骨形态发生蛋白-7真核表达载体的构建及鉴定

从转录水平上对原有载体进行改造,以期提高外源蛋白的表达量,为进一步研究改建载体后蛋白表达量奠定基础。将pBI—EGFP载体上的反应元件Pbi-1切下,连在pTet-On载体上PCMV的下游;然后将外源基因BMP-7重组到原有的pBI—EGFP载体内,进行酶切和序列鉴定。成功地构建了pTet—0n—Pbi-1载体和其核表达载体pBI／BMP—7。     

人VDAC2融合蛋白质粒构建及原核表达研究

目的：构建人VDAC2融合蛋白原核表达质粒并进行原核表达研究。方法：运用RT—PCR技术在培养的人HepG2．2．15细胞中钓取到目的基因VDAC2,连接至T载体上进行克隆,获得大量目的基因与原核表达载体pTrc—CKS、pMBP—P连接,构建重组融合蛋白表达质粒,转入大肠杆菌中DH5a,BL21（DE3）LySs中,IPTG诱导蛋白原核表达,表达产物经SDS—PAGE检测,分析蛋白表达情况。结果：成功构建了重组载体pTrc—CKS—VDAC2和pMBP—P-VDAC2,并在原核大肠杆菌中实现了重组融合蛋白的超量表达。结论：构建的两个人VDAC2的融合蛋白表达质粒在大肠杆菌中均得到超量表达。为进一步研究VDAC2蛋白奠定了基础。     

固定化酶的微环境效应Ⅰ——最适pH的移动

以葡聚糖为载体,在葡聚糖上引入了不同量的羧甲基,采用CNBr法活化葡聚糖上剩余的羟基,使之与葡萄糖淀粉酶(GA)共价结合,从而观察载体羧甲基定量变化对固定化葡萄糖淀粉酶pH——活性曲线的影响。分别使用了两种不同孔度的葡聚糖(SephadxG100、G200)作为载体,首次发现在载体带有离子基因的情况下,载体的孔度变化对固定化酶的pH——活性曲线影响极大,甚至可以完全消除载体静电荷对此带来的影响。这些结果表明:固定化酶的微环境不仅与载体的静电势有关,也与载体分子空间结构的疏密程度有关。本文对固定化葡萄糖淀粉酶(IGA)的热稳定性也作了评价。     

Hsa-miR-663诱导型表达载体的构建及验证

为了研究hsa—miR-663在肿瘤细胞辐射应答通路中的功能,人工合成其前体并构建人表达载体pcD-NA^TM-6．2-GW／EmGFP—miR-663,进一步通过BP／LR重组反应将hsa—miR-663表达框转移至诱导型表达载体pTREx—DEST30中。然后将hsa—miR-663的诱导型载体转染构建的四环素操纵子稳定表达细胞系HeLa—TetR,通过定量反转录PCR及荧光蛋白的表达检测证实了hsa—miR-663在四环素诱导时表达水平升高。本载体的构建为深入研究hsa—miR-663的功能奠定了基础。     

ZO-1基因的慢病毒载体构建

目的：相邻两心肌纤维的连接处称心肌闰盘,它在心肌的机电活动中扮演重要角色。目前有关闰盘相关基因Cx43的研究已被广泛关注,而在不同心肌病理状态下,其变化及功能都与另一闰盘相关基因ZO-1有极为密切的联系。目前有关ZO-1的研究比较少,此次欲将猪ZO-1基因克隆到慢病毒表达载体并进行鉴定,为进一步研究其功能奠定基础。方法：利用聚合酶链反应（PCR）扩增猪ZO-1基因,并克隆到慢病毒表达载体,通过转化、抽提质粒、双酶切和测序鉴定构建的Lenti-EFlct—EGFP-TRE—ZO-1重组载体。结果：猪ZO-1基因片段重组到慢病毒载体;PCR和双酶切鉴定,电泳结果显示均能得到与理论大小相符的片段;经测序证实成功构建Lenti-EF1α—EGFP—TRE-ZO-1慢病毒表达载体。结论：通过一系列实验证实Lend．EF1α—EGFP—TRE—ZO—1慢病毒表达载体构建成功,可利用其感染相关细胞或注入动物体内,为后续的体外及在体研究奠定基础,明确其在不同心肌病理状态下所发挥的独特作用。     

K-Rasa^G12D基因突变体慢病毒载体的构建及其鉴定

目的：构建K-RasGl2D基因突变体慢病毒载体。方法：从病人组织中提取RNA通过RT—PCR反转录获得cDNA作为K-RasGl2D基因模板,通过PCR法扩增出K-RasGl2D基因突变体片段。将酶切的片段克隆入真核表达载体pCDH-CMV—MCS—EF1-RFP中,构建K-RasG12D基因突变体逆转录病毒真核表达载体。将连接产物转化至感受态大肠埃希菌DH5a,挑取转化平板上的细菌克隆,在抗生素培养液中培养过夜后进行PCR鉴定。经测序正确后转染293T细胞系,利用重组质粒PCR及串联基因表达的检测等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定。结果：所构建的K-RasGl2D突变体基因逆转录病毒真核表达载体经PCR鉴定和测序鉴定正确,转染293T细胞后可以观察到可检测到高强度表达的RFP荧光信号。结论：成功构建了重组真核表达载体,为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究K-Ras突变在癌症发病中的作用奠定了基础。     

大鼠微小RNA miR-16的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的克隆微小RNArno—miR-一16,构建其慢病毒表达载体pLV—miR-16并包装成慢病毒颗粒,为进一步研究miR一16的功能奠定了实验基础。方法从大鼠细胞基因组中用PCR的方法扩增miR-16的前体,构建了miR-16的重组表达载体pLV—miR-16,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物（pPACK—GAG、pPACK—REV和pVSV）共转染包装细胞293TN细胞,包装产生慢病毒,以293TN细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达水平测定病毒滴度。结果经PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建携带大鼠miR-16基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293TN呈绿色荧光,并测得10^8〉ifu／ml。结论成功构建大鼠慢病毒载体pLV—miR-16,为深入研究rno—miR-16的生物学功能奠定了基础。     

抗菌肽-X基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR技术获得抗菌肽—X基因、TNFα基因,与温度诱导的表达载体pRC连接成为重组表达载体,导入大肠杆菌TG1,通过温度诱导表达重组蛋白。将重组质粒转入不同的表达菌中进行表达,经SDS—PAGE选出E.coil BL21(DE3)为最佳表达的宿主菌。培养后,离心得菌体,经超声破碎离心得包涵体,溶解后用CNBr切割并透析,最后经CM52纤维素柱分离纯化得到有活性高纯度的抗菌肽—X。     

单纯疱疹病毒2型特异性DNA片段的克隆和鉴定

用核酸限制性内切酶BamHI对单纯疱疹病毒2型(HSV—2)的DNA进行酶解,回收位于基因组中的反向重复序列区的Bam HIG片段,然后将其克隆在载体质粒PUC 8的Bam HI切点上,进一步用核酸限制性内切酶Eco RI和KPNI对这一重组质粒联合酶解,移去EcoRI—KPNI小片段,经末端修饰后,将其连接得到新的重组质粒pRC102,它含有一小段HSV—2的DNA序列。以此质粒为探针,分别与HSV—1、HSV—2及细胞DNA进行斑点杂交;与HSV—1和HSV—2酶解后的DNA片段进行Southern转印系交。两组实验结果显示,pRC102质粒DNA只与HSV—2 DNA特异性杂交,其HSV—2的型特异性良好。     

化学物质打破葡萄休眠的应用效果初报

分别以露地栽培的“森田尼无核”、“早熟红无核”和大棚栽培的“乍娜”、“藤稔”为试验材料,对多种化学物质打破休眠的效应进行了探讨。结果表明,在大棚中应用H2CN2破眠效果显著,可提早萌芽9-12d,提早开花l0-12d,提早成熟14d。CaCNz(石灰氮)、TDZ、GA3、6—BA和KNO3等药剂均显示出不同程度的破眠效应。     

卷枝毛霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的高效表达

为获得产高γ—亚麻酸的酿酒酵母工程菌株,应用RT—PCR技术,从卷枝毛霉中扩增出△^6—脂肪酸脱氢酶基因,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2．0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYES412,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母缺陷型菌株INVScl中,在SC—ura合成培养基中筛选到转化酵母,在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体,通过气相色谱对转化酵母进行脂肪酸色谱分析,结果表明：γ—亚麻酸占总脂肪的50．07％。迄今为止,这是国内外△^6—脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母表达量最高的报道。     

果糖-2,6-二磷酸对香蕉成熟过程中焦磷酸果糖-6-磷酸转移酶活性的调节作用

从成熟香蕉果实中部分纯化了焦磷酸:果糖—6—磷酸磷酸转移酶(PFP)。研究了酶的果糖—2,6—二磷酸的活化动力学特性.果糖—2,6—二磷酸通过降低酶的K_m(F6P)值和增进最大反应速度(V_(max))促进酶的果糖—6—磷酸磷酸化活性。底物(F6P)浓度和温度影响果糖—2,6—二磷酸对酶的活化作用。 本工作中还观察了香蕉成熟过程中PFP和依赖ATP的磷酸果糖激酶(PFK)活性的变化,并对PFP在果实成熟中的生理意义和调节特性进行了讨论。     

大鼠miR-126慢病毒表达载体的构建及其在肝星状细胞中的表达

目的：肝星状细胞（hepaticstellatecell,HSC）激活并发生表型改变是肝纤维化形成的关键,本实验期待通过构建慢病毒mo—miR．126,并体外转染Hsc,为研究miR．126在肝纤维化中的作用奠定实验基础。方法：PCR扩增miR-126的前体,构建miR．126的重组表达载体pCDH．CMV-MCS．EFl．copGFP-miR．126,脂质体法转染包装细胞293TN细胞,包装产生慢病毒,以293TN细胞绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）的表达水平测定病毒滴度,构建重组慢病毒（Lentivims,LV）载体（Lv．miR．126）,体外转染活化的HSC．T6,荧光显微镜观察荧光阳性细胞百分率,real—timePCR检测miR一126转入水平。结果：经PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建携带大鼠miR一126基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293TN呈绿色荧光,并测得滴度108〉ifu／ml。荧光显微镜下HSC的荧光阳性率在95％以上。Real—timePCR检测证实miR-126转染后获得了较高的表达。结论：成功构建大鼠慢病毒载体Lv—miR-126,并可在体外高效稳定表达,为本研究后续对miR-126靶点验证和功能研究奠定实验基础。     

SARS-CoV S蛋白基因的克隆及其与VSV-G融合表达载体的构建

为了解重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS—CoV)表面S蛋白的受体结合功能域及其在宿主细胞上的作用受体,应用PCR技术从SARS—CoV cDNA中克隆到S蛋白的全长基因,并构建了S蛋白与疱疹性口腔炎病毒胞膜蛋白(VSV—G)融合表达载体pVSV—G‘-SG,进而为制备含有SARS—CoVS蛋白膜外区的逆转录病毒假毒粒奠定了实验基础。     

由乳糖发酵短杆菌利用谷氨酸发酵生产L—脯氨酸

以乳糖发酵短杆菌ATCC13870作亲株,经诱变处理,在添加L—谷氨酸(GA)的培养基中筛选L—脯氨酸产生菌。在GA存在下选出了L—脯氨酸的高产菌株TA—20,该菌株的试管培养L—脯氨酸的积累量是:在不添加GA时,     

GA2ox1氧化酶基因的克隆及原核表达

采用RT-PCR从拟南芥基因组中克隆到GA2ox1基因,通过Gateway克隆技术构建原核重组表达载体pDEST17-GA2ox1,并转化大肠杆菌BL(21)star,对蛋白原核表达条件进行优化.结果表明,最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导6 h.蛋白表达形式为包涵体,与Biotech对GA2ox1基因在大肠杆菌中的表达情况推测的结论一致.重组蛋白分子质量约为40 kD,经Ni Sepharose亲和层析柱纯化和Western blot鉴定得纯度90%以上的GA2ox1重组蛋白.研究结果为GA2ox1抗体制备及蛋白功能的进一步研究奠定了基础.     

赤霉素对烟草叶组织培养中芽形成的抑制效应

本文研究了赤霉素(GA)对烟草叶组织培养中芽形成的影响。单加GA 能明显促进叶组织膨大,叶肉细胞明显增大,但无细胞分裂发生。在诱导成芽的培养基中(2毫克/升BA)加入不同浓度的GA(0.5—5.0毫克/升),均强烈抑制芽的形成。在培养的不同时间进行的不同培养基之间的转移培养试验说明,GA 的作用主要发生在第一个星期内。组织细胞学观察表明,在加有GA 和BA 的培养基上,叶组织中极少形成分生细胞团。GA 抑制芽形成的作用显然与此密切相关。一旦培养的组织中形成了有一定结构的分生细胞团,这一成芽过程似不再为GA 所逆转。     

小麦低分子量麦谷蛋白亚基组成研究

利用改良的两步一向SDS—PAGE(two—step one—dimensional SDS—PAGE)分析了几种小麦低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)组成。70％热乙醇提取总谷蛋白,11％分离胶进行第一步SDS—PAGE分离．电泳1h后切取顶端1cm胶条并置于巯基乙醇溶液进行还原,还原后的胶条于11%～16．5％的梯度胶进行第二步SDS—PAGE分离。结果显示。两步一向SDS—PAGE可以彻底除去清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白对LMW—GS分离的背景干扰。提高LMW—GS的分辨率。对几种小麦低分子量麦谷蛋白亚基分析表明：LMW-GS组合比HMW—GS更为丰富,每种小麦含有2～5种B亚基,2～4种C亚基．B、C亚基的总数量为4～8种。     

重组人G-CSF双体分子的构建表达及生物活性和结构特性分析

研究目的是分子设计并构建较G—CSF。单体分子具有半衰期更长、生物活性更高的新型重组人G—CSF／G—CSF双体分子(简称G-G),并在原核系统进行高效表达。分别构建pET32／G—G和pET32／G原核表达载体,实现G-G双体融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,利用亲和层析等方法进行蛋白纯化;对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性、抗原性及亲水性进行模拟分析;采用MTT法对G-G双体融合蛋白的生物学活性进行测定。结果首次构建成功了G-G双体分子融合蛋白高效表达载体,表达量高于40％,一步亲和层析所获融合蛋白的纯度为80％左右。该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示,G-CSF双体分子的等电点、柔性、抗原性及亲水性均未显改变。活性测定表明,所构建表达的重组人G-G双体分子能有效刺激G—CSF依赖细胞株NFS-60的增殖,但其刺激效应低于G-CSF的单体和标准品。结果表明,所构建表达的G-CSF的单体和G-G双体分子均可在大肠杆菌中获得高效表达,但G-G双体分子的比活性不及G-CSF单体分子,与预期设想的有差别,其原因正在研究之中。     

增强p53、p21及抑制c—myc表达对MCF-7细胞增殖的协同抑制作用

为了探讨增强p53、p21基因表达水平和降低c—myc基因表达水平对乳腺癌细胞MCF-7．增殖的协同抑制作用,以及这些基因对细胞产生效应时的相互关系,本研究中首先构建了正义的p53、p21和反义的c—myc 3种真核细胞表达载体,并根据析因实验设计三种载体不同剂量组合。按照组合用质粒转染细胞,然后对转染细胞的增殖抑制率进行检测,并采用金正均Q值法、单因素方差分析中的LSD法、聚类分析法等统计学方法对结果进行统计分析。结果显示,不同量的p53、p21反义c—myc对MCF-7细胞的增殖均有抑制作用,抑制的程度各基因间存在差异。在各基因组合中,p21与反义c—myc,p53与反义c—myc联用具有协同作用,对MCF-7细胞的增殖产生更强的抑制,而p53与p21之间未显示出协同作用。对三基因协同结果进行聚类分析后,发现第一类组合协同作用最明显,第九类组合的抑制率最高。由此推测,作为抑癌基因的p53或CDK抑制基因p21高表达,同时原癌基因c—myc表达受到抑制,可相互协同显著增强对MCF-7细胞增殖的抑制作用。