组织纤溶酶原激活剂突变体(La-tPA)转基因鼠的建立

用羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５区５×１０３ｂ（１０３ｂ,旧称ｋｂ）为调控序列,构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体（Ｌａ－ｔＰＡ）载体．对５４０枚小鼠受精卵进行显微注射,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测,获得６只整合有人Ｌａ－ｔＰＡ的转基因小鼠,整合率为３２％．这为未来利用转基因动物生产Ｌａ－ｔＰＡ提供依据     

组织纤溶酶原激活剂突变体乳腺表达载体构建及在转基因鼠中表 …

通过ＰＣＲ方法从羊肝总ＤＮＡ中获得了羊－β乳球蛋白（ＢＬＧ）基因第一和第二内含子,以羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５’区５ｋｂ为调控序列,构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体载体。对５４０枚小鼠受精卵进行显微注射,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测,获得６只整合有人Ｌａ－ｔＰＡ的转基因小鼠,整合率为３２％。同时研究了转基因在小鼠体内的表达。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明,在一些转基因鼠乳     

组织纤溶酶原激活剂突变体乳腺表达载体构建及在转基因鼠中表达的研究

通过PCR方法从羊肝总DNA中获得了羊β-乳球蛋白(BLG)基因第一和第二内含子,以羊β-乳球蛋白基因(BLG)5′区5kb为调控序列,构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体(La-tPA)载体。对540枚小鼠受精卵进行显微注射,经PCR和Southern blot检测,获得6只整合有人La-tPA的转基因小鼠,整合率为32%。同时研究了转基因在小鼠体内的表达。Northern blot分析表明,在一些转基因鼠乳腺中表达出La-tPA。在基因鼠乳汁中检测出La-tPA的表达达6μg/mL。这为未来利用转基因动物生产La-tPA提供依据。     

组织纤溶酶活剂突变体在转基因小鼠乳腺中的表达

组织纤溶酶原激活剂（ｔＰＡ）是一种较理想的溶血栓药物,本研究采用其突变体－长效组织纤溶酶原激活剂（ＬＡｔＰＡ）的ｃＤＮＡ作为目的基因,将它插入羊β－乳球蛋白（ＢＬＧ）基因起始密码之前,使ＬＡｔＰＡ的转录、翻译受控于ＢＬＧ基因的５＇、３＇序列,再将所构建的ＢＬＧ－ＬＡｔＰＡ用显微注射方法建立转基因鼠,经点杂交筛选和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹鉴定,获得２只ＬＡｔＰＡ基因整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁中检测到有     

组织纤溶酶原激活剂突变体在转基因小鼠乳腺中的表达

组织纤溶酶原激活剂(tPA)是一种较理想的溶血栓药物,本研究采用其突变体——长效组织纤溶酶原激活剂(LAtPA)的cDNA作为目的基因,将它插入羊β-乳球蛋白(BLG)基因起始密码之前,使LAtPA的转录、翻译受控于BLG基因的5′、3′序列,再将所构建的BLG-LAtPA用显微注射方法建立转基因鼠,经点杂交筛选和Southern印迹鉴定,获得2只LAtPA基因整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁中检测到有溶纤活性的LAtPA表达,表达水平1.5μg/ml。在这两只转基因鼠的9只F1代子鼠中,有5只是阳性的,tPA表达水平维持在1～2μg/ml,BLGtPA融合基因整合到小鼠基因组,能稳定地遗传给子代。     

组织纤溶酶原激活剂突变体（La—tPA）转基因鼠的建立

用羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５’区５＊１０＾３ｂ（１０＾３ｂ,旧称ｋｂ）为调序列,构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体载体。对５４０枚小鼠受精卵进行显微注射,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测,获得６只整合有人Ｌａ－ｔＰＡ的转基因小鼠,整合率为３２％。     

转基因小鼠乳腺表达长效组织纤溶酶原激活剂

组织纤溶酶原激活剂(tPA)是一种较理想的溶血栓药物,本研究采用其突变体长效组织纤溶酶原激活剂(LAtPA)的cDNA作为目的基因,将其插入羊β-乳球蛋白(BLG)基因起始密码之前,使LAt-PA的转录、翻译受控于BLG基因的5′、3′序列,将此构建BLG-LAtPA用显微注射方法建立转基因鼠,经点杂交筛选和DNA印迹鉴定,获得2只LAtPA基因整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁检测到有溶纤活性的LAtPA表达,表达水平1.5μg/ml。在这两只转基因鼠的F1代子鼠中,9只中有5只是阳性的,tPA表达水平维持在1-2μg/ml,说明BLG-tPA融合基因整合到小鼠基因组,能稳定地遗传给子代。为今后利用牛、羊作为生物反应器表达LAtPA奠定了基础。     

小鼠输精管内转染法建立人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）乳腺定位？…

The most established methods for development of transgenic animals are the microinjection of DNA into the fertilized eggs, but it is still a procedure of certain complexity and high cost. Therefore, the idea of using sperm as a vehicle to carry exogenous DNA into eggs is very attractive, and there have been some successful reports. Though the methods are rather simple they sometimes have low reproducibility. To improve the technique we transinfected the spermatozoa in testicular duct, not in vitro, to produce mice which expressed human tissue plasminogen activator (tPA) in mammary gland. The results demonstrated that: (1) 5 transinfected mice mated 10 female mice in 10 days after operation, (2) 79 founders were developed and 42 survived, (3) using PCR to detect foreign DNA integrated into the genome of founders, 7 out of 42 founders were positive (16.67%), (4) The expression level of tPA was 48-80 ng/ml in the milk of 5 PCR positive founders and (5) the foreign DNA integrated into the genome was detected in 2 out of 4 1st offspring by PCR technique.     

La-tPA/G-CSF双转基因鼠的建立及在乳腺的表达研究

分别以小鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′区 2 .6kb和羊β 乳球蛋白 (BLG)基因5′区 5kb为调控序列 ,构建了乳腺表达人集落剌激因子 (G -CSF)及组织纤溶酶原激活剂突变体 (La- tPA)载体 .利用显微注射法分别建立了G -CSF和La -tPA的转基因小鼠 ,在获得G -CSF和La -tPA表达基础上 ,采用 2种转基因小鼠交配的方式 ,对后代仔鼠进行了双引物同步PCR检测 ,筛选并建立了La- tPA和G -CSF的双转基因鼠 ,研究了不同转基因在小鼠体内共表达的情况 .Northernblot分析表明 ,在一些双转基因鼠中表达出La- tPA和G -CSF .后代鼠的一些基本特征为 ,产仔数明显低于正常鼠 ,双转基因占 46 .1 %,雌雄比例基本正常 .双转基因鼠的建立为未来利用转基因动物生产多种蛋白质提供依据 .     

牛β-乳球蛋白基因调控序列指导组织型纤溶酶原激活剂在小鼠乳腺中的表达

用全长8.4kb的牛β－乳球蛋白基因（BLG）作为调控序列,用1.6kb的鸡溶菌酶MAR序列作为对抗转基因中位点效应的工龄,构建了组织型纤溶酶原激活剂（tPA）乳腺表达载体。对2300枚卵进行显微注射,以PCR和Southern-Blot检测,在170只出生小鼠中获得9只整合有牛BLG－tPA融合基因的转基因小鼠,并在转基因小鼠乳汗中检测到tPA r itd ntg ,tPA的表达水平最高达到12μg/mL。整合的小鼠基因组中的牛BLG－tPA融合基因能稳定地遗传给子代。     

人G—CSF基因组基因的克隆及其在转基因小鼠乳腺表达的研究

采用ＰＣＲ方法以正常中国人脐带血提取总ＤＮＡ为模板,扩增出１．５Ｋｂ的粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）基因组基因,序列分析证实其正确性,将其插入小鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的起支密码子ＡＴＧ臆的ＫｐｎＩ位点,使其受控于２．６ｋｂ的ＷＡＰ调控序列,从而构建乳腺表达载体ｐＷＧＧ。回收经ＥｃｏＲＩ酶切后的８．７ｋｂ片段用于显微注射,共注射１２００枚受精卵,移植至受体３４母鼠,产生仔鼠８５只,经ＰＣＲ检测     

人尿激酶原乳腺定位转基因小鼠的建立

应用大鼠β乳酪蛋白基因的上游调控序列和人尿激酶原ｃＤＮＡ构建成功了乳腺定位表达载体．用显微注射的手段导入到受精卵的雄前核,从注射的３００枚受精卵中,１４０枚被移植到９只假孕的受体小鼠．结果从获得的子一代小鼠中,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实,有３只转基因阳性的小鼠．     

转基因动物乳腺生物反应器相关技术及研究进展

转基因动物乳腺生产人类重组蛋白人血清白蛋白(h SA)、人纤维蛋白原(h FIB)、人蛋白C(h PC)、人凝血因子(h F-Ⅷ)和(h F-Ⅸ)等具有较高市场潜力,使其在医学领域获得广泛应用。对转基因动物乳腺生物反应器的优势、目的基因选择、载体构建、基因工程技术、重组蛋白在肿瘤治疗上的应用、当前困境和未来前景等方面进行较为全面的综述,以期能有助于转基因动物生物反应器的研究。此外较详细地探讨了利用CRISPR-Cas基因打靶技术生产高表达量的人类重组蛋白的可能性。     

转基因小鼠乳腺上皮细胞的体外培养及其对催乳素反应的研究

实现转基因生物乳腺反应器对外源蛋白的高效表达是目前生物制药亟待解决的难题。催乳素对泌乳期乳蛋白的合成与分泌具有重要的调控功能。通过转基因小鼠乳腺上皮细胞模型的建立,研究催乳素如何调控乳蛋白的表达,为提高乳腺反应器高效表达外源蛋白提供技术及理论支撑。应用机械破碎及胶原酶消化法,经差速贴壁纯化,成功培养含人转铁蛋白基因的小鼠乳腺上皮细胞,细胞上清液中检测到人转铁蛋白表达。细胞经牛催乳素诱导后人转铁蛋白的表达水平明显升高。利用转基因小鼠乳腺上皮细胞模型,可以进行催乳素和环境因素等对乳腺上皮细胞合成及分泌蛋白能力影响的研究。     

乳腺特异高表达人促红细胞生成素转基因奶山羊的制备

目的制备乳腺特异性高表达人促红细胞生成素（hEPO）转基因奶山羊。方法采用牛β-乳球蛋白基因（BLG）调控元件和hEPO全长编码序列基因组DNA构建真核表达载体,应用受精卵原核注射的方法制备hEPO转基因山羊。结果在原核注射获得的188头羔羊中,经Southern blot法检测有4头羊含有hEPO基因,其中3头为母羊,1头公羊于出生后20d死亡;3头转基因母羊hEPO基因的拷贝数分别为1、10、2;Western blot检测结果显示转基因羊乳中的hEPO分子质量为32kDa;MTT法检测结果表明,在泌乳10d的3只转基因羊乳汁中,每毫升乳汁中hEPO活性分别达到1.17×10^2IU、1.90×10^4IU、1.91×10^4IU。结论牛BLG能够调控hEPO基因在山羊乳腺中高表达,为实现其他药用蛋白在山羊乳腺中表达奠定了基础。     

转基因小鼠中外源基因部分内含子序列的缺失及其对转录的影响

利用PCR扩增及PCR测序在显微注射法产生的转基因小鼠中发现,整合在小鼠染色体上的肌球蛋白轻链2启动子(myosinlightchain2promoter,MLC2)-糜酶(chymase)外源融合基因存在两种形式,一种为全长的融合基因,另一种在糜酶结构基因的第一内含子中缺失了213bp的序列。RT-PCR结果表明,缺失了部分内含子序列的外源融合基因不能在转基因小鼠心脏中表达.而全长的外源融合基因则能较高水平地表达,竞争性PCR定量实验表明在200ng心脏总RNA反转录产物中约含5.05(±1.38)×106个糜酶cDNA分子。上述结果表明,糜酶结构基因的第一内含子可能对MLC2-糜酶基因的表达具有调控作用。     

Simple Method of Zygosity Identification in Transgenic Mice by Real-time Quantitative PCR

To determine zygosity in transgenic (Tg) mice, a new technology, real-time quantitative PCR, has recently been introduced in transgenic research to overcome several drawbacks (time-consuming, specialized techniques and/or ambiguity in the results) of previously established methods, for example, Southern blot hybridization, dot blot hybridization, fluorescence in situ hybridization (FISH), etc. However, the previous real-time quantitative PCR method still possesses several drawbacks, for example, it needs two sets of primers/probes and the complicated setting up of appropriate conditions, both of which are expensive and remain time-consuming. We therefore developed an improved real-time quantitative PCR system for determination of zygosity, which is easy, rapid and less expensive, because the technique needs only two experimental processes: estimation of DNA concentration and CYBR Green PCR. We found that homozygous, hemizygous and non-Tg animals could easily be distinguished among F1 littermates in crosses of hemizygous EGFP- and DsRed2-Tg mice. Our improved method will be applicable to any Tg mouse strains, when a primer set is matched to the corresponding transgene.     

乳腺生物反应器特异高效表达载体的构建

乳腺生物反应器具有广阔的开发前景,而提高目的基因的表达量是该领域一个重要的研究课题。因此,选用强的非特异性启动子pCAG,而不是乳腺特异性启动子来实现高效表达;通过Cre/loxP系统和山羊β-乳球蛋白启动区（pBLG）表达Cre重组酶来实现载体的自删除以达到乳腺特异表达的目的。方法：构建含PolyA终止信号的Cre乳腺特异表达元件PolyA-pBLG-cre,插至强启动子pCAG驱动的报告基因lacZ表达载体中,构建成乳腺特异表达载体pCBCZ（pCAG-loxP-PolyA-pBLG-cre-loxP-lacZ）。转染细胞实验结果：PCR鉴定确认pCBCZ载体在小鼠乳腺上皮细胞（HC11）中发生Cre-loxP同源重组。X-Gal染色表明载体能驱动lacZ在HC11细胞中高效表达β-半乳糖苷酶,而在NIH 3T3细胞中仅少量表达。结论：构建的pCBCZ载体能高效驱动外源基因在乳腺细胞中表达,且具有较好的乳腺特异性,为研发乳腺生物反应器表达载体提供新的方法。