通过高表达Igf1/Bcl-2或Bcl-2/Cyclin E基因组合使CHO细胞适于在无蛋白培养基中抗凋亡培

哺乳动物细胞表达系统是生产重组蛋白药物最常用的表达系统。但在无蛋白培养基中,哺乳动物细胞生长活力差,且容易发生细胞凋亡,因而难以大规模培养。为解决此问题,应用双顺反子表达载体在CHO-dhfr-细胞中同时表达Igf-1/Bcl-2或Bcl-2/Cyclin E基因组合,通过Bcl-2使细胞获得抗凋亡能力;通过Igf-1或Cyclin E促进细胞生长分裂,使细胞获得在无蛋白培养基中生长的能力。以上述基因组合转染CHO-dhfr^-细胞,应用Western blot从G418抗性克隆中分别筛选到Bcl-2高表达克隆若干个,对其中表达Bcl-2最高的CHO-IB3和CHO-BC1做进一步Western blot和流式细胞分析,确认此两个细胞株分别高表达Igf-1/Bcl-2和Bcl^-2/Cyclin E基因组合。分别通过撤去血清和加入放线菌素D诱导细胞凋亡,并以流式细胞术和DNA Ladder法检测细胞凋亡,证明CHO-IB3和CHO-BC1均具有较强的抗细胞凋亡能力。MTT法证明两个细胞株在不含血清的IMDM培养基中的增殖活力显著高于CHO-dhfr-对照细胞。在细胞培养瓶中的连续培养实验表明,CHO-IB3和CHO-BC1在本实验室设计的IMEM无蛋白培养基中的生长速度和活细胞数显著高于CHOdhfr-对照细胞。提示此两个细胞系能够在无血清培养基中抗凋亡高活力生长,适于作为生物工程宿主细胞。     

通过高表达Igf1/Bcl-2或Bcl-2/Cyclin E基因组合使CHO细胞适于在无蛋白培养基中抗凋亡培养

哺乳动物细胞表达系统是生产重组蛋白药物最常用的表达系统。但在无蛋白培养基中,哺乳动物细胞生长活力差,且容易发生细胞凋亡,因而难以大规模培养。为解决此问题,应用双顺反子表达载体在CHO-dhfr^-细胞中同时表达Igf-1／Bcl-2或Bcl-2／CyclinE基因组合,通过Bcl-2使细胞获得抗凋亡能力;通过1gf-1或CyclinE促进细胞生长分裂,使细胞获得在无蛋白培养基中生长的能力。以上述基因组合转染CHO-dhfr^-细胞,应用Western blot从G418抗性克隆中分别筛选到Bcl-2高表达克隆若干个,对其中表达Bcl-2最高的CHO-IB3和CHO-Bcl做进一步Western blot和流式细胞分析,确认此两个细胞株分别高表达Igf-1／Bcl-2和Bcl-2／CyclinE基因组合。分别通过撤去血清和加入放线菌素D诱导细胞凋亡,并以流式细胞术和DNA Ladder法检测细胞凋亡,证明CHO-IB3和CHO一BCl均具有较强的抗细胞凋亡能力。MTT法证明两个细胞株在不含血清的IMDM培养基中的增殖活力显著高于CHO-dhfr^-对照细胞。在细胞培养瓶中的连续培养实验表明,CHO-IB3和CHO-BCl在本实验室设计的IMEM无蛋白培养基中的生长速度和活细胞数显著高于CHO-dhfr^-对照细胞。提示此两个细胞系能够在无血清培养基中抗凋亡高活力生长,适于作为生物工程宿主细胞。     

动物细胞无血清培养基的研究与设计方法

随着哺乳动物细胞培养规模的扩大和生物药物需求的增长,基于细胞及产品特性的无血清培养基的研制已成为细胞工程领域的重要课题。运用统计学实验方法,可科学有效地考察细胞培养基中多因素、多水平间的交互作用。应用新型蛋白质组分析技术及生物芯片技术定位胞浆信号通路相关蛋白、膜表面的生长因子受体、激素受体、细胞因子受体、粘附分子等,用于确定细胞培养基中调控分子的添加组合。本文系统概述了目前无血清培养基几种新型及常用的研究和设计方法,并对其应用特点做了分析,希望为动物细胞无血清培养基的研制提供可借鉴的思路。     

分泌重组抗体的CHO细胞体外培养条件的优化

目的：对生物反应器细胞培养时培养时培养基组成进行优化。方法：以稳定转染了抗CD3人源化抗体的CHO细胞为模型,以无血清培养基经生物反应器高密度细胞培养后分子量小于50kDR的超滤液为基础培养基,在细胞培养板中考察添加氨基酸、丁酸钠、柠檬酸铁等多种成分对细胞生长状态和蛋白表达量的影响、结果：2mmol/L丁酸钠可以有效地诱导蛋白的表达,丁酸钠和柠檬酸铁对于促蛋白表达有协同作用,适量添加培养过程中消耗较快的氨基酸可提高细胞数和蛋白的表达量。结论：利用所述方法可快速优化培养基成分,显著提高生物反应器中细胞的蛋白表达量。     

氨基酸调节mTORC1信号通路的分子机制

正哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是存在于哺乳动物体内的一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,能够调节细胞内多种物质的代谢。它参与组成哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mTORC1)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体2(mTORC2)2种复合体。在2015年发现的人类mT ORC1结构基础上,Saxton等人揭示了亮氨酸对于mT ORC1通路复杂的调控机制。他     

商陆根中抗真菌蛋白的分离和特性研究

从美洲商陆(Phytolacca americana L.)夏天采集的2—4年生宿根中分离了二种抗真菌蛋白,称为PAFP-R_1和PAFP-R_2。分离程序包括用盐溶液提取,经CM-Sephadex离子交换层析、凝胶过滤层析和羟基磷灰石柱层析纯化。在PGA培养基上,0.1mg/ml蛋白明显抑制木霉菌丝的生长;但对细菌的增殖,即使1mg/ml也无抑制作用。用SDS-PAGE测得二者的相对分子量各为13kD和15kD,单多肽链,等电点约为5.8。用酚-硫酸法未测出含糖。二种蛋白均高含半胱氨酸(19mol/mol)。用Edman降解法测得二者的N末端均为Ala。秋天采集的根中,这二种蛋白含量均很低,但富含由二条PAFP-R_1肽链以双硫键联结的二聚体,它无抗真菌活性。冬天宿根中抗真菌蛋白主要成分是Mr为17kD的单肽链蛋白。上述蛋白对于人红血球均无凝集活性,因此不是PWM的成分。以上结果说明,商陆根中有多种具抗真菌活性的蛋白,成分随季节发生变化,它们都是不含糖,高含半胱氨酸,分子量小于20kD的单肽链蛋白。     

毛地黄(Digitalis purpurea)叶离体培养过程中光质与培养基对器官发生的交互作用

培养基成分影响毛地黄叶外值体的生长,不含BA的培养基中芽不能发生,无NAA的培养基中无根发生。光质的效应与培养基成分有关,黄、蓝、绿光在未加有机成分(NAA为0.ling·L~(-1))的培养基中能促进芽的生长,当NAA为0.5 mg·L~(-1)时则抑制芽的生长。红光、黑暗处理与培养基成分关系不大,一般均抑制发芽;根的发生不需要光。光质和培养基之间有交互作用。     

用于重组蛋白药物生产的CHO细胞无血清培养基的研究进展

哺乳动物表达系统因其具有类似于人源化细胞的翻译后修饰方式,已经成为重组蛋白药物生产的主要表达系统.中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞是生产重组蛋白的理想哺乳动物细胞宿主,目前近70％批准上市的重组蛋白药物是由CHO细胞生产的.常规细胞培养所用的培养基需要补充血清才能正常生长,但血清...     

培养构体的无蛋白和低蛋白的培养基(续完)

<正> 对无蛋白培养基培养勾体广泛变异的血清型的适应性作了研究。共计17个血清型(27株)在无蛋白培养基中至少转种过9次见表3。当移植期间勾体最高产量和所需时间任何被试菌株没有明显的变异。在无蛋白培养基上培养致死地鼠的流感伤寒11808株的传代必须加入0.1％白蛋白,但对亲肾脑的或无毒株则否。     

哺乳动物细胞表达系统研究进展

目前,哺乳动物细胞已成为生产多种生物药物的首选宿主细胞。哺乳动物细胞表达系统可进行翻译后修饰,表达的重组蛋白接近人源构象,因此被大量用于治疗性重组蛋白的生产,如何建立高效的哺乳动物细胞表达系统也受到研究者们的重视。随着基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学研究不断深入,近几年来在优化哺乳动物表达系统方面取得了长足的进步。从高效表达载体构建、宿主细胞改造、高通量筛选、培养基优化等方面阐述哺乳动物细胞表达系统的研究进展,以期为研究者们提供一定的帮助。     

无血清培养基的成分改进及应用现状

无血清培养基因其组成成分相对清楚,制备过程简单,与天然培养基、合成培养基相比有着无可比拟的优势,因而在生命科学基础研究和生物医药等领域日益得到了重视和广泛应用。主要对无血清培养基的发展过程、成分及改进、应用及开发方面进行了论述。     

适于无血清贴壁培养的抗凋亡宿主细胞系CHO-IVB2的构建

应用无血清培养基培养CHO细胞时 ,由于没有血清提供各种贴壁因子 ,细胞以悬浮的方式生长。在实际的大规模细胞培养中 ,CHO细胞往往以贴壁方式培养 ,要么贴壁于悬浮的微载体中 ,要么贴壁于固定的聚酯盘状介质或中空纤维中 ,而很少直接悬浮于培养基中。在无血清培养基中 ,Vitronectin单一组分可以促使CHO细胞的贴壁和扩增。通过双表达Igf_1和Bcl_2基因 ,已经构建了可以在无蛋白培养基IMEM中抗凋亡生长的细胞株CHO_IB3。在此基础上 ,构建了可以同时表达Igf-1、Vitronectin和Bcl-2三个蛋白的三顺反子表达载体pCI-NII-IVB。将该载体转染于CHO-dhfr^- 细胞中 ,构建了一个细胞株CHO-IVB2。该细胞株可以在无蛋白培养基中抗凋亡生长 ,适于以贴壁的方式大规模培养 ,用于大量生产外源目的蛋白.     

一种能简化精制过程降低成本的蛋白质生产新方法

美国亚利桑那州特斯康的Research Corp.Technologies(RCT)是一家从事非营利性技术转让的机构。它开发了一项从哺乳动物细胞生产蛋白质的新rDNA技术,名为“逆”分泌技术。据称,用此技术比用其它技术成本低,又省事。 RCT的这项技术利用了劳氏肉瘤病毒的逆转录病毒基因gag,它有联结哺乳动物异种蛋白并将这些蛋白包裹在泡囊内的能力。gag基因与蛋白质联结后,即引导蛋白质至寄主细胞的表面,并开始在该处“出芽(bud)”。在出芽过程中,蛋白质被包在泡囊内并被释放至生长培养基中。将蛋白质离心,蛋白质即被纯化。由于这方法只利用这种逆转录病     

一种使哺乳动物细胞中rDNA增强表达的启动子

如果要找到一种可增强哺乳动物细胞中重组体蛋白的表达水平的方法,不妨试试一个新发现的启动子,它能提高哺乳动物细胞中基因的表达水平。该启动子是通过重组体 DNA 技术与另一种基因偶联在一起的。实际上,它(用于β肌动蛋白的开关)可能是一些最有用的启动子中的一种,因为它能控制β肌动蛋白(哺乳动物细胞中最有用蛋白中的一种)的产生。据发表于1985年10月的一份《美国国家科学院院报》杂志报道,斯坦福大学医学院(斯坦福’     

金属硫蛋白的结构模型

金属硫蛋白是一种低分子量(6,000—10,000),富含半胱氨酸(25—35％),并能结合重金属如Zn、Cd、Cu、Hg 或Ag的蛋白质。因其含硫及金属故称为金属硫蛋白(Metallothionein,简称MT)。自1957年Margashes和Vallee在马的肾脏皮质中第一次分离出含有镉的蛋白质以来,在哺乳动物(包括人)、微生物、原核生物蓝绿藻及植物中已先后分离出金属硫蛋白。它是一种诱导性的蛋白质。在实验的动物和培养的细胞中(如 Hela 细胞、人的上皮细胞等)金属硫蛋白不仅能被重金属离子而且也     

西藏雪层中酵母菌的分离鉴定

西藏地区因受气候条件的影响,人烟稀疏。故对此地区的自然环境、牛态及资源的研究均少见报道。但此处地域辽阔,有着宽广无根的雪地。研究西藏雪层中生物及微生物生长方面的厂作,可加强人们认识、保护、利用远边地区的自然环境。我们在西藏希夏邦马峰的积雪中,对雪面不同地段的气样每隔5cm深度作一层编号取样,并取6层次雪样。将其进行分离培养,结果显示在2展市样中有较典型的酵母菌。l材料与方法回,。I豆．且培养基及样品无机盐培养基;酵母膏、蛋白陈琼脂培养基;马铃薯、葡萄糖琼脂培养基;糖发酵基础培养基及无维生素基础培养基。…     

哺乳动物细胞表达系统

(一)重要性在基因工程领域,哺乳动物细胞表达系统日益受到人们重视。许多重要的具医疗价值的蛋白在大肠杆菌表达系统中无生物活性或活性很低。这是由于在此系统中许多真核蛋白不能完成转译后修饰,如糖基化、酰胺化、二硫键的正确连接和亚基的正确装配。而在哺乳动物细胞表达系统中,这些转译后修饰过程能正常进行,产生与天然蛋白完全相同的分子。因此,哺乳动物细胞表达系统正在逐渐形成产业。在理论研究上,哺乳动物细胞表达系统也十分重要,它是研究真核基因调控的必不可少的模型。这个系统不仅对检验基因的同域作用(cis-acting)序列(如启动子)非常有用,而且对研究跨域作用因子(如一些调控蛋白)也极有价值。     

小鼠和大鼠的胚胎培养基及若干相关问题

哺乳动物早期胚胎体外培养所用各种化学成份明确的培养基是研究生命科学中一项重要技术。它已被常规用于研究胚胎早期发育,多种动物及人类辅助生殖技术,转基因动物,动物克隆等领域。介绍了用于移植前胚胎培养基的研究和发展历史,当前所用化学成份明确胚胎培养基的主要组成,特别是针对小鼠和大鼠移植前胚胎所用各种培养基及其成份,讨论了这类培养基发展前景和研究方向。     

中药提取液对灵芝深层发酵的影响

我国中医药历史悠久 ,中药资源丰富 ,为保证广大人们的身体健康起到巨大作用。但近几十年来 ,我国在中药现代化方面进展缓慢 ,其中原因之一就是中药加工技术陈旧[1] ,近来有学者提出了中药发酵制药技术[1,2 ] 。药用真菌是中药的组成部分 ,它们中的许多种类都能以液体发酵进行生产[3] ,以适当的中药为培养基或在培养基中添加适量的中药 ,利用它们强大的分解转化能力 ,不仅可对中药中的纤维、糖类和蛋白等物质加以利用 ,而且在代谢过程中可能对中药中的一些成分进行转化 ,从而提高中药活性成分在复合制剂中的比例及效价 ;另外中药中的某些成…     

羊输卵管液中发情相关糖蛋白的性质研究

哺乳动物输卵管卵管液为受精和早期受精卵的发育提供了一个理想的生理生化环境。人们对输卵管液的成分已进行了初步研究,其中发情相关糖蛋白（EGP）是被研究的成分之一。EGP仅存在在排卵核受精前后的输卵管液中。当受精卵进入子宫区,输卵管液中的EGP就消失了。显然,EGP是与哺乳动物的早期发育过程密切相关。尽管人们对EGP的确切生理功能尚不清楚,但作为第一步,首先弄清EGP的理化性质是十分重要的。本文目的在于研究羊输卵管液中EGP的理化性质。本文采用单向（ID）、双向（2D）SDS－聚丙烯胺凝胶电泳（PAGE）和等电聚胶电泳（IEF）,结合Western blot技术对EGP的性质进行了[研究。由于单克隆抗体及花生凝集素（Peanut Agglutinin)和EGP相结合的专一性很高,不必事先对EGP进行纯化就可直接进行分析。我们的结果证明羊EGP包括两种蛋白质,一种是酸性蛋白,它的等电点为数4．5;另一种是碱性蛋白,其等电点是8：0;这两种蛋白基的分子量相同,都是10kD。从不同物种间EGP这些理化数据上比较,羊和狒狒的非常接近,但和其他动物的有很多不同。我们认为来自不同动物的EGP可能是一类性质相同的蛋白质,具有相同的生理功能,但其分子受糖基化的程度是不同的。本研究使我们对生殖过程的了解使有所增加,也对寻求一种更有效的早期胚胎体外培养基有所帮助。