甲型H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段的克隆和表达

目的:分析比对甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)、聚合酶B2(PB2)和聚合酶A(PA)抗原的序列,克隆表达保守的和变异的表位抗原区段,为免疫学诊断试剂的研究提供候选抗原。方法:采用BioSun生物学软件比较新近公布的A/H1N1流感病毒和我国猪流感病毒浙江株NA、PB2和PA抗原序列,并预测筛选NA、PB2和PA抗原表位保守区段与变异区段,采用PCR逐步合成法合成NA、PB2和PA表位抗原区段基因序列,并利用原核表达载体pBVIL1进行克隆表达。结果:筛选的保守表位抗原区段和变异表位抗原区段为NA/135～180aa、NA/310～350aa、PB2/1～80aa、PA/41～90aa、PA/231～280aa和PA/341～400aa;获得6条表位抗原区段基因序列,且6条表位抗原区段均获得了高效表达,得到纯化后的抗原。结论:获得了A/H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段,为进一步研制特异的甲型流感病毒快速诊断试剂提供了抗原储备。     

山东省甲型H1N1流感病毒病原学及基因特性研究

在2009~2010年监测年度开展甲型H1N1流感病毒学监测并进行病原学分离鉴定,以及对血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)特性分析,研究其基因变异情况。采集了17 126份发热患者的鼻、咽拭子标本,采用逆转录实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)进行核酸检测,其中甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性4004份,总阳性率为23.38%。对阳性标本开展病毒分离,并对分离的甲型H1N1流感病毒的HA、NA基因序列进行测序。利用DNAStar软件对序列进行同源性分析发现与WHO推荐的疫苗株相比,山东省甲型H1N1流感流行株HA、NA基因同源性分别为96.9%~99.3%和99.1%~99.6%;利用Mega 4.0软件进行基因进化分析和氨基酸进化分析发现,与WHO推荐的疫苗株相比,山东省甲型H1N1流感流行株有21个血凝素基因的氨基酸发生替换,其中11个氨基酸位点位于抗原决定簇区,一个糖基化位点发生改变;有16个神经氨酸酶基因的氨基酸发生了替换,一个糖基化位点发生改变;未发生神经氨酸酶蛋白275位H→Y的替换。结果显示山东省甲型H1N1流感暴发流行株HA基因和NA基因均具有高度同源性,HA蛋白和NA蛋白均存在不同程度的氨基酸替换,部分流行株抗原决定簇和糖基化位点发生改变,所有病毒均对达菲类药物敏感。     

利用马赛克策略设计靶向神经氨酸酶抗原的广谱流感疫苗

季节性流感病毒仍对全球公共卫生安全构成巨大威胁,对老人、儿童以及免疫功能低下人群的危害尤其严重。疫苗接种是目前应对季节性流感疫情重要手段,然而由于抗原转换和抗原漂移,常出现疫苗株与实际病毒流行株的不匹配现象,因此迫切需要开发一种安全高效的广谱流感疫苗来对抗季节性流感病毒和潜在的流感大流行。抗原设计是研发新型疫苗的关键前提,我们利用马赛克（mosaic）遗传算法设计研发了一种具有广谱抗原表位覆盖率的靶向流感病毒神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）的新型抗原（Mosaic-NA）。该抗原在最大程度上涵盖了所有已报道甲型流感病毒的NA1蛋白与NA2蛋白序列中的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）抗原表位,并保留了天然蛋白空间构象。因此,这种新型抗原预期可有效诱导出靶向保守表位的CTL反应和抗体反应,从而为研发通用流感疫苗提供新思路和理论基础。     

利用马赛克策略设计靶向神经氨酸酶抗原的广谱流感疫苗

季节性流感病毒仍对全球公共卫生安全构成巨大威胁，对老人、儿童以及免疫功能低下人群的危害尤其严重。疫苗接种是目前应对季节性流感疫情重要手段，然而由于抗原转换和抗原漂移，常出现疫苗株与实际病毒流行株的不匹配现象，因此迫切需要开发一种安全高效的广谱流感疫苗来对抗季节性流感病毒和潜在的流感大流行。抗原设计是研发新型疫苗的关键前提，我们利用马赛克（mosaic）遗传算法设计研发了一种具有广谱抗原表位覆盖率的靶向流感病毒神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）的新型抗原（Mosaic-NA）。该抗原在最大程度上涵盖了所有已报道甲型流感病毒的NA1蛋白与NA2蛋白序列中的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）抗原表位，并保留了天然蛋白空间构象。因此，这种新型抗原预期可有效诱导出靶向保守表位的CTL反应和抗体反应，从而为研发通用流感疫苗提供新思路和理论基础。     

几株甲型流感病毒神经氨酸酶(NA)理化特性和抗原性的比较

以两株甲2型流感病毒株贵57-1、甘66-3(H2N2)和两株甲3型流感病毒株京科68-1、穗防74-315(H3N2)为代表株,测定温度、pH及金属离子对感染的鸡胚尿囊液病毒神经氨酸酶(NA)活性的影响,并用NA交互抑制试验检查贵57-1NA与穗防74-135NA之间的N抗原变异情况。 结果表明,在50℃加热30分钟4株病毒的NA活性仅下降原活性的10％以下;但56°C30分钟加热,两株甲2型病毒(H2N2)的NA活性明显下降,仅为原活性的12％以下;而两株甲3型(H3N2)则分别为原活性的34％及37％。根据Paniker和Tams等的报道,N2的活性对45℃及56℃加温比N1更稳定。似乎表明,变异着的NA抗原有越来越耐热的趋势。     

甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单抗杂交瘤细胞株的制备与初步鉴定

目的:建立具有高特异、高效价的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)单抗的杂交瘤细胞株。方法:以纯化的昆虫杆状病毒表达的甲型H1N1流感病毒HA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法筛选阳性克隆,经ELISA和Western blot分析单抗的特性和特异性。结果:获得6株甲型H1N1流感HA抗原特异单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗原肽库ELISA检测结果表明其中3株(1E12,3F12,1C11)单抗只与甲型H1N1流感HA抗原肽库反应,不与H5N1病毒HA抗原肽库反应;Western blot分析表明,单抗1B3只特异识别甲型H1N1流感HA抗原,而与其他季节性甲流病毒(H1,H3)及人禽流感H5N1病毒不反应。结论:所获杂交瘤细胞株特异性强,效价高,分泌抗体性能稳定,为分析甲型H1N1流感病毒抗原性位点、建立诊断试剂奠定了基础。     

禽流感病毒毒力与生态学选择

禽流感（Avian Influenza,AI;也有俗称为Bird Flu）是禽流行性感冒的简称,是由甲型流感病毒引起的一种禽类（家禽和野禽）的感染和（或）疾病综合征^[1]。甲型流感病毒具有16个血凝素亚型（Subtype）,分别为HA1～16;9个神经氨酸酶亚型,分别为NA1-9。与其他动物来源的流感病毒不同的是,从禽（鸟）来源的甲型流感病毒含有所有不同的HA与NA亚型,因此被认为禽（鸟）是甲型流感病毒的储存基因库。HA亚型与NA亚型的组合构成了甲型流感病毒的亚型联合（HANA）,即为血清型^[2]。     

一株2011年出现的季节性甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素基因特性的研究

本文通过比较2011年分离培养的1株季节性甲型H1N1流行性感冒(简称流感)病毒(A/Shanghai/1167/2011(H1N1))与历年季节性甲型H1N1流感病毒的血凝素(HA)基因,追溯该病毒的基因变异与来源,探讨该毒株的出现对流感防控工作的意义.采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增病毒的HA和神经氨酸酶(NA)片段,并进行测序;应用分子生物学软件对获得的序列进行分析,绘制基因进化树;同时,通过血凝抑制试验检测2011年下半年健康人群中该流感病毒的抗体水平.结果显示,A/Shanghai/1167/2011(H1N1)的HA基因序列与世界卫生组织(WHO)2007～2008年季节性甲型H1N1流感病毒疫苗株A/Brisbane/59/2007(H1N1)最接近,同源性达99.2%,与新型甲型H1N1流感病毒A/California/07/2009疫苗株同源性仅为72.4%.其HA基因裂解位点为PSIQSR↓GLF,尚未出现高致病性的分子特征.HA片段共编码557个氨基酸,有9个潜在的糖基化位点,序列与2009年前WHO疫苗株A/NewCaledonia/20/1999(H1N1)、A/SolomonIslands/3/2006(H1N1)和/Brisbane/59/2007(H1N1)相比,分别有15、12和4处不同,这些差异分布在Sa、Sb、Ca1、Ca2、Cb 5个抗原决定簇的氨基酸差异分别有5、5和2处.该毒株在健康人群血清的抗体阳性率为34.33%,几何平均效价(GMT)为10.38.A/Shanghai/1167/2011(H1N1)是2011年出现在上海地区的一个季节性甲型H1N1流感病毒毒株,其抗原变异与既往季节性甲型H1N1流感病毒相比不大,但在以A(H1N1)pdm09为主要流行株的年份检测到散在发生的既往季节性甲型H1N1流感病毒毒株应当引起重视,其在人群中的抗体水平较低,易引起流行,需要提高对类流感人群中此种毒株的持续监测.     

流行性感冒病毒重组的研究——Ⅰ.高产株和表面抗原重组株的选育

本文报告了甲型流感病毒重组高产株、血凝素单价抗原重组株及神经氨酸酶单价抗原重组株的选育和鉴定方法。实验证明利用灭活病毒和活病毒两株亲本株混合感染,在鸡胚系统中重组,经过抗血清中和选择,再经终末纯化,可以简便、快速而又准确地获得重组株。     

流行性感冒病毒重组的研究I．高产株和表面抗原重组株的选育

本文报告了甲型流感病毒重组高产株、血凝素单价抗原重组株及神经氨酸酶单价抗原重组株的选育和鉴定方法。实验证明利用灭活病毒和活病毒两株亲本株混合感染,在鸡胚系统中重组,经过抗血清中和选择,再经终末纯化,可以简便、快速而又准确地获得重组株。     

新发甲型H1N1流感病毒HA分子的变异分析

目的:从分子进化水平上分析流感的起源及发展问题,研究目前爆发的H1N1病毒的HA分子的变异行为.方法:以GenBank公布的甲型流感H1N1病毒血凝素(hemagglutinin,HA)核酸序列和我国及世界范围内近几年来报告的H1N1流感病毒HA的核酸及氨基酸序列为研究对象,利用CLUSTAL 1.83和NetNGlyc 1.0等生物信息学软件对HA核酸和氨基酸序列进行了比对分析;将其糖基化位点、氨基酸序列和抗原决定簇与以往流感病毒进行了比较.同时,还将人源和猪源甲型H1N1流感病毒的HA氨基酸序列进行了序列比对和系统发育分析.结果:最新爆发的甲型H1N1流感病毒的HA除了在60,259,453,512位点高度保守区域与之前爆发的流感病毒一致外,在249位点新出现1个"-NTT-"的糖基化位点.发现所有的甲型病毒的氨基酸序列在8个氨基酸位点均发生改变,而8个氨基酸位点位于6个抗原抗原决定簇上.结论:糖基化位点的增加,氨基酸位点的改变导致抗原决定簇的改变,即抗原性漂移现象,都成为引起其传染性改变的重要原因.     

云南省2009～2014年甲型H1N1流感病毒HA及NA基因特征分析

了解云南省2009~2014年甲型H1N1流感病毒的流行趋势,研究HA和NA基因进化特征。对云南省近6年来上报的流感监测病例数据进行病原谱总结,挑选出23株甲型H1N1流感毒株进行HA及NA基因分析。利用MEGA 5.0软件对测序结果构建进化树分析基因同源性。2009~2014年云南省共监测到4次甲型H1N1流感流行高峰,核酸检测结果中甲型H1N1流感占检出总量的28.8%。测序结果显示,HA与NA基因均分为3个类群,检测到一株具有H275Y突变位点的毒株。甲型H1N1流感是导致本省流感流行的重要亚型之一,2009~2014年间分离的毒株主要有Goup1、Gourp7和Gourp6三个支系,绝大部分甲型H1N1流感毒株仍对神经氨酸酶抑制剂敏感。     

A型流感病毒M2蛋白疫苗的研究进展

目前用于免疫人群的流感疫苗多为三价灭活疫苗,包含A型流感病毒H1N1亚型、H3N2亚型和B型流感病毒。多年来的实践表明,三价灭活疫苗是有一定保护效果的。但是,由于流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)经常发生抗原转变和抗原漂移,使其抗原性表现出很大的变异,所以根据流感疫情监测预测的疫苗株也很难产生最理想的保护效果。但流感病毒基质蛋白M2的膜外区氨基酸序列高度保守,有可能发展成为具有交叉保护能力的流感疫苗的候选抗原。该文就A型流感病毒基质蛋白M2疫苗的研究作一综述。1 A型流感病毒基质蛋白M2结构及功能流感病毒基因组RN…     

甲型流感病毒流行毒株检测和分型基因芯片的研制

【目的】研制一种可同时对甲型流感病毒H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2等5种流行亚型进行检测和分型的基因芯片。【方法】根据National Center for Biotechnology Information中Influenza Virus Resource数据库,针对H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2等5种亚型甲型流感病毒的HA和NA基因设计46条特异性寡核苷酸探针和1条质控探针,点制成基因芯片。利用通用引物扩增流感病毒HA和NA基因,使用Klenow酶对扩增产物进行荧光标记和片段化,将标记后产物和芯片杂交,清洗、扫描后根据荧光信号判定检测结果。用18株不同种属来源的甲型流感病毒分离毒株和186份咽拭子对芯片特异性、敏感性和临床应用进行初步评价。【结果】所有18株分离毒株均能被芯片准确检测并分型,芯片检测灵敏度能达约1×104个病毒基因拷贝。同时8份咽拭子检测结果为H1N1阳性,4份咽拭子为H3N2阳性。【结论】研究表明该芯片具有较高的特异性和灵敏度,可为甲型流感病毒的监测提供一种有效的方法。     

1957—1964年长春、沈阳、啥尔滨等地亚洲甲型流感病毒的抗原分析

本文分析了1957—1964年长春、沈阳、哈尔滨等地分离的1 6株亚洲甲型流感病毒间的抗原关系。结果表明：1964年分离的毒株的抗原性和1 957年所分离的是不同的。这种变异先在1960年引起,以后逐年不断地、轻微地进行。按照朱既明的假设,目前,亚洲甲型流感病毒可能已通过了“相对稳定”时期而进入了“量变”f对期。随着时间的进展,一株新的亚型病毒可能会产生。对这种可能情况进行观察是非常重要的。     

放射免疫沉淀技术在流感病毒单克隆抗体鉴定中的应用

本文报道了用放射免疫沉淀自显影技术,对流感病毒 A/洛阳/3/57(H_1N_1)单克隆抗体的鉴定工作。用流感病毒免疫 BALB/C 小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞(SPR/o)融合制备的单克隆抗体,此抗体经血凝抑制实验和神经氨酸酶抑制实验证明是对血凝素特异的。用蛋白 A—琼脂糖与单克隆抗体结合后,再与~(35)S 标记的病毒抗原结合,解析后,进行 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。放射自显影后,图谱呈现二条主带与 HA_1、HA_2的位置相符,即证明此单克隆抗体是对血凝素特异的。本文还就蛋白 A—琼脂糖对 IgG 的特异性结合及避免杂抗原带的出现等问题进行了讨论。     

一种含不同流感病毒血凝素抗原表位的核酸疫苗

流感病毒表面抗原血凝素( hemagglutinin,HA)是流感核酸疫苗重要的靶抗原,针对HA的保护性中和抗体主要由HA上的五个抗原表位诱导产生.在本文中,我们构建了一种以新甲型H1N1流感病毒HA1为骨架的含2个A/PR/8( H1N1)流感病毒HA抗原表位和3个新甲型H1N1流感病毒HA抗原表位的核酸疫苗,并在B...     

福建省甲型H1N1流感病毒基因特征研究

为了解福建省甲型H1N1流感病毒基因变异特征和规律,对2009~2012年福建省分离的14株甲型H1N1流感病毒进行了全基因序列分析。结果发现,所有的毒株均是典型的低致病性流感病毒,对金刚烷胺类药物耐药,对神经氨酸酶抑制剂敏感。所有毒株与A/California/07/2009(H1N1)疫苗株保持高度同源,8个节段基因同源性均在98.2%以上。相比之下,福建省2012年的流感毒株抗原变异程度较大,其中A/Fujiangulou/SWL1155/2012毒株HA基因发生11个氨基酸位点改变,其中H138R、L161I、S185T和S203T位点的变异分别涉及Ca、Sa和Sb抗原决定簇。监测显示,疫苗对福建省人群保护效果较好,但福建省2012年毒株相对疫苗株已经出现抗原漂移,应进一步密切关注其变异情况。     

广州地区新型H1N1流感病毒PB1-F2基因进化和变异分析

比较和分析2009～2011年广州地区分离到的甲型H1N1流感病毒PB1-F2基因和世界各地甲型H1N1流感病毒PB1-F2基因的变异情况,为该蛋白的功能和作用机制奠定基础。对分离自中国广州地区2009～2011年人类感染的17株新型H1N1和1株季节性H1N1流感病毒进行了PB1-F2基因克隆和序列测定,通过与GenBank数据库中68株人类新型H1N1和季节性H1N1流感病毒参考株的PB1-F2基因进行比对。结果表明,甲型流感病毒的PB1-F2基因进化树形成了2个不同的进化分支。全部2009～2011年新型H1N1流感病毒为一分支。广州地区PB1-F2基因与其它地区分离到的新型H1N1流感病毒具有高度的同源性,均为截短型变异。本实验室分离的1株季节性H1N1流感病毒也发生了第12位氨基酸截短突变。广州地区新型H1N1流感病毒PB1-F2截短蛋白与其它地区病毒相比未发生氨基酸变异,季节性H1N1流感病毒发现类似新型H1N1流感病毒PB1-F2的截短变异,提示新型H1N1流感病毒和季节性H1N1流感病毒PB1-F2可能发生早期重组。