定量PCR的荧光技术

荧光定量PCR是在普通PCR基础上,利用荧光技术对核酸进行绝对定量的一项新兴技术,其灵敏度高、特异性高、操作简便和定量准确,已被广泛应用于临床和科研中。为更好地发挥荧光定量PCR的优点,荧光技术领域的研发工作十分活跃。     

基于特异性PCR和荧光检测技术快速鉴定艾纳香

为建立快速准确的艾纳香分子鉴定方法。采取筛选艾纳香及其混伪品基因组DNA的提取方法,针对艾纳香特异性位点设计引物,优化PCR扩增条件,荧光检测扩增产物。结果表明碱裂解法更适于艾纳香基因组DNA的提取;叶绿体基因（tDNA）特异引物能特异性扩增艾纳香DNA,其扩增产物荧光检测呈绿色,混伪品无反应发生。试验结果显示该法简化了分子鉴定过程,省时节力,且结果准确可靠,可作为艾纳香植物和药材的鉴定方法。     

实时荧光定量PCR的应用和进展

实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量的目的,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已在动植物基因工程,微生物和医学领域中得到广泛应用。本文对实时荧光定量PCR技术的原理、优缺点及近年来新兴起的荧光探针的原理、优缺点进行了评述,重点及创新点是对实时荧光定量PCR技术在动植物基因工程,微生物和医学领域的应用进行了比较全面的综述,并对实时荧光定量PCR技术的普及应用及在基因诊断领域的前景做了进一步的展望。     

荧光定量PCR数据处理方法的探讨

real time RT-PCR通过直接检测指数扩增期的PCR产物来确定基因的初始模板量,是定量基因表达最灵敏的方法,其准确性取决于扩增效率以及数据的处理方法。目前最常用的两种分析荧光定量PCR实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量方法是通过标准曲线计算起始模板的拷贝数;相对定量方法则是比较处理过的样品和未处理过的样品目的基因之间的表达差异。而相对定量又有双标准曲线法,2^-△△α法以及动力学法。该文介绍了这些方法的推导、假设及其应用。     

16SrRNA荧光定量PCR法检测双歧杆菌

目的应用16SrRNA序列设计引物定量测定双歧杆菌。方法应用青春型双歧杆菌2627号作常规PCR扩增出的模板经系列稀释做荧光定量PCR,制作标准曲线;对青春型、长型、短型、婴儿型、两歧型、链型等6个种共15株双歧杆菌和大肠杆菌等10株其他细菌做荧光定量PCR,计算机通过与标准曲线比较给出定量结果;对青春型双歧杆菌2627号进行敏感性测定。结果15株双歧杆菌(10     

荧光定量PCR检测结核分枝杆菌Meta分析

目的系统评价荧光定量PCR(FQ-PCR)方法检测结核分枝杆菌的效果。方法按照系统评价的要求检索CBM、VIP、CNKI以及万方数据库等,获得20篇符合纳入标准的文献,对其进行Meta分析,并评价Meta分析结果的稳定性和发表偏倚。结果 FQ-PCR对照涂片染色、培养鉴定以及总数据的异质性检验P0.00001,采用随机效应模型进行Meta分析,其余的采用固定效应模型分析。FQ-PCR与涂片染色、培养鉴定、抗体检测等的总体效应Z值分别为7.76、5.00和7.34,P值均小于0.00001,差异具有统计学意义。总数据分析结果的合并OR=2.78,95%CI为1.93-4.01,总体效应检验,Z=5.49,P0.00001,差异具有统计学意义,固定效应模型OR值和95%CI(2.52[2.35-2.70])与随机效应模型比较接近,剔除小样本报道后的合并OR=2.93,95%CI为1.98-4.31,与剔除前的结果也比较接近。结论从现有的临床证据来看,FQ-PCR是检测结核分枝杆菌的有效方法,可推广应用与临床结核病辅助检测。     

快速检测伪狂犬病毒荧光定量PCR技术建立及应用

以伪狂犬病毒(PRV)保守的gE基因序列为参考,设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针,结合RotorGene检测系统,建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为1.0×102-1.0×107拷贝/μL,灵敏度达102拷贝/μLDNA,比常规PCR高10倍。检测的特异性明显高于常规PCR,同时避免了常规PCR因电泳造成的污染。应用该技术检测66例猪组织或鼻咽拭子样品,阳性42份,阳性检出率为63.6%(42/66)。与病毒分离培养、常规PCR相比较结果显示,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,该方法可用于猪场PRV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫。     

快速检测伪狂犬病毒荧光定量PCR技术建立及应用

以伪狂犬病毒(PRV)保守的gE基因序列为参考,设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针,结合RotorGene检测系统,建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术.该方法线形范围为1.0×102-1.0×107拷贝/μL,灵敏度达102拷贝/μLDNA,比常规PCR高10倍.检测的特异性明显高于常规PCR,同时避免了常规PCR因电泳造成的污染.应用该技术检测66例猪组织或鼻咽拭子样品,阳性42份,阳性检出率为63.6%(42/66).与病毒分离培养、常规PCR相比较结果显示,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,该方法可用于猪场PRV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫.     

实时荧光定量PCR技术综述

实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术。与传统PCR相比,实时定量PCR能够更加快速、灵敏,并有效地对核酸进行定量检测。     

荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用

荧光定量PCR技术是近些年来发展起来的一种核酸检测技术,它以灵敏度高、特异性强、重复性好、快速准确定量等特点被广泛应用于各个领域。现主要介绍荧光定量PCR技术在病毒、细菌、真菌和寄生虫4个临床微生物检测方面的应用进展。     

Vitek—AMS系统检测超广谱β—内酰胺酶的评价

目的：评价Vitek-AMS系统检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs)方法的敏感性和特性。方法：用Vitek－32仪器法、双纸片协同试验法检测45株ESBLs阳性和45株ESBLs阴性菌株,并将结果进行比较。结果：Vitek－32仪器法检出45株ESBLs阳性株中的43株,而双纸片协同试验法仅检出38株,45株ESBLs阴性株用两法检测均为阴性。Vitek－AMS仪器法检测ESBLs的方法敏感性为95．5％,特异性为100％,而双纸片协同试验法分别为84．4％和100％。结论：Vitek－AMS系统检测ESBLs的方法敏感性和特异性均优于双纸片同试验法,且操作简便,有条件的实验室可将其作为初筛ESBLs的首选方法。     

大豆花叶病毒种子传毒率测定方法的比较

用苗期症状观察和酶联免疫吸附试验(ELISA)两种方法检查了大豆种子内的大豆花叶病毒(sMV)的传毒率及带毒率,并对两种方法所得的结果进行了比较。带毒大豆种子产生的病苗,其症状主要有花叶、卷叶、叶脉束状、叶脉坏死、凸斑和单叶扭曲等类型。苗期症状观察得到的种子传毒率,与用ELISA法检查去种皮大豆种子的带毒率高度吻合,相关系数r=0.92(n=31),说明此两种方法检查种子传(带)毒率具有相同的生物学和病理学意义。 本文提出了种子“群体病毒浓度”的概念。“群体病毒浓度”=群体内病毒总量/群体内种子总数。38个处理组合和3,591粒种子逐粒用ELISA法检查表明,“群体病毒浓度”与该群体的种子传毒率呈正相关,r=0.93(n=38)。将种子群体作为一个整体用ELISA法检查的结果也证明,“群体病毒浓度”与种子传毒率呈直线相关。因此认为可以用ELISA法对种子群体直接进行测定来估计种子的传毒率。     

贝类派琴虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立

根据基因库中派琴虫和折光马尔太虫基因序列,设计了两对特异性引物和两条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测派琴虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对派琴虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;对派琴虫和折光马尔太虫不同浓度模板进行组合,该方法仍可有效地同时检测出这二种原虫。研究建立的派琴虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床上派琴虫和折光马尔太虫感染的检测。       

几种肥大细胞染色方法的比较

运用ABC—爱先蓝—PAS混合染色及PAP技术对大鼠肝、胃、肠及DAB诱发的大鼠肝癌中肥大细胞进行了染色对比实验,结果表明:Carnoy及福尔马林等固定液固定的组织内肥大细胞均能被爱先蓝染色成蓝色,其染色时间不同,该种染色方法可作为一种常规的染色方法,用于确定肥大细胞在组织中的分布及数量。ABC—爱先蓝—PAS混合染色方法及PAP技术均能准确、有效地确定肥大细胞(MC)性质。ABC—爱先蓝—PAS混合染色使结缔组织肥大细胞(CTMC)呈棕褐色,周边略蓝色。粘膜肥大细胞(MMC)则呈蓝色,通过不同颜色的显示,可清楚地将CTMC与MMC区分开来。PAP方法具更高的特异性。但有关的抗体来源缺乏,因此在无特异Ⅰ抗体的情况下,ABC—爱先蓝—PAS混合染色方法亦可视为鉴别两类不同性质MC的一种较为理想的方法。     

A COMPARATIVE STUDY OF THE OLFACTORY SENSITIVITY OF HUMANS AND RATS

Olfactory sensitivity of humans and rats to n-propanol, n-heptanol,benzaldehyde, isobutyln-butyrate, cyclohexanone and 1,4-dioxane(rats only), was determined. Similar results were obtained forboth species, and these compare favourably with those of otherworkers. Since the sensitivities of humans and rats varied fordifferent odorants in a similar manner, it is postulated thatthe mechanisms for detecting odors may be common to many vertebrates.It is proposed, in agreement with Adrian (1956), and Moultonet al. (1960), that the relative area of the olfactory epitheliumdoes not necessarily determine the sensitivity of an animal. ^*This paper reports research undertaken at the School of BiologicalSciences, Macquarie University, North Ryde, N.S.W., 2113, Australia,and the CSIRO Division of Food Research.     

不同DNA提取法对腺病毒和细小病毒PCR检测效果评估

分别利用硫氰酸胍(Guanidine thiocyanate,GuScN)抽提法、螯合树脂处理法和蛋白酶K-酚/氯仿抽提法从粪便样品中制备腺病毒DNA(dsDNA)或细小病毒DNA(ssDNA)然后进行PCR检测。结果显示硫氰酸胍抽提法、螯合树脂处理法能有效地去除粪便中影响PCR扩增的抑制物,提高PCR检测的敏感性,而传统蛋白酶K-酚/氯仿抽提法不能有效地去除PCR扩增的抑制物,影响PCR检测结果。在检测粪便中腺病毒时,硫氰酸胍、螯合树脂和蛋白酶-酚/氯仿抽提法分别允许检测5TCID_{50相似文献}   

洪湖碘泡虫SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)引起的鲫“喉孢子虫病”严重危害我国异育银鲫养殖。病原丰度是决定病害发生的最重要因素之一, 因此建立洪湖碘泡虫的定量检测方法, 不仅可用于异育银鲫“喉孢子虫病”的早期诊断, 也可应用于养殖系统中洪湖碘泡虫的定量监测, 为该病的暴发风险预警及防控措施的效果评价提供技术手段。研究根据洪湖碘泡虫的ITS基因序列, 设计合成一对特异性引物HHF/R, 建立了洪湖碘泡虫的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法, 并对该方法的特异性、灵敏性、重复性及应用性进行了验证。结果显示, 该方法能特异性检测出洪湖碘泡虫, 而与多涅茨尾孢虫、倪李碘泡虫、普洛宁碘泡虫、吴李碘泡虫之间无交叉反应; 最低检测限为3.02×101copies/μL, 灵敏性较常规PCR高出1000倍; 组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%。应用该方法可定量检出洪湖碘泡虫全生活史阶段, 包括鱼体内移行发育的前孢子阶段及养殖系统环境, 如池塘水样及底泥样品中分布的洪湖碘泡虫。因此, 所建立的洪湖碘泡虫SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性稳定, 可应用于异育银鲫全养殖阶段洪湖碘泡虫的定性、定量监测。     

BEER BITTERNESS DETECTION: TESTING THURSTONIAN AND SEQUENTIAL SENSITIVITY ANALYSIS MODELS FOR TRIAD AND TETRAD METHODS

Thurstonian modeling predictions were tested and confirmed for 3-AFC and triangle test methods, as well as for different versions of the tetrad test method, using judges who were required to discriminate bitterness in beer. Sequential Sensitivity Analysis predictions were also confirmed for 3-AFC/triangular methods but not for the tetrad method. It is hypothesized that memory effects might have interfered with the later prediction.     

RAPID PURIFICATION OF SALMONELLA DNA IN MINCED MEAT AND DETECTION BY REAL-TIME PCR

Four rapid and simple DNA purification and sample treatment protocols were evaluated for detection of Salmonella enterica in spiked minced meat, using a fluorogenic 5'nuclease (TaqMan) PCR assay in an ABI-Prism 7700 Sequence Detector. The detection limit with the single separation treatment of DNeasy was found to be 6–8 CFU in just 19 end-point fluorescence (C_t) values, while this was 22 C_t for a combination of DNeasy and BactXtractor. Extraction by DNeasy resulted in C_t <22, indicating a detection limit of <10 Salmonella cells per 25g, when the samples were inoculated with Salmonella before the overnight preenrichment. The method is currently being adapted to a BioRobot 3000 platform. However, the use of paramagnetic beads (DNA Direct) resulted in poor and variable detection limit.