小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western印迹检测蛋白表达.结果 pEGFP-Hoxa11重组质粒构建成功.构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11能在CHO细胞中有效表达.结论 成功构建了共表达Hoxa11和EGFP的真核表达载体,并能在CHO细胞中有效表达.为进一步研究Hoxa11的功能提供实验基础.     

大熊猫FOXL2基因的克隆、序列分析及表达

从大熊猫基因组中克隆了FOXL2基因,并对其进行序列分析及原核表达和真核表达.将FOXL2编码区序列克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达出FOXL2重组蛋白.成功构建了真核表达载体FOXL2-pcDNA3.1/V5-His C,并通过脂质体介导转染HEK293细胞,Western blot检测FOXL2蛋白表达.SDS-PAGE分析表明,FOXL2重组蛋白在诱导4h后表达量达到峰值,其大小约为58.9 kDa,Western blot分析结果显示重组蛋白能够被抗His单克隆抗体特异性识别.FOXL2基因的克隆及其表达为进一步进行FOXL2的活性检测以及应用研究奠定了基础.     

双效表达载体的构建及其U6启动子的功能效率鉴定

利用pBudcE4.1双表达载体构建shRNA与蛋白共表达载体,为双效疫苗的研制提供新的研究思路.以含U6启动子的载体为模板,PCR扩增得到U6启动子,用其置换载体pBudcE4.1内的CMV启动子的核心部分构建shRNA与蛋白共表达载体.用干扰绿色荧光蛋白表达的方法鉴定重组载体中的U6启动子能否启动shRNA的表达.经PCR扩增、双酶切鉴定及DNA测序证明成功构建了载体pBudcE4.1-U6.用干扰载体pBudcE4.1-U6-eGFPshRNA与含eGFP的载体共转染293T细胞后,荧光显微镜观察显示eGFP的表达量下降;流式细胞仪检测细胞的转染效率降低.研究结果证明U6启动子正常发挥作用. 成功构建RNAi与蛋白共表达载体,为利用该载体研制动物双效疫苗奠定了基础.     

布鲁氏菌L7/L12蛋白的基因克隆与原核表达

本研究对羊布鲁氏菌L7/L12蛋白进行了表达和纯化。首先从布鲁氏菌M5基因组中克隆L7/L12目的基因片段,连接至pMD-19T载体,转化入E.coli DH5α感受态细胞,PCR鉴定及测序鉴定正确后对其进行双酶切,构建重组质粒pGEX-6P-1-L7/L12并利用E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。羊布鲁氏菌L7/L12基因片段大小为375 bp。SDS-PAGE检测蛋白大小为13 kD,与预测值相符。Western blotting方法检测其免疫学特性。实验结果表明,成功构建了pGEX-6P-1-L7/L12原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了L7/L12重组蛋白,Western blotting法检测其具有免疫反应。本实验为下一步研究蛋白功能及布鲁氏菌新型疫苗的研制提供了实验基础。     

人FGF21原核表达载体的构建及重组蛋白表达

构建人FGF21(fibroblast growth factor,FGF)cDNA的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。提取人肝脏总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,构建其T载体进行保存。再构建重组原核表达载体pET-28a(+)-h FGF21,重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,在IPTG诱导下得到可溶性表达,采用亲和层析法纯化表达产物后,进行Western blot鉴定。成功构建重组质粒pET-28(+)-hFGF21,对其进行可溶性表达后成功纯化出his-hFGF21,经Western blot鉴定该融合蛋白可与FGF21抗体特异性结合。成功构建pET-28(+)-hFGF21,并可溶性表达his-hFGF21蛋白。     

B19病毒XA株VP1独特区真核表达系统的建立及鉴定

目的:克隆B19病毒XA株VP1u基因,构建真核重组表达载体.方法:从已构建好的B19病毒XA株原核表达载体中获得VP1u基因,将其克隆入真核表达载体plRES2-EGFP中,经酶切鉴定并测序验证后,获得真核表达载体plRES2-EGFP-VP1u.将其转染至HeLa细胞,提取细胞总蛋白,用Western blot技术检测VP1u蛋白的表达.结果:成功构建了携带人B19病毒VP1u基因的真核表达载体plRES2-EGFP-VP1u,荧光显微镜下可见pIRES2-EGFP-VP1u转染HeLa细胞后表达EGFP蛋白而发出绿色荧光,Western blot证明VP1u蛋白在HeLa细胞中表达.结论:成功构建了携带人B19病毒VP1u基因的真核表达载体plRES2-EGFP-VP1u并在HeLa细胞中正确表达,为今后B19病毒VP1u基因疫苗的研究奠定基础.     

淋球菌nspA和大肠杆菌ltB融合基因的构建、表达及鉴定

通过基因工程的方法构建奈瑟氏淋球菌表面蛋白A(Neisseria gonorrhoeae surface protein A,nspA)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin,ltB)融合基因的原核表达载体,对其进行表达与鉴定,为后续融合蛋白LTB-NspA的生物活性分析及其作为淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定基础.用PCR法从标准菌株分别扩增出nspA、ltB基因,用重组PCR法通过接头将ltB与nspA融合,将其插入pET-30a中,转入BL21中表达.经测序、SDS-PAGE和Western blot分析,证实成功构建了1tB-nspA融合基因的原核表达载体,并在BL21中表达.ltB-nspA融合基因的成功表达,为进一步研究其生物活性及淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定了一定基础.     

粉尘螨1类变应原T细胞表位重组蛋白的构建及鉴定

目的构建Der f1的T细胞表位融合肽基因的原核表达载体并表达鉴定。方法利用基因工程方法构建Der f1的T细胞表位融合肽嵌合基因,命名为Der f1T,并插入到原核表达载体p ET28a(+)中,形成重组原核表达载体p ET28a(+)-Der f1T,进行双酶切和测序验证后的阳性克隆转化到E.coli BL21(DE3)诱导其表达。制样进行SDS-PAGE分析表达产物,再进行纯化,并Western bloting鉴定表达的蛋白。ELISA法测定重组蛋白对粉尘螨过敏的患者血清Ig E抗体的结合能力。结果双酶切和测序结果说明原核表达载体p ET28a(+)-Der f1T构建成功;SDS-PAGE说明Der f1T诱导且纯化成功;Western bloting进一步说明Der f1T蛋白纯化成功;ELISA试验结果说明Der f1T对粉尘螨过敏的患者血清中Ig E结合能力与Der f1相比明显下降(P0.05)。结论成功表达Der f1的T细胞表位重组蛋白,为后续粉尘螨过敏患者提供特异性免疫治疗奠定基础。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprⅠ原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的:构建并鉴定铜绿假单胞菌(Pa)外膜蛋白OprⅠ重组质粒p GEX-OprⅠ,研究该重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达。方法:PCR扩增OprⅠ抗原编码基因并将其定向克隆至原核表达载体p GEX-1λT,构建重组质粒p GEX-OprⅠ;将p GEX-OprⅠ电穿孔转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹分析并鉴定表达产物。结果:扩增出194 bp的OprⅠ抗原编码基因;双酶切和PCR鉴定证实OprⅠ基因克隆入p GEX-1λT,并且p GEX-OprⅠ成功转入大肠杆菌BL21(DE3);SDS-PAGE显示重组大肠杆菌BL21(p GEX-OprⅠ)的表达产物为相对分子质量约32 000的GST-OprⅠ融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的20%;Western印迹证实该融合蛋白能被Pa感染的鼠血清特异性识别。结论:构建了重组质粒p GEX-OprⅠ,其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达具有抗原性的融合蛋白。     

心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的CREG 蛋白表达载体 的构建及鉴定

目的:构建心肌特异性α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)启动子启动E1A基因阻遏子(cellular repressorof E1A-stimulated genes,CREG)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合的真核表达载体。绿色荧光蛋白作为报告基因,方便在心肌细胞中直接观察CREG蛋白的表达,为心肌特异性转CREG基因动物模型制备提供载体。方法:用BamH I和EcoR I双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1中,构建pCREG-EGFP-N1;根据Genebank中公布的α-MHC基因的启动子序列,人工合成pUC57-α-MHC启动子基因序列,经Ase I和Nhe I双酶切得到启动子α-MHC,亚克隆入pCREG-EGFP-N1中替代原CMV启动子,构建pα-MHC-CREG-EGFP-N1,测序鉴定。用脂质体法将该质粒转染体外培养的小鼠原代心肌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。结果:成功构建pα-MHC-CREG-EGFP-N1质粒,酶切及测序结果正确;成功转染入原代培养小鼠心肌细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。结论:重组质粒pα-MHC-CREG-EGFP-N1体外转染入原代培养小鼠心肌细胞后,目的基因能够在心肌细胞中有效表达,检测方法简便可靠,为下一步建立心肌细胞特异性表达CREG的过表达转基因小鼠、深入探讨CREG在心肌疾病发生中的生物学功能研究奠定了基础。     

大鼠D-双功能蛋白基因原核表达载体的构建及表达

利用原核表达系统构建大鼠D-双功能蛋白表达载体。设计基因拼接引物,通过RT-PCR合成DBP基因cDNA序列,将酶切、纯化的DBP基因与经相同处理的表达载体pET-28 a相连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子。将通过酶切及序列分析鉴定阳性的重组子质粒转入感受态大肠杆菌BL21-gold表达菌中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。结果显示,成功获得了包含DBP基因的双链cDNA序列,酶切、序列分析及Western blotting证实成功构建了DBP基因的原核表达载体。通过原核表达系统,DBP蛋白以包涵体形式产生,复性后可获得高表达的目的蛋白。     

狂犬病病毒糖蛋白基因在原核细胞和真核细胞中的表达

狂犬病病毒糖蛋白(RVGP)是该病毒5种结构蛋白中与抗原性有关的重要蛋白,它能刺激宿主的免疫系统产生中和抗体,促进机体产生细胞毒性T细胞,并能抵抗病毒的攻击。 将RVGP基因cDNA插入原核高效表达载体pET-17b和pET-17b2的T7启动子下游,构建了重组表达质粒pET-17bgp和pET-17b2gp。SDS-PAGE、Western印迹检测表明,RVGP在表达质粒转化E.coli BL21(DE3)、经     

牛γ-干扰素在大肠杆菌中的表达及抗原性鉴定

目的在大肠杆菌中高效表达牛γ-干扰素（bovine interferon-γ,BovIFN-γ）,并对其生物活性进行初步鉴定。方法依据GenBank上基因序列人工合成BovIFN-γ基因,PCR方法扩增该基因,将其插入PET-28a载体构建原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21中,在IPTG诱导下表达BovIFN-γ,并进行Western blot鉴定。Ni-NTA亲和层析法和电洗脱方法纯化表达的重组蛋白,用Western blot和商品化的BovIFN-γ检测试剂盒进行重组蛋白的抗原性检测。结果成功构建了BovIFN-γ原核表达载体PET-28a-BIFN-γ,并在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的32%,表达产物主要以可溶性形式存在于菌体裂解液上清中;重组蛋白可与BovIFN-γ单克隆抗体反应,Ni-NTA亲和层析法纯化的重组蛋白抗原活性比电洗脱方法纯化的抗原活性高。结论在大肠杆菌中成功表达了可溶性的BovIFN-γ蛋白,可与BovIFN-γ单抗发生反应,纯化的重组蛋白具有良好的反应原性。     

Mpl与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达

目的:探索Mpl与绿色荧光蛋白GFP基因共同转粢哺乳动物细胞NIH3T3的方法.方法:采用PCR方法将GFP基因与Mpl基因构建融合荧光蛋白的真核表达载体,用脂质体介导转染NIH3T3细胞和筛选稳定细胞系,使用荧光显微镜方法和Westernblotting检测转染效果.结果:利用PCR方法有效扩增了Mpl基因,构建了融合荧光蛋白的真核表达载体,序列分析表明所构建的含Mpl基因的质粒与设计相同,使用荧光显微镜方法和Western blotting检测Mpl融合绿色荧光蛋白表达载体成功转染NIH3T3细胞.结论:成功构建了Mpl荧光表达载体,融合基因可以在NIH3T3细胞中稳定表达,为进一步研究Mpl的生物学活性及其与hNUDC蛋白相互作用提供了重要的理论依据.     

应用RNA干扰技术调节大鼠c-jun基因的表达

目的:应用RNA干扰(RNAi)技术调节大鼠c-jun基因在Cos-7细胞中的表达.方法:分别构建大鼠c-jun基因的RNA干扰载体和真核表达GFP(绿色荧光蛋白)载体,将两者共转染Cos-7细胞,镜下观察大鼠C-Jun-GFP融合蛋白的表达,应用Western blot方法检测抑制效率.结果:酶切和测序结果表明,大鼠c-jun基因的RNA干扰载体和真核表达GFP载体构建成功,镜下及Western blot共转染结果均显示随着RNA干扰载体浓度的增加C-Jun-GFP融合蛋白表达量逐渐减少.结论:在Cos-7细胞中应用RNAi技术成功调节大鼠c-jun基因的表达.     

人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的：构建人P2X7基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达P2X7分子的HEK293细胞株。方法：以人脑组织P2X7cDNA为模板扩增出P2X7基因,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1/P2X7。用X-fect试剂盒将重组质粒转染HEK293细胞,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达P2X7-EGFP细胞株。经流式细胞仪、Western blot和激光共聚焦显微镜检测,了解人P2X7在HEK293细胞中的表达水平及细胞内定位。结果：重组质粒pEGFP-N1/P2X7构建正确,建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系。Western blot和流式细胞仪检测证实,P2X7在HEK293细胞系中成功表达,激光共聚焦显微镜检测显示P2X7-EGFP定位在细胞膜上。结论：重组载体pEGFP-N1/P2X7构建成功并建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系,为进一步研究P2X7离子通道结构和功能奠定基础。     

小鼠紧密连接蛋白ZO-2 真核表达载体的构建和表达

目的:克隆小鼠紧密连接蛋白ZO-2(zonula occludens protein2)基因构建其真核表达载体,并验证其在293T细胞系中的表达,为进一步研究其功能奠定基础。方法:从小鼠淋巴结来源的cDNA中分三段分别扩增,通过基因克隆方法获得紧密连接蛋白ZO-2基因全长,连接至pMD-18T载体中,酶切测序正确后,插入pEGFP-C2载体中,构建真核表达载体pEGFP-C2-ZO2。酶切正确后,瞬时转染入293T细胞中,48h后荧光显微镜观察其绿色荧光GFP融合蛋白的表达,并用Western blot检测其在转染细胞中的蛋白水平表达。结果:通过酶切鉴定和测序结果证明成功克隆了ZO-2基因,western blot结果表明成功构建了真核表达载体pEGFP-C2-ZO2。结论:小鼠紧密连接蛋白ZO-2基因的获得和真核表达载体pEGFP-C2-ZO2的成功构建为下一步研究其生物学功能奠定了基础。     

人α防御素2真核表达载体的构建及表达

目的:构建人α防御素2(α-HNP2)真核表达载体pc DNA3.1/myc-His(+)/α-HNP2,并实现其在CHO细胞中的表达,初步鉴定表达蛋白的抑菌活性。方法:以PBMC细胞总RNA为模板,利用RT-PCR法,扩增得到α-HNP2基因,构建真核表达载体pc DNA3.1/myc-His(+)/α-HNP2,脂质体法转染CHO细胞,G418筛选稳定表达的阳性克隆。用RT-PCR和Western blot检测α-HNP2蛋白的表达,同时检测表达产物的抑菌活性。结果:经PCR、酶切和DNA测序分析表明重组载体构建成功,并在CHO细胞中表达融合蛋白,琼脂平板扩散实验结果表明融合蛋白在大肠杆菌平板上形成明显抑菌圈。结论:CHO细胞中表达有活性的融合蛋白α-HNP2,为进一步的实验研究奠定了基础。     

利用载体介导小干扰RNA诱导RSRC1基因沉默

目的：设计并构建人RSRC1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人RSRC1基因的cDNA序列为靶标,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,并将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒,测序正确后将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过Western blot和荧光分析检测其抑制效果。结果：重组体测序成功后,Western blot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性RSRC1表达;将siRNA重组质粒和带GFP标签的RSRC1共转染293T细胞,荧光显微镜下GFP的亮度明显减弱。结论：获得了2条人RSRC1siRNA真核表达载体,均能有效地抑制RSRC1基因表达。     

盐藻小G蛋白DsRab的原核表达及纯化

前期对盐藻小G蛋白基因DsRab研究表明,在盐胁迫诱导下该基因转录水平明显提高。为进一步研究该蛋白在盐藻耐盐机制中的作用,PCR扩增DsRab的开放阅读框(ORF),并将其克隆至带有GST标签的原核表达载体pGS-21a,得到重组表达载体pGS-21a-DsRab。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并优化诱导表达条件,利用GST-SefinoseTM Kit进行纯化,用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明,成功构建了重组表达载体pGS-21a-DsRab,SDS-PAGE结果显示得到的蛋白与预期分子量相符,并且纯度较高;Western blot检测结果初步证明该融合蛋白为GST-DsRab。