Ⅰ群禽腺病毒Hexon蛋白的截短表达与鉴定

本研究利用PCR方法扩增出Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠ hexon基因主要抗原区,连接于表达载体pGEX-4T-1中,构建成重组质粒pGEX-hexon,并转化大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达,对表达的Hexon蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-blot分析.结果显示,试验成功扩增获得hexon基因主要抗原区序列,大小为1 020 bp.重组蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白大小为63.1 ku,与预测值相符.经Western-blot分析,表明重组蛋白与FAVⅠ的阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性,为FAVⅠ诊断试剂盒的研制奠定基础.     

GST-Smad4融合蛋白的表达与纯化

旨在原核表达Smad4基因,纯化获得GST-Smad4融合蛋白。以人表皮HaCaT细胞的cDNA为模板,利用PCR扩增含有BamH I和SalI酶切位点的Smad4基因;然后将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG诱导表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-Smad4融合蛋白;最后通过Western blot鉴定此融合蛋白。结果显示,成功构建pGEX-4T-1-Smad4原核表达载体;30℃条件下,0.2 mmol/L的IPTG能诱导出大量的可溶性GST-Smad4蛋白;经MagneGST particles纯化的GST-Smad4蛋白可被Smad4的抗体特异识别。纯化的GST-Smad4蛋白可用于后续的生物学研究。     

GST-Ets-1融合蛋白的表达与纯化

[目的]旨在原核表达Ets-1基因,纯化获得GST-Ets-1融合蛋白。[方法]以SD大鼠脑垂体cDNA为模板,利用PCR扩增含有Bam HI和Not I酶切位点的Ets-1基因;然后将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG诱导表达,再利用Magne GST particles亲和纯化GST-Ets-1融合蛋白;最后通过Western blot鉴定此融合蛋白。[结果]成功构建pGEX-4T-1-Ets-1原核表达载体;30℃条件下,0.2 mmol/L的IPTG能诱导出大量的可溶性GST-Ets-1蛋白;经Magne GST particles纯化的GST-Ets-1蛋白可被识别ETS-1的抗体特异识别。[结论]纯化的GST-Ets-1蛋白可用于后续的生物学研究。     

钙激活酶激活蛋白基因的克隆及其在原核生物中表达及条件的优化

构建钙激活酶激活蛋白基因（UK114）的原核表达载体并优化其表达条件,为其高效表达提供试验依据。以UK114 cDNA为模板,通过PCR方法扩增钙激活酶激活蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,在保持菌种不改变的前提下,分别改变IPTG的浓度、培养时间、菌体浓度、培养温度等来优化表达条件。结果显示,原核表达载体pGEX-4T-3-UK114成功构建,可在大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达,得到相对分子质量约40 kD的GST-UK114融合蛋白。在IPTG浓度为0.3 mmol/L,诱导温度为32℃,诱导时间为4 h,菌体密度OD600为0.6的条件下,目的蛋白表达量最高。试验成功构建原核表达载体pGEX-4T-3-UK114且获高效表达,为研究UK114生物学活性及产品开发提供了试验基础。     

阴道毛滴虫黏附蛋白33基因原核表达载体的构建及表达

目的构建阴道毛滴虫黏附蛋白33基因原核表达载体并诱导其体外表达。方法pMD-18T-ap33重组质粒和pUC18空质粒经BamH Ⅰ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切,将ap33基因亚克隆入pUC18载体并进行筛选和鉴定。重组质粒经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳及Western-blot杂交鉴定重组蛋白。结果经双酶切及PCR鉴定,构建的重组质粒为阳性重组子,诱导出的重组蛋白大小约为Mr36000,与理论值基本相符。结论成功构建重组质粒并获得体外表达。     

大鼠Scratch2蛋白锌指结构域的表达与纯化

[目的]原核表达大鼠Scratch2基因的C_2H_2型锌指结构域,纯化获得GST-C_2H_2融合蛋白。[方法]以新鲜大鼠前额叶脑组织cDNA为模板,利用PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的Scratch2基因的锌指结构域后,构建原核表达载体pGEX-4T-1-C_2H_2,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导融合蛋白表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-C_2H_2融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定此融合蛋白。[结果]成功构建了pGEX-4T-1-C_2H_2原核表达载体;在20℃、0.2 mmol/L的IPTG诱导下,GST-C_2H_2融合蛋白即可有效地表达;经MagneGST particle纯化的GST-C_2H_2蛋白可被识别Scratch2锌指结构域的抗体所识别。[结论]纯化的GST-C_2H_2蛋白可用于后续研究。     

p65蛋白的诱导表达及电子显微镜观察其显微结构

目的:构建重组原核表达载体pGEX-5x-1-p65,诱导GST-p65融合蛋白的表达并观察其包涵体的显微结构.方法:应用PCR技术扩增得到p65全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5x-1载体中.经酶切、测序鉴定后,在原核细胞中诱导表达GST-p65融合蛋白并将诱导后的菌体制作透射电镜标本,观察菌体内部显微结构.结果:成功构建表达载体pGEX-5x-1-p65,原核细胞中诱导表达、凝胶电泳后未见可溶性融合蛋白的高效表达.透射电镜观察到在承载有重组载体的菌体内部出现大量高电子密度的包涵体.结论:成功构建了原核表达载体pGEX-5x-1-p65,电子显微镜观察并证实在原核细胞内p65蛋白诱导表达形成包涵体.     

β-synuclein蛋白原核表达载体的构建与表达

目的构建人β-synuclein基因的原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达。方法从人脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人β-synuclein基因,克隆至pCUm-T载体中,PCR筛选阳性克隆并测序。将酶切后的目的片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达。结果 RT-PCR扩增出人β-synuclein基因,将其亚克隆至pGEX-6P-1构建成重组表达质粒,并在BL21中表达了β-synuclein蛋白。结论成功构建人β-synuclein的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达了人β-synuclein融合蛋白,为进一步研究β-synuclein在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。     

pGEX-4T-3-MFGF21表达载体的构建、表达与纯化

目的:构建小鼠FGF21(fibroblast growth factor 21,FGF21)重组表达载体pGEX-4T-3-MFGF21,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,纯化后获得小鼠FGF21融合蛋白。方法:提取小鼠肝脏总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,将其克隆至pMD19-T进行保存。以T载体为模板,扩增MFGF21 mat-peptide,构建重组原核表达载体pGEX-4T-3-MFGF21。将重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,在不同IPTG浓度、温度及转速下对表达载体进行诱导表达,优化表达条件,表达产物经SDS-PAGE电泳以鉴定是否为可溶性表达,采用亲和层析法纯化各表达产物后,进行Western blotting鉴定。结果:成功构建重组表达载体pGEX-4T-3-MFGF21,对其进行可溶性表达后成功纯化出GST-MFGF21,经Western-blotting鉴定为目的蛋白。结论:成功构建pGEX-4T-3-MFGF21,得到纯化的GST-MFGF21蛋白。     

结核分枝杆菌Rv1884c基因的克隆及其原核表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv1884c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv1884c基因的表达蛋白。方法:制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX-4T-1构建质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH5α,再经IPTG诱导表达GST-1884融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析重组蛋白的相对分子质量及表达形式。结果:扩增出了结核分枝杆菌Rv1884c基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c,转化大肠杆菌DH5α后经诱导产生了高水平的表达产物。结论:构建了pGEX-4T-1-Rv1884c质粒载体,并诱导表达了GST-1884融合蛋白,为进一步研究Rv1884c蛋白的活性及其功能,探讨结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

转录因子LRF蛋白POZ结构域的表达与纯化

[目的]旨在原核表达转录因子LRF的POZ结构域,纯化获得GST-POZ融合蛋白。[方法]以SD大鼠海马组织c DNA为模板,利用PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的LRF基因的POZ结构域,并将其插入到原核表达载体p GEX-4T-1中,将构建成功的p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导融合蛋白表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-POZ融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定融合蛋白。[结果]p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒构建成功;在37℃条件下,浓度为0. 2 mmol/L的IPTG诱导7 h能够使重组蛋白大量表达,经MagneGST particles纯化后的GST-POZ重组蛋白能够被识别LRF的抗体特异性识别。[结论]纯化后的GST–POZ重组蛋白能够用于后续的生物学研究。     

TRAF6-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中表达肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)与GST的融合蛋白并进行纯化。方法:采用PCR方法从肝文库中扩增编码TRAF6的DNA片段,将其插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建GST-TRAF6原核表达载体,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达;用谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化表达的GST-TRAF6融合蛋白。结果:酶切鉴定和测序分析显示,长为1569 bp的TRAF6 DNA片段在pGEX-4T-2-TRAF6中的碱基序列、插入位点及读框正确,且位于表达载体的GST序列下游;经IPTG最佳浓度0.5 mmol/L诱导表达、亲和纯化后,获得了相对分子质量约85×103的GST-TRAF6融合蛋白。结论:构建了重组GST-TRAF6原核表达载体,获得了GST-TRAF6的大肠杆菌BL21表达菌株及GST-TRAF6融合蛋白,利于深入研究TRAF6的功能。     

青岛文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因表达载体的构建及表达纯化

为了在原核细胞中表达青岛文昌鱼Branchiostoma belcheri tsingtaunese S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adeno-sylhomocysteine hydrolase,SAHH),采取构建文昌鱼SAHH基因的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-SAHH的方法,转化入大肠杆菌JMl09感受态细胞中,IPTG诱导蛋白表达,并进行分离纯化.结果经SDS-PAGE分析,重组质粒在JM109中表达并纯化得到的融合蛋白大约为70 kDa,成功构建了文昌鱼SAHH基因原核表达载体,且重组载体表达出融合蛋白,分离纯化得到目的蛋白.     

GST/ AEP 融合蛋白原核表达载体的构建、表达及鉴定

目的：为进一步研究抗癫痫肽（And—epilepsy peptide,AEP）的抗痫机制及筛选其相关作用蛋白,进行GST／AEP融合蛋白原核表达载体的构建及融合蛋白的表达。方法：通过PCR基因扩增对AEP基因进行扩增,并将其克隆于谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,经酶切、序列鉴定分析后,用该重组质粒转化大肠杆菌B121（DE3）,经IPTG诱导获得表达,并采用Western Blot进行检测。结果：成功构建了AEP原核表达载体,并在大肠杆菌B121中获得表达。结论：成功构建了GST／AEP原核表达载体,并表达了GST／AEP融合蛋白。     

木薯MeNINV4基因在原核细胞中的表达及优化

转化酶是植物中蔗糖降解过程的关键酶之一,可催化蔗糖不可逆地分解为葡萄糖和果糖,在植物生长发育、平衡碳水化合物及对逆境胁迫的响应等方面具有重要的作用。本研究利用从木薯中克隆到碱性/中性转化酶MeNINV4基因,将其重组构建到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组载体MeNINV4-pGEX-6p-1,并对其融合蛋白表达的IPTG诱导浓度、起始菌液浓度、诱导温度和诱导时间条件进行优化。研究结果发现:GST-MeNINV4融合蛋白的表达量在一定范围内随着IPTG诱导浓度、起始菌液浓度和IPTG添加时间的增加而增加。重组菌在OD_(600)为1.0左右,IPTG浓度为0.6 mmol/L,在37℃条件下诱导5 h后,重组蛋白的表达量达到最大值。本研究通过诱导目的蛋白在原核细胞中的表达并且优化表达条件,使目的蛋白在原核细胞中的表达量显著增加,为进一步研究目的蛋白的结构、功能及酶学特性等生物学功能提供理论依据。     

重组原核质粒GST-hTudor-SN-SN（1～4）的构建及表达

目的 将人类Tudor-SN（tudor staphylococcal nuelease）蛋白SN（1～4）基因片段分别定向连入pGEX-4T-1质粒,使Tudor-SN蛋白sN各功能片段与（;＂蛋白在大肠埃希菌BL21细胞内融合表达.方法 以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的 基因,利用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切法将目的 片段连接纠pGEX-4T-1载体卜,再将构建成功的GST-hTudor-SN-SN（1～4）重组质粒转化人大肠埃希菌BL-21内,IPTG诱导表达后再以考马斯亮蓝染色法检测GST融合蛋白的表达.结果 以单/双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,考马斯亮监染色法观察到GST融合蛋白的正确表达.结论 重组原核GST.hTudor-SN-SN（1-4）质粒成功构建和表达.     

具有免疫反应性的猪瘟病毒多表位基因在大肠杆菌中的克隆表达和鉴定

将猪瘟病毒不同抗原表位基因串联构成重组基因BT21,化学合成后克隆至pMD18-T载体中,然后再将BT21串联基因片段插入原核表达载体pGEX-6P-1。经酶切和测序鉴定后,构建的重组质粒pGEX—BT21转化大肠杆菌BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达,表达产物进行SDS—PAGE分析,用G1utathione Se-pharose4B亲和层析法纯化目的蛋白和Western blot分析其免疫学活性。结果表明：融合蛋白GST—BT21以可溶形式表达,分子量约为33kDa,与预期大小相符,纯化的重组蛋白可被猪瘟病毒阳性血清所识别,具有良好的免疫学活性。从而为进一步研究该融合蛋白的免疫特性和功能奠定了基础。     

白念珠菌MP65和SAP2蛋白原核表达质粒的构建与表达

目的构建以白念珠菌基因MP65和SAP2为目的基因的原核表达质粒,IPTG诱导其表达融合蛋白,并对其免疫原性进行分析。方法PCR法自白念珠菌标准菌株获取MP65和SAP2基因,分别插入至原核表达载体pGEx．4T之和pET32a中;将重组表达质粒转染感受态EcoliBL-21,经IPTG诱导表达、纯化后,SDS—PAGE和Western blot分析。结果PCR法克隆出全长为1140bp的MP65和1197bp的SAP2基因,构建的原核表达质粒pGEX-4T-2-MP65及pET32a-SAP2,可分别表达出66KD左右的GST融合蛋白和His融合蛋白。结论成功获取了白念珠菌基因^伊65和SAP2,所构建的原核表达质粒在BL-21中成功表达;两种蛋白均有免疫原性。     

家蝇幼虫抗菌肽Attacin基因的克隆表达及抑菌生物学活性

目的克隆家蝇幼虫Attacin抗菌肽基因．构建原核融合表达载体,建立Attacin体内抗菌活性检测系统,优化表达和纯化Attacin目的蛋白,并初步研究其抗菌生物学功能。方法以pUC m-T／Attacin重组质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Attacin编码区序列,分别克隆至原核表达载体pET30a（＋）和pGEX-4T-1。构建原核重组质粒,转化大肠埃希菌,表达重组Attacin蛋白,并在大肠埃希菌中体内检测Attacin的抗菌活性。利用亲和层析柱纯化重组融合蛋白Attacin,SDS-PAGE进行纯度分析,琼脂糖平板抑菌试验鉴定其生物活性。结果pET30a（a＋）／Attacin和pGEX-4T—1／Attacin重组质粒分别转化大肠埃希菌后,以IPTG诱导表达,与未诱导对照相比,含有重组质粒的宿主菌生长受到抑制。从pET30a（＋）／Attacin重组质粒的表达宿主菌中未能获得His-Attacin融合蛋白,而从pGEX-4T—1／Attacin重组质粒转化菌种获得GST-Attacin融合蛋白。SDS-PAGE分析表明Attacin重组蛋白分子量与预期结果一致,琼脂糖平板抑菌试验显示重组Attacin具有抗菌活性。结论Attacin基因在原核系统中成功表达,并且纯化后具有抑菌活性,为下一步研究Attacin的生物学功能及其应用开发奠定了基础。     

抗汉坦病毒NP scFv基因表达及生物活性分析

诱导已构建的重组质粒pGEX-6P—1—scFv原核表达抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体,并用酶免疫实验检测单链抗体生物活性。用IPTG诱导重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv表达抗汉坦病毒NP单链抗体融合蛋白,经亲和层析纯化,并应用SDS—PAGE电泳检测单链抗体融合蛋白,应用酶免疫实验检测抗NP单链抗体生物学活性。SDS—PAGE电泳检测显示,原核重组质粒pGEX-6P-1-scFv已表达分子量约为56ku的单链抗体融合蛋白;酶免疫实验检测显示,单链抗体具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合的生物学活性。结果表明,已构建的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-scFv,能够成功表达具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合生物学活性的单链抗体。