Ⅰ型干扰素受体缺失小鼠体外受精实验研究

目的探索两种I型干扰素受体缺失对于小鼠体外受精的影响并对体外受精条件进行优化。方法对两种I型干扰素受体缺失小鼠(IFN-αR-/-、IFN-α/βR-/-)及背景野生型小鼠(C57BL/6)分别进行体外受精及胚胎移植,每组超排5只小鼠,3次重复,记录相关数据,分析干扰素受体缺失是否对小鼠体外受精存在影响。分别将两种I型干扰素受体缺失小鼠配子与C57BL/6小鼠配子进行体外受精杂交试验,每组5只小鼠,3次重复,探讨I型干扰素受体缺失对雌雄配子体外受精的影响。同时,优化体外受精条件,探索提高受精率技术方法,每组5只小鼠,三次重复。结果两种I型干扰素受体缺失小鼠平均体外受精率低于背景品系C57BL/6小鼠,组间差异具有显著性(P0. 05)。干扰素α受体缺失小鼠体外受精率高于干扰素α、β受体双缺失小鼠体外受精率,组间差异具有显著性(P0. 05)。两种I型干扰素受体缺失小鼠的精子与C57BL/6小鼠卵细胞体外受精率均高于其卵细胞与C57BL/6小鼠精子的体外受精率,组间差异具有显著性(P0. 05)。通过延长精子获能时间至1 h或在获能液及受精液中加入1 mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)能够提高体外体外受精率,相应组间差异具有显著性(P0. 05)。结论 I型干扰素受体缺失可能导致相应品系小鼠体外受精率降低,而且对卵细胞的影响较精子的影响更为显著,通过适当延长精子获能时间或改变获能及受精液成分,能够提高体外受精率。     

IVF-20培养液用于大鼠体外受精的实验研究

目的探讨人用体外受精液用于实验大鼠体外受精的可行性,为实验大鼠的胚胎保种提供参考。方法选用人体外受精IVF-20培养液作为大鼠精子获能和受精培养液,对SD、Wistar、GK、F344等四种不同品系的实验大鼠进行体外受精;用mR1ECM培养液对体外受精所得胚胎进行体外培养实验。同时,将所得2-细胞胚胎移植给经假孕处理的受体鼠。结果四个品系大鼠体外受精后的卵裂率分别可达83.2%、72.6%、87.8%和71.6%。体外受精卵裂胚能够在体外进一步发育,SD大鼠囊胚发育率为16.7%,与体内受精胚胎在体外培养的囊胚发育率(24.5%)差异不显著。80枚2-细胞胚胎移植给2只受体鼠后均妊娠成功,产下正常仔鼠10只,产仔率12.5%。结论用于人体外受精的IVF-20培养液同样适合于实验大鼠精子的体外获能和受精,可以在多种品系获得较高的卵裂率,所得卵裂胚能够在体外发育到囊胚,并且所得卵裂胚在移植给受体鼠后能够产下正常仔鼠。     

长爪沙鼠体外受精与早期胚胎体外培养体系的初步建立

目的探讨自配的获能液和受精液用于长爪沙鼠体外受精的可行性,为长爪沙鼠的胚胎保种提供参考。方法用自配的获能液和受精液对长爪沙鼠进行体外受精,并用改良后的KSOM培养液对长爪沙鼠的2细胞胚胎进行体外培养试验。结果长爪沙鼠体外受精率在60%以上,沙鼠2细胞胚胎能够在体外进一步发育。结论初步建立了长爪沙鼠体外受精和胚胎发育体系,但需要进一步优化。     

生物工程技术在实验小鼠生物净化上的应用

目的采用体外受精的技术,对L858R、TL清洁级小鼠,以及来源于野外的中华小家鼠,和感染肺炎克来伯氏菌的Balb/c-nu裸鼠进行生物净化。方法对于需要净化的小鼠的雄鼠,采集附睾的精子,放入HTF溶液中获能,然后加入经过超排的卵团,体外受精。20-22 h后,挑选形态正常的二细胞胚胎,在净化实验室,移植给假孕的SPF级ICR母鼠,待产仔。仔鼠断奶后,随机选择仔鼠及带奶母鼠送检。结果体外受精的胚胎,经过移植后,均顺利产仔;仔鼠及母鼠的微生物级别,均达到SPF级。结论对于微生物级别较低的实验小鼠,采用在洁净实验室内做体外受精、胚胎移植的方法,可以提高实验小鼠的微生物级别。     

山羊体外受精的研究

通过在山羊卵母细胞体外成熟培养液中添加不同的血清和不同浓度的卵泡液 ,在体外成熟培养液中培养不同的时间 ,以及采用不同的精子获能方法来摸索效率较高的体外受精方法体系。在山羊卵母细胞体外成熟培养液中添加FCS、EGS及不同浓度的卵泡液 ,成熟培养时间分别为 16、2 0、2 4和 2 7h ,山羊新鲜精液用钙离子载体法和肝素法进行获能处理后用于体外受精 ,比较其体外成熟率和体外受精率。添加FCS、EGS和 2 0 %卵泡液组的成熟率无显著差异 ,显著高于添加 10 %和 3 0 %卵泡液组的成熟率 ;但添加FCS和EGS组的受精率显著高于添加10 %、2 0 %、3 0 %卵泡液组的受精率。培养 2 4h组和 2 7h组的成熟率显著高于另外两组 ,而培养 2 7h组的受精率显著高于其余各组。用钙离子载体法处理的山羊精子的顶体反应率和体外受精率显著高于肝素法。EGS可以代替FCS添加于成熟培养液中 ,对COCs的成熟率和受精率没有明显的影响 ,但卵泡液不能完全代替FCS的作用。培养时间为 2 7h ,精子用钙离子载体法处理获能后能得到较高的体外受精率     

精胺抑制人精子的体外受精能力

以精子穿透去透明带仓鼠卵试验(SPA)为模型,评价了精胺对人精子体外受精能力的影响。精胺(0.25—8.0mmol/L)可抑制人精子体外获能和受精,其抑制作用与精胺浓度呈正相关,此种抑制作用是可逆的。用 HPLC 测定精子精胺含量表明,精子获能后精胺含量明显下降。dbcAMP(0.5—1.0mmol/L)或咖啡因(10mmol/L)可拮抗精胺抑制人精子体外获能。其拮抗作用随 dbcAMP 浓度而增强。钙离子载体 A 23187 2/μmol/L 或胰蛋白酶0.05%均可拮抗精胺抑制人精子穿卵率。上述结果提示,精胺可能通过降低精子 cAMP 含量和抑制钙内流或顶体酶活性,从而阻止人精子体外获能和受精。     

精子介导GFP基因在小鼠早期胚胎中的表达

利用DIG末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子体外结合内化外源DNA的效率。试验结果表明,不同小鼠个体的精子结合外源DNA的阳性率有明显差异(P<0.01),平均为13%。利用考马斯亮蓝染色评价了小鼠精子顶体反应发生的情况,筛选出TYH培养液为较合适的体外受精液。利用小鼠体外受精技术,将体外转染GFP基因并获能的小鼠精子与成熟卵母细胞进行体外受精,受精卵进行体外培养,表达GFP胚胎的阳性率为4.7%。验证了精子介导制备转基因小鼠胚胎的可行性,并建立了利用精子载体法制备转基因小鼠胚胎的平台。     

猕猴精子优选及体外获能的研究

选择活率高的精子并进行体外获能是开展猕猴体外受精研究的必要程序, 是研究猕猴受精生物学的重要手段。本实验采用上浮法和Percoll 梯度离心法对猕猴精液进行了优选, 并对处理后的精子形态正常率、精子活率、密度及受精率作了比较, 发现二者差异不显著; 用dbcAMP 和咖啡因使精子获能, 发现只有两种获能剂同时存在才能使猕猴精子获能并使卵母细胞受精。结论为: 上浮法和Percoll 法都是有效的精子优选法, 对受精率的影响差异不显著; dbcAMP 和咖啡因在猕猴精子体外获能时缺一不可。     

昆明小鼠精子冷冻的研究（简报）

胚胎工程技术是动物品种、品系培育,种质资源保存及转基因动物制备、保种的重要手段。配子的冷冻保存技术目前广泛应用于胚胎工程。和胚胎冷冻相比小鼠精子冷冻技术方便、高效尤其适用于转基因及突变系小鼠的保种。成功的精子冷冻要求复苏后通过体外受精(IVF)获得胚胎,再移植入受     

用CTC荧光染色法检测添加肝素对牛精子体外获能的影响

本试验在TALP液中添加不同浓度(0、20、40、80μg.ml-1)的肝素对牛精子进行获能,用CTC染色检测精子获能状况,探讨肝素浓度及诱导时间(1、3、6、9h)对牛精子体外获能的影响。结果显示:随着肝素浓度的提高,精子获能效果增强,3 h达到最高,但添加80μg.ml-1的肝素精子的顶体反应率低于其他组。结果表明:在TALP液中增加高浓度的肝素对精子体外获能有促进作用,用高浓度的肝素获能处理3h后的精子进行体外受精可能会得到较好的效果。     

精子介导GFP基因在小鼠早期胚胎中的表达

利用 DIG 末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子体外结合内化外源DNA的效率。试验结果表明,不同小鼠个体的精子结合外源DNA的阳性率有明显差异（P<0.01）,平均为13%。利用考马斯亮蓝染色评价了小鼠精子顶体反应发生的情况,筛选出TYH培养液为较合适的体外受精液。利用小鼠体外受精技术,将体外转染GFP基因并获能的小鼠精子与成熟卵母细胞进行体外受精,受精卵进行体外培养,表达GFP胎的阳性率为4.7%。验证了精子介导制备转基因小鼠胚胎的可行性,并建立了利用精子载体法制备转基因小鼠胚胎的平台。     

不同品系小鼠的体外受精、胚胎冷冻及移植的比较研究

目的　探讨不同品系小鼠的体外受精、胚胎和精子的低温保存效果。方法　本实验分别在中国科学院上海实验动物中心 (SLAC)和日本熊本大学动物资源开发中心 (CARD)对 13个品系小鼠 (C57BL 6J、BALB c、C3H HeJ、ICR、KM、FVB、MRL、NOD、CBA、DBA 2、CD 1、BDF1、B6C3F1)的体外受精 (IVF)率、胚胎培养及移植成绩进行了比较研究。结果　各品系小鼠新鲜精子的IVF率 15 1%～ 87 9% ,冻融精子的IVF率 8%～ 80 % ;冷冻胚胎的复苏率4 2 6 %～ 83 9% ;冻融胚胎移植后的产仔率在 17 8%～ 5 1 8%。结论　遗传背景不同的小鼠体外受精率、冷冻胚胎复苏率和胚胎移植的产仔率差异有显著性。但同一品系两个实验室间的新鲜精子的IVF率、冷冻胚胎的复苏率及移植产仔率差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;冻融精子的体外受精率CARD明显高于SLAC(P <0 0 1)。     

远交系小鼠胚胎干细胞系的建立及嵌合鼠的获得

ES细胞（Embryonic Stcm Cells)是来源小鼠早期胚胎的多潜能干细胞,它可以在体外大量培养,并以单细胞的形式注射到早期胚胎里,发育为嵌合体,到目前为止,通常使用的129小鼠品系是来源于近交系（inbrcd)小鼠的胚胎。与之相比,远交系小鼠应当具有较强的生命力和抗病能力。曾有人报道过建成了远交系小鼠胚胎干细胞系,但是尚没有见到获得嵌合鼠的报道。有人甚至认为：由于不同品系小鼠所具有的遗传背景不同,有的小鼠不能建成ES细胞系。最近,本实验室在这方面做了有益的探索,成功地建成了远交系小鼠胚胎干细胞系,并在这里报导首例用远交小鼠胚胎干细胞系培育成功嵌合体小鼠。采用源于Swiss小鼠远交群的昆明（KM）品系小鼠囊胚建成了三个小鼠胚胎干细胞系（KE1,KE2,KE5)。核型正常率均达到70％以上。自第八代起分批存。复苏后,培养至第12代,消化成单细胞,通过囊胚显微注射,将其注射到615品系小鼠胚胎。在幸存的幼鼠中获得了一只来源于KE1细胞的嵌合鼠（Table1)。其毛色表现为受体鼠（615）的白色中嵌合有供体鼠（KM)黑褐色（Platc I-A）。嵌合鼠与受体鼠的杂交后代鼠中仍然出现了受体鼠的毛色类型（PlateI-B)。证明：ES细胞能嵌合到生殖腺并形成具有正常功能的配子,从而产生种系嵌合鼠。     

昆明小鼠精子冷冻的研究(简报)

胚胎工程技术是动物品种、品系培育,种质资源保存及转基因动物制备、保种的重要手段。配子的冷冻保存技术目前广泛应用于胚胎工程。和胚胎冷冻相比小鼠精子冷冻技术方便、高效尤其适用于转基因及突变系小鼠的保种。成功的精子冷冻要求复苏后通过体外受精(IVF)获得胚胎,再移植入受体,生长发育并产出幼仔。胚胎体外培养获得足够的晚桑葚胚和早期囊胚是胚胎干细胞建立与制备嵌合体小鼠的成功关键,暂时不用的胚胎应仍能耐受冷冻保存,待复苏移植,建立新的繁殖群。但小鼠精子冷冻研究在我国开展的十分有限,缺乏相关资料数据。本实验对不同周龄SPF级昆明(KM)小鼠进行精子冷冻及冻融精子IVF,并将IVF获得的2-细胞胚胎分别进行胚胎移植、体外培养、胚胎冷冻及复苏后移植,应用冻融小鼠精子进行胚胎工程实践。     

小鼠卵母细胞体外培养成熟及“试管小鼠”的研究

本文研究建立了一个有效的小鼠体外受精系:t。将小鼠附覃尾精子在简单合成的培荞液中休外获 能后,与体内成熟的卵母细胞共同孵育受精,然后体外培养。结果发育至2一细胞期胚胎的百分率为75一 85 %。将这些2一细胞期胚胎移植到受体小鼠输卵管,得到11只“试管小鼠”。用小鼠卵巢中未成熟卵母 细胞,经体外培养成熟后,沐外受精培养,达2一细咆期胚胎的百分率为20-40%,经移植后得到6只“试 管小鼠,,。     

小鼠精子注入兔卵母细胞受精研究

利用显微操作仪将小鼠精子注入家兔卵母细胞的胞质内和透明带下,对鼠兔异种精卵互作和异种受精胚胎的发育进行了研究,并对注射精子的数量及卵的体外成熟时间等影响鼠兔异种显微受精的因素进行了探讨,结果如下:(1)将小鼠精子分别注入兔卵胞质内和透明带下,均能激活兔卵母细胞,导致精核解聚和原核形成;(2)小鼠精子注入兔卵胞质内和透明带下受精,杂种胚胎体外培养能发育到8-细胞期;(3)鼠兔异种受精4-细胞胚胎染色体标本制备观察结果表明,它们为正常二倍体;(4)鼠兔异种受精4-细胞胚胎的超微结构观察结果表明,它们极近似兔正常4-细胞胚胎的超微结构;(5)将小鼠精子注入兔卵透明带下,注射5—10个精子组卵的受精率(32.4%)和卵裂率(16.2%)均高于注射单个精子组的,但二组间差异不显著(P>0.05);DM 15%NCS液中体外成熟培养11—12h兔卵透明带下注入1—2个小鼠精子后的受精率(42.3%)和卵裂率(30.8%)均高于体外成熟培养24—25h组的,但二组间差异未达到显著水平(P>0.05)。     

羊精子体外获能

本文发展了一种羊精子体外获能培养基——mTs或RSCM。羊精子在该培养基中(39℃.pH7.8和5％ CO_2,95％空气)预先培养7小时,可使大部分精子获能。获能精子呈现超激活运动,并可穿透去透明带仓鼠卵,穿透率分别为78.5±14.3％和96.7±2.3％,这种作用可被同种精浆逆转。获能精子与同种卵的受精率为83.3％。16个受精卵等量移入2只假孕兔输卵管壶腹部中。72小时后回收到12个胚胎。其中6个胚胎已发育为4—8细胞阶段,将这些细胞等量移入2只受体母羊输卵管壶腹部。其中1只妊娠,并维持到2个月之久。     

系统低温生物学技术在实验小鼠资源保存中的建立与应用

目的建立小鼠胚胎与配子冷冻库,以安全、有效地保存小鼠资源。方法选择不同遗传背景（近交系、远交群、免疫缺陷、疾病模型和基因改变等）的实验小鼠,系统进行了超数排卵、体外受精（IVF）率、胚胎与精子的冷冻复苏效果、卵巢冷冻与移植、辅助体外受精等比较研究。结果①小鼠年龄和遗传背景的不同,其超数排卵的结果也不同（P〈0．01）。三个日龄段中,28日龄最好,其次为112日龄,56日龄最差;不同遗传背景小鼠的超数排卵结果显示,封闭群和大部分近交系小鼠优于转基因小鼠（P〈0．05）,自发性疾病小鼠和基因剔除小鼠的结果最差;②不同品系小鼠的新鲜精子和冻融精子的体外受精率差异有显著性（P〈0．05）,特别是C57BL／6J小鼠冻融精子的IVF率（10．3±4．2％）与新鲜精子（89．8±4.8％）相比,差异极显著（P〈0．01）;③不同品系小鼠的胚胎复苏率,除MRL／mp小鼠的复苏率略低外,其他小鼠品系均有较高的冷冻胚胎复苏率（58．2％～83．9％）,表明,不同遗传背景小鼠之间差异有显著性（P〈0．05）,但均可以达到有效保存小鼠资源的目的。④小鼠的遗传背景、年龄等对小鼠精子的冷冻效果都有影响,采用改良的FERTIUP冷冻保护剂和细胞质内单精注射（ICSI）技术可有效提高以C57BL／6J为背景的基因改变小鼠的精子冷冻复苏率。⑤卵巢冷冻保存可以改善雌性小鼠的繁殖困难或不孕。结论小鼠资源的安全保存,除了长期连续繁殖保种外,最好的或最保险的方法是低温保存。通过将胚胎、配子、卵巢等长期保存在液氮（-196℃）中避免遗传性状的改变,并在将来复苏后获得正常的小鼠后代,以用于生物学和医学等研究。     

品系对小鼠胚胎干细胞分离效率的影响

为了充分利用小鼠胚胎干(ES)细胞,就必须从众多小鼠品系中分离ES细胞系。本研究通过传统的成纤维细胞饲养层法,从CD-1、129/Sv、C57BL/6J和129/Sv×C57BL/6J四种不同遗传背景的小鼠中分离得到12个ES细胞系,而从KM小鼠没有得到ES细胞系。所有的ES细胞系都具有典型的ES细胞特征,AKP染色呈阳性。从四种不同遗传背景的ES细胞系得到了包含多种组织的畸胎瘤;与桑椹胚聚合后,都得到了生殖系嵌合体。结果表明:品系对小鼠ES细胞的分离有显著影响,利用129小鼠以及包含129小鼠遗传背景的杂交小鼠都较容易分离ES细胞,由ES细胞得到生殖系嵌合体的效率在不同品系间有显著差异,从杂交ES细胞比近交ES细胞中更容易得到生殖系嵌合体。     

精液添加精氨酸和亮氨酸对杂交黄颡鱼受精和孵化的影响

为提高杂交黄颡鱼[黄颡鱼Tachysurus fulvidraco (♀)×瓦氏黄颡鱼Tachysurus vachelli (♂)]的繁殖效率,文章首先对精子保存液中L-精氨酸(L-Arg)和L-亮氨酸(L-Leu)两种功能性氨基酸的添加进行了研究,以找出最适添加浓度。实验以受精率、孵化率和畸形率为评判指标。结果显示,受精率随着L-精氨酸浓度的等倍增加,呈先升后降的趋势,且均显著高于对照组(P<0.05)。其中以0.50 mmol/L的浓度组最高,而对孵化率和畸形率均无显著影响(P>0.05)。随着L-亮氨酸浓度增加,受精率和孵化率呈先升后降,畸形率呈先降后升的趋势,其中0.80 mmol/L浓度组的受精率、孵化率最高,畸形率最低,且均显著优于对照组(P<0.05)。在两种氨基酸同时添加,当L-精氨酸浓度为0.4 mmol/L, L-亮氨酸浓度为1.0 mmol/L时,受精率、孵化率和畸形率均显著优于对照组(P<0.05)。其次,研究利用计算机辅助精子分析系统(CASA)对精子活力进行检测,结果显示, 0.4 mmol/L精氨酸与1.0 mmol/L亮氨酸的单...