猪霍乱沙门氏菌C500菌株的遗传稳定性.方法:将现有的无抗性抑制素重组表达质粒pXAIS转化入crp和asd基因双缺失猪霍乱沙门氏菌C500菌株(简称"空质粒株")中,得"含质粒株".将"含质粒株"细菌在无选择压力条件下传代培养50代.利用酶切鉴定方法,分析"含质粒株"细菌中抑制素pXA/S质粒的稳定性;利用PCR方法扩增菌株("含质粒株"和"空质粒株")保守序列中invA基因,分析各代细菌的invA基因稳定性;通过比较传代培养后各代细菌的生长图型,分析"含质粒株"细菌传代后的生长规律.结果表明,"含质粒株"细菌连续传代50次后,仍能检出pXAIS质粒和invA基因,而且生长规律与"空质粒株"没有明显差异.说明含pXAIS质粒的猪霍乱沙门氏菌crp和asd基因双缺失株具有良好的遗传稳定性.     

斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的克隆、表达与启动子活性分析

【目的】研究斜纹夜蛾核型多角体病毒II ORF146基因的结构与功能。【方法】根据SpltMNPV IIORF146基因序列设计引物,经PCR扩增克隆ORF146基因。在生物信息学分析基础上进行启动子活性分析和转录时相分析。构建ORF146片段的原核表达载体,表达并纯化融合蛋白后制备多克隆抗体。【结果】核苷酸序列分析表明,读码框含1383 bp,编码460个氨基酸的蛋白质,推定分子量为50.4 kDa。启动子活性分析和转录时相分析都表明该基因是个早、晚期都表达的基因,在病毒感染8 h和18 h有两个转录峰,24 h以后转录水平略有下降,但趋于稳定。pET-28a-ORF13原核表达的融合蛋白经纯化后制备的多克隆抗体特异性高,效价可达1∶3200以上。【结论】SpltMNPV II ORF146基因是一个早期和晚期都表达的病毒组成型结构蛋白基因。推测ORF146基因可能与SpltMNPV II病毒感染宿主细胞后病毒DNA复制有关。制备的多克隆抗体可用于深入研究该蛋白的生物学特性与功能。     

鲤疱疹病毒II型ORF25B编码蛋白诱饵载体的构建及其互作蛋白的筛选

【目的】鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)感染养殖鲫引起的鲫造血器官坏死病,给鲫养殖业造成了重大的经济损失。揭示CyHV-2感染宿主细胞的机制,是建立鲫造血器官坏死病有效防治技术的重要基础。【方法】本研究针对CyHV-2富含抗原表位的ORF25B区域设计引物,扩增ORF25B基因截短序列。将扩增产物克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建诱饵载体pGBKT7-tORF25B,转化至酵母菌株Y2HGold中。在营养缺陷型培养基上,验证诱饵表达载体pGBKT7-tORF25B对酵母菌Y2HGold自激活现象和毒性作用。利用酵母双杂交技术,将诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2HGold与鲫脑组织细胞系(GiCB)cDNA文库杂交。【结果】ORF25B基因截短序列扩增大小约为981 bp,成功构建了诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2H Gold,自激活和毒性验证结果表明,诱饵表达载体对酵母菌株无自激活现象,也无毒性作用,初步筛选出4种与tORF25B基因编码蛋白互作的宿主蛋白。【结论】本研究结果为深入开展CyHV-2 ORF25B编码蛋白功能及病毒入侵宿主细胞的机制研究奠定了重要基础。