不同种类的脂肪酸对肝细胞脂质堆积的研究

目的：比较不同种类的脂肪酸对人肝癌细胞（HepG2）脂质堆积的影响。方法：HepG2细胞随机分为对照组（Con）、棕榈酸组（PA）、油酸组（OA）、亚油酸组（LA）和亚麻酸组（ALA）。培养24 h后,以MTT法比较不同种类脂肪酸对肝细胞存活率的影响;同一浓度下,以油红O染色法比较,各组细胞内脂滴生成情况拍照并测量吸光度;以酶学法检测各组细胞内甘油三酯含量比较不同种类脂肪酸对肝细胞脂质堆积的影响。结果：确定了每种脂肪酸诱导的浓度为50 μmol/L,同一浓度下,随着PA、OA、LA、ALA各组脂肪酸的不饱和度依次增加,PA、OA、LA、ALA各组细胞内脂滴依次增多,细胞内TG含量依次升高。与对照组相比,PA无统计学差异,OA存在显著性差异（P＜0.05）,而LA和ALA分别存在极显著性差异（P＜0.001）。且对每种脂肪酸诱导的肝细胞脂质堆积程度进行统计学分析,均存在显著性差异（P＜0.05）。结论：同一条件下,不同种类的脂肪酸对肝细胞活力和脂质堆积程度的影响不同,提示可能与脂肪酸的不饱和度有关,不饱和度越高的脂肪酸对细胞脂质堆积作用越明显。     

大豆ω-3脂肪酸脱氢酶基因GmFAD3C在酿酒酵母中的表达

α亚麻酸(ALA)被称为必需脂肪酸,对人体有一系列的保健作用。ω-3脂肪酸脱氢酶(FAD)催化亚油酸(LA)生成ALA。大豆种子油中ALA含量较高,为了研究大豆ω3FAD的功能,用RTPCR方法从大豆未成熟种子中扩增出GmFAD3C的cDNA,克隆到酵母表达载体p416中,并用醋酸锂法转化酿酒酵母营养缺陷型K601,经筛选鉴定,得到阳性克隆。气相色谱分析脂肪酸成分,发现工程菌产生了新的脂肪成分ALA,含量占总脂肪酸的3.1%,LA含量与对照相比相应地下降,证明该基因编码的蛋白具有催化18碳多不饱和脂肪酸(PUFA)底物LA在Δ15位脱氢生成ALA的ω3FAD功能,首次实现大豆ω-3脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母K601p416系统中的表达,建立了一种新的高效低成本的FAD酵母表达系统。     

大豆ω-3脂肪酸脱氢酶基因GmFAD3C在酿酒酵母中的表达

α-亚麻酸(ALA)被称为必需脂肪酸,对人体有一系列的保健作用。Ω-3脂肪酸脱氢酶（FAD）催化亚油酸(LA)生成ALA。大豆种子油中ALA含量较高,为了研究大豆ω- 3FAD的功能,用RT-PCR方法从大豆未成熟种子中扩增出GmFAD3C的cDNA,克隆到酵母表达载体p416中,并用醋酸锂法转化酿酒酵母营养缺陷型K601,经筛选鉴定,得到阳性克隆。气相色谱分析脂肪酸成分,发现工程菌产生了新的脂肪成分ALA,含量占总脂肪酸的3.1％,LA含量与对照相比相应地下降,证明该基因编码的蛋白具有催化18碳多不饱和脂肪酸（PUFA）底物LA在Δ15位脱氢生成ALA的ω-3 FAD功能,首次实现大豆ω-3 脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母K601 p416系统中的表达,建立了一种新的高效低成本的FAD酵母表达系统。     

代谢工程改造热带假丝酵母高效合成中链ω-羟基脂肪酸

[目的]ω-羟基脂肪酸(ω-hydroxyfatty acid,ω-HFAs)是一种绿色安全无毒,具有良好生物相容性的理想生物降解材料,广泛应用于化工、食品、药学等方面,微生物发酵法生产ω-羟基脂肪酸具有重要的研究意义和应用前景.[方法]为了得到高产ω-羟基脂肪酸的代谢工程菌株,通过同源重组技术,连续敲除二倍体热带假丝...     

微量元素对大肠杆菌生长和乙酸生成的影响研究

大肠杆菌DA19的代谢特性与培养基中添加微量元素有较大的关系。在基本培养基中,当氮源限制时,添加微量元素可以在一定程度上改善DA19菌体的生长,提高菌体得率YX/G,大大减少乙酸的生成;当氮源充分时,与不添加微量元素相比,DA19在添加微量元素后,菌体浓度大大增加,虽然葡萄糖消耗速率加快,但产乙酸仍然很少,只有不添加时的13％,YX/G提高至少60％。基本培养基中添加0.1～1mL/L的微量元素混合溶液对DA19菌体生长、乙酸生成及葡萄糖消耗没有显著影响。在单独添加不同种类的微量元素时, BO33-、Zn2+、MoO42+、Cu2+没有特别明显的影响,Al3+会抑制菌体生长和葡萄糖利用,而Co2+、Mn2+、Fe2+可以改善细胞生长,特别是添加Fe2+时,细胞生长及乙酸生成等培养结果与添加微量元素混合溶液几乎相同。     

短小芽孢杆菌肉碱转运系统opuC基因的克隆与序列分析

以前期获得的ω-1-羟基脂肪酸高产突变菌株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)M-F641的总DNA为模板,利用Primer Premier 5.0软件设计4对引物,对决定长链脂肪酸无效降解途径中肉碱转运的OpuC转运系统的基因进行克隆,成功获得了opuCA、opuCB、opuCC和opuCD的基因序列,并利用MEGA 3.1、DNAStar等软件进行序列分析.研究内容将为进一步利用短小芽孢杆菌长链脂肪酸高效转化生产ω-1-羟基脂肪酸菌株奠定基础.     

α-亚麻酸及其代谢产物EPA和DHA

食物中存在三大系列不饱和脂肪酸:油酸(ω-9)、亚油酸(ω-6)和亚麻酸(ω-3)系,它们在体内代谢时不能互相转换,并具有各自独特的生理功能。油酸的分子结构中只含一个双键,不属于多不饱和脂肪酸类。亚油酸和亚麻酸的分子结构中皆含两个或两个以上双键,属多不饱和脂肪酸类。长期以来,人们就知道膳食中的多不饱和脂肪酸为动物和人体的生长和健康所必需,尤其是亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸被认为是三种必需脂肪酸,如缺乏可产生一系列缺乏症状,例如生长迟缓或停滞、皮炎、脱毛、生殖功能受损等。给予上述三种脂肪酸以后可使之恢复正常;在恢复效果方面各脂肪酸不相同(?)     

诺卡氏菌对油酸的羟基化作用

诺卡氏菌(Nocardia sp．N13)休止细胞对油酸(顾-9-十八碳烯酸)进行羟基化作用。用休止细胞转化时最适温度为30℃,最适pH为6．5,当菌体(干菌)与底物的最适比例为20 ：1对,对油酸的转化率为83．4％,不同的表面活性剂影响转化的效果。N13休止细胞在磷酸缓冲液中重复转化3次仍可保持50％左右的转化率。红外光谱、质谱、棱磁共振鉴定产物为10－羟基硬脂酸。     

Candida cloacae长链脂肪酸醇氧化酶基因的克隆与表达

Ｃａｎｄｉｄａｃｌｏａｃａｅ是利用链烃和长链脂肪酸作为碳源来生长的一种工业酵母 .长链脂肪酸在单加氧酶作用下 ,使远离羧基的甲基羟化 ,生成ω 羟脂肪酸 .后者在生物体中通过两条连续的氧化通路进行氧化 (ω氧化通路和 β氧化通路 ) .醇氧化酶是ω氧化通路中的重要组成酶 ,它可以催化链烃或长链脂肪酸分子中的羟基氧化为醛基 ,后者再经其它酶氧化为羧基 .长链脂肪酸通过ω氧化通路生成二羧基化合物 ,它可作为重要的化工原料 ,广泛应用于香料、多聚酰胺、多聚酯、胶类和环内酯抗生素的生成[1] .ω氧化通路中产生的羧基化合物再经 β 氧…     

饲料中植物油替代鱼油对大西洋鲑肝细胞油酸跨膜吸收的影响简

以[1-14C]油酸(oleic acid;18:1n-9,OA)为指示剂,研究了不同饲料油源饲喂下大西洋鲑肝细胞膜脂肪酸组成受到改变时该细胞对OA吸收的状况,以探讨植物油(Vegetable oil,VO)替代鱼油(Fish oil,FO)对大西洋鲑肝细胞脂肪酸跨膜吸收的影响,为大西洋鲑饲料中植物油替代鱼油的可行性提供理论依据。试验先以鱼油和大豆油为油源配制两种全价配合饲料,分别饲喂大西洋鲑幼鲑5个月,使其产生不同的脂肪酸组成。在饲养结束后,分离并培养试验鱼肝细胞,将细胞与[1-14C]OA及37.5μmol/L OA(1/30,mol/mol,0.3μCi/瓶)共孵育2h,收集并测定细胞内OA放射活性,再计算细胞内OA吸收量[nmol/(h·million cells)]。同时,试验采取RT-PCR方法测定了细胞脂肪酸运送蛋白(Fatty acid transport protein,FATP)、脂肪酸移位蛋白(Fatty acid translocase,FAT/CD36)的基因表达量。结果表明,FO和VO组肝细胞对OA吸收分别为(0.924±0.258)及(0.888±0.179)nmol/(h·million cells),两组间无显著差异(P0.05)。RT-PCR的检测结果表明,FAT/CD36和FATP基因表达量在FO与VO两组间均无显著差异(P0.05)。结果表明,从植物油替代鱼油不影响大西洋鲑肝细胞对长链脂肪酸的跨膜吸收方面来看,大西洋鲑饲料中以植物油替代鱼油具有可行性。     

瓶鼻海豚肌肉组织营养组成特征分析

分析了2只瓶鼻海豚(Tursiops truncatus)肌肉组织的营养组成。分析部位包括胸腔内肌肉、背肌、腹肌和尾肌四个部分。分析结果表明,2只海豚腹肌和尾肌粗脂肪含量较其他部位高,蛋白质及灰分在肌肉组织中的分布规律不明显。海豚不同部位氨基酸组成具有极高的一致性,含量最高的氨基酸均为谷氨酸,最低的是胱氨酸,胸腔内肌肉和背肌中必需氨基酸含量较高,但不同部位必需氨基酸占总氨基酸的比例基本相当。海豚肌肉组织均存在棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、EPA(20:5ω-3)及DHA(22:6ω-3)等脂肪酸,这些脂肪酸是动物及鱼油中典型的脂肪酸。饱和脂肪酸(SFA)的总量与单不饱和脂肪酸(MUFA)的总量相近且大于多不饱和脂肪酸(PUFA)的总量。不饱和脂肪酸中ω-3/ω-6的比值与其他海洋生物相比(通常高于4,有的高达50)明显偏低。海豚肌肉组织中富含Ca、Fe及Zn、Cu、Mn、Se等微量元素。     

血清浓度及溶氧对培养rCHO细胞生产尿激酶原的影响

在30L搅拌式反应器中用多孔微载体培养分泌尿激酶原的DNA重组中国仓鼠卵巢细胞(rCHO),研究了血清浓度及溶氧对细胞生长和表达的影响.结果表明,在2×105/ml低密度接种条件下,使用低(无)血清培养基会延长细胞生长延滞期并降低比生长速率,而细胞密度大于106/ml时,血清浓度对细胞生长和产物表达的影响没有显著差别.溶氧(DO)维持在20%～45%时,对细胞表达产物和葡萄糖代谢无明显影响,但溶氧降至7%～9%时,细胞表达水平明显降低,葡萄糖代谢转化为乳酸的比例上升.     

葡萄糖和肿瘤坏死因子-α对内皮细胞中早期生长反应基因-1表达的影响

目的探讨葡萄糖和肿瘤坏死因子-α对内皮细胞中早期生长反应基因-1表达的影响。方法利用人脐静脉内皮细胞体外培养,予以25mmol/L葡萄糖和/或10ng/ml肿瘤坏死因子-α与内皮细胞共同孵育,运用蛋白免疫印迹方法检测细胞中早期生长反应基因-1蛋白的表达,运用酶联免疫吸附法检测纤溶酶原激活抑制物-1的表达。结果葡萄糖和肿瘤坏死因子-α均可增加早期生长反应基因-1的表达,两种因素共同作用产生协同作用。而且,葡萄糖和肿瘤坏死因子-α也可促进纤溶酶原激活抑制物-1的表达。细胞外调节蛋白激酶1/2的抑制剂(PD98059)可下调肿瘤坏死因子-α所诱导的早期生长反应基因-1、纤溶酶原激活抑制物-1的表达,而对葡萄糖所诱导的早期生长反应基因-1的表达无明显影响。结论肿瘤坏死因子-α可能通过细胞外调节蛋白激酶1/2路径促进早期生长反应基因-1和纤溶酶原激活抑制物-1表达。肿瘤坏死因子-α和葡萄糖可能通过不同的信号通路调节早期生长反应基因-1、纤溶酶原激活抑制物-1表达,在肥胖、糖尿病等代谢紊乱所致的血管并发症的发生中起到重要的作用。     

来源于线虫Caenorhabditis briggssae 的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的合成及其功能分析

ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFAs)是一类被广泛研究和关注的脂肪酸,对人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要,并且对于人类的多种疾病的预防和治疗亦有着明显的作用。在人和哺乳动物体内,ω-3PUFAs的含量与ω-6PUFAs(其代谢方式和功能与前者不同,通常其作用也相反)相比很低。而对于人体,无论ω-3PUFAs的过低还是ω-6PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。所以人们一直在努力寻求提高人体中ω-3PUFAs含量的途径或者大量生产ω-3PUFAs的方法。本研究经过密码子优化后,用化学合成的方法获得了C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP,通过脂质体转染了CHO细胞系并对其进行抗性筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的GC-MS分析表明,sFat1基因完全能够在CHO细胞中表达和发挥其ω-3去饱和酶的作用,即促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸(从十八碳到二十二碳)。ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%下降到35.29%,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的合成是成功的,试验所获得的结果为今后的进一步的研究或应用其大量生产ω-3PUFAs奠定了基础。     

丝状真菌被孢霉产生油脂的研究

被孢霉的三个菌株Mortierella sp.M10,M13与M14生长在以葡萄糖为碳源、尿素为氮源的液体培养基中,所得到的菌丝体内堆积含γ-亚麻酸的油脂。油脂产率以M10菌株为高,而油脂中的γ-亚麻酸含量却以M14菌株为高。这种油脂的脂肪酸中,所含饱和脂肪酸主要有豆蔻酸(C14:0),棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0);所含不饱和脂肪酸主要有棕榈油酸(C16:1),油酸(C18:1),亚油酸(C18:2)以及γ-亚麻酸(C18:3,n-6)。上述被孢霉菌株的培养物接种在含葡萄糖、尿素的培养基中生长大约48小时后,菌丝体顶端细胞形成鼓胀球状,此后仍继续胀大。菌体细胞形态的这种特异变化,可能与胞内油脂的累积有关。     

一株原油降解菌的分离鉴定及降解特性研究

[目的]对从大连湾原油污染海域生长的海绵中分离的原油降解菌2-9进行鉴定及降解特性研究.[方法]采用16S rRNA基因序列同源性分析、生理生化指标测定、DNAG+C含量测定、全细胞脂肪酸组成测定、碳源利用实验等多种方法对该菌株进行鉴定,并通过降解实验测定其对原油的降解情况.[结果]菌株2-9鉴定为Nitratireductor basaltis,革兰氏阴性,接触酶和氧化酶阳性.在GenBank中与其16S rRNA基因序列相似度最高的模式株为Nitratireductor basaltis J3T,相似性为99％.可生长的pH范围为6.0-10.0,最适生长pH值为8.0;可生长温度范围为15℃-42℃,最适生长温度为30℃; NaCl浓度生长范围是0-8％(W/V),最适生长盐度为2％.该菌株可以利用多种糖和有机酸的碳源,其DNA G+C含量为57.29 mol％,主要脂肪酸组成为ω7c-十八碳单不饱和脂肪酸(63.61％)、ω8c型环式十九碳饱和脂肪酸(16.97％)、饱和十八碳脂肪酸(4.28％)和十六碳饱和脂肪酸(3.39％).同时,考察了该菌株对原油的降解效果,在人工海水培养基中,14d内对原油(初始浓度为1 g/L)的平均降解率为63.5％.[结论]菌株2-9是一株具有开发潜力的原油降解菌.     

囊状黄丝藻在不同初始氮浓度条件下特殊的油脂积累规律

对不同初始氮浓度条件下囊状黄丝藻(Tribonema utriculosum SAG22.94)的生长状况、油脂含量和脂肪酸组成与含量进行研究。结果显示,囊状黄丝藻在氮浓度为3.0 mmol/L时,获得生物质浓度最高,为6.39 g/L;氮浓度为18.0 mmol/L时获得总脂和总脂肪酸含量最高,分别为细胞干重的44.62%和42.21%;上述3个指标单位体积的产率均在氮浓度3.0 mmol/L时达到最高值,分别为0.538、0.209和0.206 g·L~(-1)·d~(-1)。在4种初始氮浓度条件下,囊状黄丝藻油脂和脂肪酸含量可随着氮浓度增加而增加。脂肪酸含量分析结果显示,该藻的主要脂肪酸为豆蔻酸(C14∶0)、棕榈酸(C16∶0)、棕榈油酸(C16∶1ω7)、花生四烯酸(C20∶4ω6)和二十碳五烯酸(C20∶5ω3,EPA)。其中棕榈油酸含量最高,占总脂肪酸含量的36.53%~50.08%。研究结果表明囊状黄丝藻在不同初始氮浓度条件下具有特殊的油脂积累规律,是一株具有重要应用价值的产油丝状微藻。     

酿酒酵母脂酰-△9脱氢酶亚细胞定位表达及其对烟草脂肪酸合成的影响

以烟草Nicotiana tabacum L.为宿主植物,分别在细胞质内质网和质体内定位表达酿酒酵母Saccharom,ees cerevisiae脂酰-CoA-△9脱氢酶(Sc△9D),以期提高植物组织中棕榈油酸(16∶1△9)的积累量和分析该酶不同亚细胞定位表达对油脂代谢的影响.与野生型和空载体(对照)植物相比,转基因烟草植株叶片中单不饱和的棕榈油酸及顺式十八碳烯酸(18∶1△11)含量明显提高,而饱和的棕榈酸(16∶0)含量相应减少,多不饱和的亚油酸(18∶2△9,12)和亚麻酸(18∶3△9,12,15)含量亦降低.Sc△9D质体定位表达烟叶中棕榈油酸及顺式十八碳烯酸含量分别是Sc△9D细胞质内质网定位表达烟叶的2.7和1.9倍.这表明酵母脂酰-△9脱氢酶能在高等植物细胞中正确催化棕榈酸(16∶0)转化为棕榈油酸(16∶1△9),而且在质体内表达的效应显著高于在细胞质内质网上的效应.新建立了一种应用脂酰-CoA-△9脱氢酶代谢工程培育植物组织高水平合成积累棕榈油酸等ω-7脂肪酸的策略,有助于在生物量大的烟叶等营养器官中组装ω-7脂肪酸合成途径以生产优质生物燃油.     

饲料中植物油替代鱼油对大西洋鲑肝细胞油酸跨膜吸收的影响

以 1-14C油酸（oleic acid;18:1n-9,OA）为指示剂,研究了不同饲料油源饲喂下大西洋鲑肝细胞膜脂肪酸组成受到改变时该细胞对OA吸收的状况,以探讨植物油（Vegetable oil,VO）替代鱼油（Fish oil,FO）对大西洋鲑肝细胞脂肪酸跨膜吸收的影响,为大西洋鲑饲料中植物油替代鱼油的可行性提供理论依据。试验先以鱼油和大豆油为油源配制两种全价配合饲料,分别饲喂大西洋鲑幼鲑5个月,使其产生不同的脂肪酸组成。在饲养结束后,分离并培养试验鱼肝细胞,将细胞与1-14COA及37.5 mol/L OA（1/30,mol/mol,0.3 Ci/瓶）共孵育2h,收集并测定细胞内OA放射活性,再计算细胞内OA吸收量 nmol/（hmillion cells）。同时,试验采取RT-PCR方法测定了细胞脂肪酸运送蛋白（Fatty acid transport protein,FATP）、脂肪酸移位蛋白（Fatty acid translocase,FAT/CD36）的基因表达量。结果表明,FO和VO组肝细胞对OA吸收分别为（0.9240.258）及（0.8880.179）nmol/（hmillion cells）,两组间无显著差异（P0.05）。RT-PCR的检测结果表明,FAT/CD36和FATP基因表达量在FO与VO两组间均无显著差异（P0.05）。结果表明,从植物油替代鱼油不影响大西洋鲑肝细胞对长链脂肪酸的跨膜吸收方面来看,大西洋鲑饲料中以植物油替代鱼油具有可行性。       

来源于线虫Caenorhabditis briggssae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因

ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 PUFAs）是一类被广泛研究和关注的脂肪酸,对人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要,并且对于人类的多种疾病的预防和治疗亦有着明显的作用。在人和哺乳动物体内,ω-3 PUFAs的含量与ω-6 PUFAs（其代谢方式和功能与前者不同,通常其作用也相反）相比很低。而对于人体,无论ω-3 PUFAs的过低还是ω-6 PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。所以人们一直在努力寻求提高人体中ω-3 PUFAs含量的途径或者大量生产ω-PUFAs的方法。本研究经过密码子优化后,用化学合成的方法获得了C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA31-sFat1-EGFP,通过脂质体转染了CHO细胞系并对其进行抗性筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的GC-MS分析表明,sFat1基因完全能够在CHO细胞中表达和发挥其ω-3去饱和酶的作用,即促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸（从十八碳到二十二碳）。Ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%下降到35.29%,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。Ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的合成是成功的,试验所获得的结果为今后的进一步的研究或应用其大量生产ω-3PUFAs奠定了基础。