反义RNA抑制存活素基因的表达对HeLa细胞的影响

为研究存活素（survivin)基因在肿瘤细胞中的应用,通过RT-PCR从HeLa细胞中克隆得到存活素cDNA的编码区,将其反向克隆到可诱导型表达载体pHC中,得到存活素反义RNA表达的载体pHSC,通过脂质体的介导,将pHSC导入HeLa细胞中,经C418（800nmol/L)筛选获得可以诱导表达存活素反义RNA的稳定细胞株HeLa-pHSC。获得的细胞株在2mmol/LZn^2 的诱导下,可以表达存活素反义RNA,从而抑制存活素基因的表达,此时HeLa细胞的增殖受到抑制,对化疗药物的敏感性增加,在G2/M期可以减缓细胞周期的进行性,这表明存活素对维持肿瘤细胞的增殖以及细胞周期的进行具有非常重要的作用。     

反义RNA对人胃癌细胞生长抑制及恶性表型的阻断作用

ｒａｓ原癌基因的点突变是人胃癌发生发展的重要机理之一。利用能表达ｃ－Ｈ－ｒａｓ癌基因反义ＲＮＡ的质粒,导入人胃癌细胞系ＢＧＣ－８２３,研究了ｒａｓ癌基因反义ＲＮＡ对人胃癌细胞生长及恶性表型的作用,结果表明,ｃ－Ｈ－ｒａｓ反义ＲＮＡ可引起ＢＧＣ－８２３生长速率及形态的变化,在半固体培养基中细胞集落形成能力减弱,部分也抑制了ＢＧＣ－８２３在裸鼠体内的致瘤性。ｃ－Ｈ－ｒａｓ反义ＲＮＡ对其ＲＮＡ的过量表达     

红细胞分化相关因子EDRF1的反义RNA下调蛋白激酶C—αmRNA的表达

为了研究通过功能筛选得到的一个新的红细胞分化相关的全长cDNA（命名为EDRF1）的功能,选择K562细胞作为模型细胞来观察反义EDRF1表达对细胞功能的影响。通过快速构建,同时得到了正向和反向插入片段的真核表达载体pcDNA3－EDRF1－S（sense）及pcDNA3－AS（antisense）,并通过改进的LipofectAMINE细胞转染和G418筛选,得到了稳定性表达的细胞株,进行基因组PCR鉴定,证明了转染的高效性。Northem Blot试验的结果表明,反义载体转染的K562细胞中,EDRF1在mRNA表达水平上受到下调,提示EDRF1反义DNA的表达可能抑制了EDRF1mRAN的正常转录。进一步,γ－珠蛋白和PKC－α的表达在反义构建质粒转染K562细胞中的表达均受到下调,这可能传递了红细胞分化的负反馈信号,从而抑制了珠蛋白的合成。     

反义RNA抑制人黑色素瘤细胞表面粘附分子CD44的表达及抑瘤效应

将细胞表面粘附分子ＣＤ４４Ｓ的ＣＤＮＡ反向插入到真核细胞表达载体ＰＭＡＭｎｅｏ－ＣＡＴ和ＭＭＴＶ－ＬＴＲ启动下游,构成ＣＤ４４Ｓ的反应ＲＮＡ载体,将其用电击法导入ＣＤ４４的人黑色素瘤细胞系ＨＭＭ２３９,转录出的反义ＲＮＡ能不同程度地换制ＨＭＭ２３９表面ＣＤ４４的表达,ＣＤ４４的表达被抑制后,瘤细胞与透明质酸的结合力下降,细胞的体外生长速率不受影响,将其接种裸鼠皮下,发现其致瘤性明显降低。     

反义RNA研究新进展

近年来,人们不断发现原核生物和真核生物中自然存在的反义RNA,这可能揭示另一个新的基因调控方式。 反义RNA通过碱基配对,特异性地与mRNA结合,阻止mRNA的翻译,从而抑制细胞中内源性或外源性基因的表达。因此,反义RNA技术为基因表达的功能研究以及基因定位和表达量检测提供了一种比常规遗传分析更为有效的方法,也为肿瘤病、病毒病等预防和治疗提供了可能途径。     

鸟氨酸脱羧酶基因反义RNA对肝癌细胞HepG2的影响

目的：探讨鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase,ODC）基因反义RNA对肝癌细胞HepG2的影响。方法：构建ODC反义RNA的真核表达质粒,将此质粒转染HepG2细胞后,RT-PCR和Western印迹法筛选ODC表达抑制的细胞株。以此细胞株为模型,分析ODC反义RNA对细胞生长、细胞周期和对抗癌药物米托蒽醌敏感性的影响。结果：成功构建ODC反义RNA真核表达载体并获得稳定低表达ODC的肝癌细胞株Hr1。与对照细胞相比,ODC低表达引起HepG2细胞生长抑制,72h生长抑制率为31%;流式细胞术检测细胞周期发现,Hr1G1期细胞数（56.2%）显著性高于对照（48.2%）,而S期细胞（25.5%）则显著性低于对照（34.9%）,提示ODC低表达导致G1期阻滞;用米托蒽醌（100μg/L）处理两种细胞后发现,Hr1对药物的敏感性显著性高于对照细胞,处理48h后药物对HepG2和Hr1的抑制率分别是33.4%和60.6%,72h后的抑制率分别是60.8%和83.8%。结论：ODC反义RNA能抑制肝癌HepG2细胞生长,在抗肿瘤治疗中具有潜在的临应用价值。     

过表达微小RNA miR-125b对人胚胎干细胞增殖的影响

目的:通过在人胚胎干细胞(hESC)中有效转染微小RNA miR-125b的真核表达载体,研究过表达miR-125b对hESC增殖的影响。方法:将在无饲养层上培养至第3 d,克隆融合达70%的hESC用Accutase酶消化为单细胞,然后用LipofectAMINE2000对hESC单细胞转染pHRS-1cla-miR125b-CMV-EGFP载体及其对照pHRS-1cla-CMV-EGFP载体,通过实时定量PCR对转染后细胞中成熟miR-125b的表达进行检测;进一步进行细胞计数和克隆计数,对miR-125b表达上调的hESC的增殖情况进行分析。结果:实时定量PCR检测结果表明,细胞转染后72 h,miR-125b的表达上调1.45倍,说明hESC转染成功;克隆计数及细胞计数结果显示过表达miR-125b的hESC增殖受到明显抑制(P<001)。结论:转染miR-125b真核表达载体的hESC能够上调成熟miR-125b的表达,hESC中miR-125b的表达上调能明显抑制hESC的增殖。     

穿心莲内酯对人肺癌细胞增殖以及侵袭相关分子表达的影响

目的:观察穿心莲内酯(Andrographolide,AD)对人非小细胞肺癌细胞系H3255细胞的生长抑制作用,并研究其对肿瘤生长相关标记物血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)β1的表达以及蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的活性有无影响。方法:体外培养H3255细胞,分别用1.0、2.5、5.0μmol/L的AD在处理细胞24h。MTT法检测细胞的增殖,比色法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的释放情况。ELISA检测DNA片段化情况以及VEGF和TGF-β1的产生;无机磷法检测Na+-K+-ATP酶活性以及磷基转移法测得PKC活性。结果:AD处理能呈剂量依赖性方式降低H3255细胞的活性以及Na+-K+-ATP酶活性(P<0.05),同时也能促进LDH的释放和DNA片段的形成,并减少肺癌细胞VEGF和TGFβ1的水平和PKC的磷酸化。结论:AD对肺癌细胞具有一定的抑制作用,有望成为一种潜在的肿瘤治疗药物。     

反义RNA对猪α-1,3-半乳糖苷转移酶活性的影响

 α 1,3 半乳糖表位是猪 人异种移植超急性排斥反应的主要抗原 ,由α 1,3 半乳糖苷转移酶催化合成 .用RT PCR方法扩增中国实验用小型猪α 1,3 半乳糖苷转移酶cDNA的前 582bp ,测定碱基序列并构建其反义表达载体pLXRN ,将其转染入猪主动脉内皮细胞 .NorthernBlotting表明α 1,3 半乳糖苷转移酶mRNA减少 .检测α 1,3 半乳糖苷转移酶活性表明 ,反义RNA可使其活性下降32 2 % .研究结果表明可能通过反义RNA来抑制猪 人异种移植超急性排斥反应     

端粒酶RNA的反义cDNA对乳腺癌细胞凋亡的影响(英文)

 为了进一步探讨端粒酶RNA(hTR)的反义cDNA对乳腺癌MCF 7细胞凋亡可诱导性的影响 ,构建了能将外源基因整合至细胞基因组的整合型腺病毒载体vAd AAV ,并将hTR全长cDNA反向连接至此载体上 ,获得反义重组腺病毒vAdT AAV .vAd AAV和vAdT AAV分别感染MCF 7细胞后 ,获得两个细胞株MCF 7 vAd AAV和MCF 7 vAdT AAV ,其中MCF 7 vAdT AAV细胞基因组内整合有hTR反义cDNA并能稳定表达 .利用生存曲线、细胞形态学观察、DNA片段分析和流式细胞分析来测定NaBu和无血清DMEM诱导后细胞凋亡的反应性 .通过生存曲线 ,发现NaBu诱导的MCF 7 vAdT AAV细胞比对照组MCF 7和MCF 7 vAd AAV细胞更早出现凋亡 .电镜下 ,NaBu或去血清诱导的MCF 7 vAdT AAV细胞更早出现凋亡形态学指标 .流式细胞分析和DNA片段凝胶电泳实验均显示MCF 7 vAdT AAV细胞对凋亡的抵抗力下降 .研究结果表明 ,端粒酶RNA的反义cDNA使乳腺癌MCF 7细胞的凋亡可诱导性增强     

反义RNA对人胃癌细胞生长抑制及恶性表型的阻断作用

ｒａｓ原癌基因的点突变是人胃癌发生发展的重要机理之一。利用能表达ｃ－Ｈ－ｒａｓ癌基因反义ＲＮＡ的质粒,导入人胃癌细胞系ＢＧＣ－８２３,研究了ｒａｓ癌基因反义ＲＮＡ对人胃癌细胞生长及恶性表型的作用,结果表明,ｃ－Ｈ－ｒａｓ反义ＲＮＡ可引起ＢＧＣ－８２３生长速率及形态的变化,在半固体培养基中细胞集落形成能力减弱,部分地抑制了ＢＧＣ－８２３在裸鼠体内的致瘤性。ｃ－Ｈ－ｒａｓ反义ＲＮＡ对其ＲＮＡ的过量表达呈特异性抑制作用。     

反义RNA调控的不同方式

反义ＲＮＡ调控的不同方式宫明,宫锋（山东大学微生物系,济南２５０１００）关键词反义ＲＮＡ,调控方式反义ＲＮＡ最早发现于原核生物,但是１９８６年Ｗｉｌｌｉａｍｓ发现真核细胞中也存在天然反义ＲＮＡ。不同的反义ＲＮＡ其功能和作用方式不尽相同,它们控制着噬菌...     

甘油二酯激酶α在结直肠癌中的表达及其与PKC、TNFα的相关性

目的探讨甘油二酯激酶α(DGKα)在结直肠癌中的表达及其与蛋白激酶C(PKC)、肿瘤坏死因子α(TNFα)表达的相关性。方法应用免疫组化方法检测DGKα、PKC和TNFα在48例结直肠癌、癌旁正常组织和9例腺瘤性息肉中的表达。结果 DGKα在结直肠癌组织和癌旁正常组织有表达,结直肠癌组织中DGKα阳性表达率(79.2%)显著高于腺瘤性息肉(阴性)和癌旁正常组织(33.3%,P0.05);PKC主要分布在结直肠癌和癌旁正常组织中,结直肠癌组织中PKC阳性表达率(35.4%)显著高于腺瘤性息肉(阴性),与癌旁正常组织(20.8%)相比无显著性差异(P0.05);TNFα在三种组织中均表达阳性,结直肠癌组织中TNFα阳性表达率(95.8%)显著高于腺瘤性息肉(55.6%,P0.05),与癌旁正常组织(87.5%)相比无显著性差异(P0.05);结直肠癌组织中,DGKα与PKC的表达呈负相关(r=-0.437,P0.05),与TNFα的表达没有相关性(r=0.185,P0.05)。结论DGKα在结直肠癌组织中的表达高于腺瘤性息肉,DGKα可能抑制了PKC的活性,但对TNFα没有明显的抑制作用,在临床病理鉴别诊断中有辅助价值。     

STAT2的小分子干扰RNA抑制HeLa细胞增殖

新近研究发现STAT2基因具有致瘤性.前期研究发现:多种肿瘤组织和细胞系高表达STAT2,因此为进一步研究STAT2基因在肿瘤发生发展中的功能,利用RNA基因沉默技术,降低STAT2基因在宫颈癌HeLa细胞系中的内源表达水平,采用XTT实验、软琼脂集落形成实验以及裸鼠体内成瘤实验等研究策略,发现沉默STAT2基因可抑制...     

杀伤细胞对肺癌小鼠Lewis细胞增殖的抑制作用

目的:探讨杀伤细胞对人Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用。方法:选择成年健康雄性ICR小鼠46只,随机选取10只作为正常对照组,其余36只进行模型复制,然后将造模成功的30只小鼠随机分为实验组与模型组,每组15只。实验组予以尾静脉注射杀伤细胞1×107个/0.2 m L,1次/d,模型组与对照组予尾静脉注射生理盐水。ELISA方法测定TNF-α、IL-2和IL-4的含量,采用流式细胞仪检测凋亡率,四氮唑蓝(MTT)比色法检测癌细胞抑制率。结果:1实验组小鼠右腋下瘤体重量明显低于模型组,差异有统计学意义(P0.01);2透射电镜下观察实验组人Lewis肺癌细胞出现大量凋亡,而模型组人Lewis肺癌细胞几乎未凋亡,与模型组比较,实验组细胞凋亡较多,差异具有统计学意义(P0.05);3实验组小鼠脾上清液中IL-2、TNF-α和IFN-γ含量明显高于模型组和正常对照组小鼠,差异有统计学意义(P0.01)。结论:杀伤细胞能够通过活化淋巴细胞、分泌细胞因子来抑制体内、体外人Lewis肺癌细胞的增殖和生长,对临床具有指导意义。     

PRSV-CP正义、反义RNA植物表达载体的构建

利用基因工程方法构建了RNA介导的正义、反义植物表达载体,并通过电激法导八农杆菌中．经PCR和酶切鉴定证实,成功构建了PRSV-CP正义、反义RNA植物表达载体及其相应的农杆菌工程菌株．这为后续转基因研究及番木瓜抗PRSV分子育种奠定了基础．     

鸟氨酸脱羧酶基因反义RNA对淋巴瘤细胞Jurkat生长的影响

探讨鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)反义RNA是否对人淋巴瘤细胞Jurkat的生长具有抑制作用。含反义RNA的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Rodc用脂质体转染Jurkat细胞,G418筛选ODC表达抑制的细胞株,MTS法分析细胞增殖,Western blotting检测细胞中ODC蛋白表达水平,半定量RT-PCR检测细胞中ODC mRNA含量,流式细胞术检测细胞周期的变化,DNA片段化分析细胞凋亡。结果显示,成功获得ODC表达抑制的淋巴瘤细胞株J/o,ODC反义RNA转染细胞后,引起Jurkat细胞生长缓慢和S/G2细胞周期停滞,细胞对抗癌药物DFMO敏感性显著增加。由此证明,ODC反义RNA能抑制人T淋巴瘤Jurkat细胞的生长,具有治疗人白血病的潜在应用价值。     

aFGF对人脐静脉内皮细胞TPK、PKC活性及Ca2+浓度的影响

为了观察酸性成纤维细胞生长因子 ( acidic fibroblast growth factor,a FGF)与人脐静脉内皮细胞 ( human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)膜上特异受体结合后引起的细胞内信号转导途径 ,探讨 a FGF导致细胞增殖的机理 ,经 Scatchard曲线分析人脐静脉内皮细胞膜受体性质 .以不同浓度的 a FGF处理人脐静脉内皮细胞 ,利用 [γ- 3 2 P]ATP参入外源性底物的方法测定受体的酪氨酸蛋白激酶 ( tyrosine protein kinase,TPK)及蛋白激酶 C( protein kinase C,PKC)的活性 ;用 Fura-2 /AM为荧光指示剂测定 [Ca2 ]i.结果显示 :Scatchard曲线证明 a FGF与 HUVEC膜受体特异结合呈一条曲线 ,即受体为一种结合位点 ,Kd 为 3.6× 1 0 -10～ 9.6× 1 0 -10 mol/L,每个细胞受体数为2 70 90 .随着 a FGF浓度增加 ,TPK及 PKC活性随之升高 .当 a FGF浓度为 1 .1 2 mg/L时 ,a FGF处理组的 TPK活性是对照组的 3倍 ;膜 PKC活性是对照组 3.4倍 ,胞浆 PKC活性是对照组的 1 .87倍 .胞浆 [Ca2 ]是对照组的 3倍 .结果指出 :该细胞中 a FGF受体具有 TPK活性 .TPK激活后进一步促进蛋白质和酶磷酸化级联反应 ,而使 PKC活性及 [Ca2 ]i 升高 ,即 PKC和 Ca2 为 TPK的下游信号分子 ,进一步促进基因表达增加 ,导致细胞增殖 .     

在大肠杆菌中反义RNA抑制乙型肝炎病毒核心抗原的表达

将乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因的DNA序列分别按正、反方向置tac启动子的控制下,并克隆进入同一个质粒中,转化大肠杆菌JM103后,观察到HBcAg和HBeAg的合成均明显低于仅含有HBcAg基因的细菌,最大抑制率可达70％～80％,分子杂交可见反义RNA存在。