利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(MgPa)相互作用的宿主蛋白

从利用基于分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选生殖支原体(Mg)黏附蛋白(MgPa)的互作蛋白。以pET30a-MgPa为模板,经PCR扩增MgPa基因,将其分别连接到pBT3STE和pBT3SUC载体以构建诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa;将诱饵质粒分别转化到酵母菌株NMY32内,检测其毒性和自激活活性;将人尿道上皮细胞cDNA文库质粒pPR3-N-207-Zeng转入到含pBT3SUC-MgPa诱饵质粒的酵母菌株中,筛选阳性克隆。检测阳性克隆LacZ报告基因的活性。提取阳性克隆质粒进行DNA测序与BLAST分析。结果显示,成功构建的诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa两者都没有自激活功能,且pBT3SUC-MgPa的活性强于pBT3STE-MgPa。用pBT3SUC-MgPa转化NMY32酵母作为受体酵母细胞。经DNA测序与BLAST分析结果表明筛选到的28个阳性克隆归属于23个不同的蛋白。从利用分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选到23个与MgPa相互作用的蛋白,为阐明MgPa的功能及Mg可能的致病机制提供参考。     

棉花锌指蛋白GhZFP1相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

GhZFP1蛋白是从盐胁迫棉花幼苗cDNA文库中分离的一种CCCH型锌指蛋白.初步的生物学功能研究表明,过量表达该基因的转基因烟草耐盐性和抗病性显著提高.为深入研究GhZFP1蛋白的作用机制,构建pGBKT7-m1诱饵表达载体,利用酵母双杂交系统从盐胁迫诱导棉花cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白.通过阳性克隆的表型确定、PCR和限制性内切酶检测以及测序和生物信息学分析,获得9个与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白.双分子荧光互补实验证明,GhZFP1与GZIRD19A确实存在互作关系.通过分析这些靶蛋白的已知功能,为研究GhZFP1锌指蛋白的未知生物学功能提供重要信息.     

酵母双杂交中诱饵蛋白载体的构建与鉴定方法

酵母双杂交已是研究蛋白质相互作用的经典方法之一。该方法以真核生物酵母为模型,在体内研究活细胞内蛋白质的相互作用,具有高度敏感性,被很多研究者采用。综述了酵母双杂交系统中诱饵蛋白载体的构建,及其在转化酵母中的毒性、自激活性检测研究的最新进展。     

用酵母双杂交体系确定病毒特异性蛋白与宿主蛋白的相互作用

用B型流行性感冒病毒BM2蛋白开放阅读框架片段,构建酵母双杂交体系中的"饵”载体,明确其在酵母细胞中的表达,排除自身激活作用,并用酵母双杂交法从人cDNA基因库中筛选出与BM2蛋白相互作用的蛋白.结果表明B型流感病毒BM2蛋白与宿主细胞的某一蛋白有相互作用.应用酵母双杂交体系,可以非常有效地从人cDNA基因库中确定与"饵”蛋白相互作用的蛋白基因.     

利用酵母双杂交系统筛选水稻中与OsCRK5互作蛋白

水稻是重要的粮食作物,研究水稻生长发育调控机制可为水稻品种改良奠定理论基础。钙依赖蛋白激酶（calcium dependent protein kinases, CDPKs）是植物中重要的蛋白激酶,参与植物生长发育以及对环境反应的应答。水稻中的CRK5(CDPKrelated kinase 5)在蛋白序列和结构上与CDPK高度同源。为进一步研究OsCRK5在水稻干旱反应中的功能,本研究利用酵母双杂交筛库技术筛选了OsCRK5的互作蛋白。首先将OsCRK5的1-1 332 bp片段克隆至pGBKT7载体中,获得诱饵载体pGBKT7-OsCRK5,经测序无误后,转化至酵母菌株Y2H Gold中。在营养缺陷培养基中观察到重组蛋白不具有毒性作用及自激活活性,同时利用Western blot分析重组蛋白的表达。进一步利用水稻cDNA文库筛选OsCRK5的互作蛋白,共得到77个阳性克隆。功能预测结果显示,互作蛋白涉及蛋白质合成、贮存和降解过程、转录调控、植物细胞生长和分裂过程、能量代谢和细胞代谢等方面的功能。最后,从阳性克隆中选取参与植物干旱胁迫应答的两个蛋白OsWR1和OsDi19-1,利用酵母...     

香蕉红素氧还蛋白酵母双杂交eDNA文库的构建及鉴定

结合改良的BD SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit User Manual cDNA合成试剂盒,反转录合成带有目的接头cDNA第一链,通过LD-PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA).产物经双酶切后回收,与经同样双酶切的酵母双杂交系统中pGADT7载体连接转化,并进行了鉴定.结果表明:提取的RAN的A260/A280=1.82,表明所提RNA纯度高:双链cDNA文库大于0.2 kb,且弥散较长,成瀑布条带状;根据生长菌落计数,文库含有1.2×106转化子,重组子不同插入片段在0.3～2 kb之间.表明该文库达到建库要求,为下一步进行酵母双杂交试验奠定基础.此方法用于构建cDNA文库与酵母双杂交系统相结合的研究目前尚未见过相关报道.     

神经元蛋白3.1结合蛋白的筛选与鉴定

哺乳动物肺组织发育的基本模式总体分为上皮分支的形态发生和分隔膜的形成两个部分．基因p311是克隆到的一个在分隔膜形成阶段特异表达的基因,可能在肺泡发育中起重要作用．为进一步探讨神经元蛋白3.1(P311)对肺发育过程的影响,构建了小鼠肺组织 cDNA文库,以融合Gal4 DNA结合结构域的重组P311蛋白为诱饵,利用酵母双杂交技术从文库中筛选P311结合蛋白．通过免疫共沉淀和双分子荧光互补等技术进一步验证, SPARC(secreted protein, acidic and rich in cysteine)被确定为P311 相互作用蛋白．进一步的研究发现,SPARC在肺组织中具有与P311相似的表达时序特征,双重免疫组织化学染色显示SPARC和P311在小鼠肺组织中共定位于肺泡上皮细胞和肌成纤维细胞中．提示P311可能通过与SPARC的相互作用影响肺泡发育．     

玉米酵母双杂交cDNA文库的构建及ZmCEN互作蛋白的筛选

为阐明玉米中心蛋白(ZmCEN)的生物学功能,采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行研究。提取玉米(Zea mays L.)自交系‘郑58’幼苗的总RNA,利用SMART技术反转录合成ds cDNA,构建以pGBKT7为载体的酵母双杂交cDNA文库;依据ZmCEN基因的CDS序列设计引物,构建重组诱饵载体(pGBKT7-ZmCEN)转化酵母菌株Y2HGold,检测诱饵载体的毒性与自激活能力后,筛选与玉米中心蛋白(ZmCEN)互作的猎物蛋白。将筛选的互作蛋白NAC67和TONNEAU1b(TON1b)再次验证相互作用,并选取互作蛋白TON1b,采用BiFC实验分别构建ZmCEN-pSPYNE和TON1b-pSPYCE BiFC半分子重组载体,转化拟南芥原生质体,进一步验证它们在细胞内的互作;并利用Uniprot和KEGG在线网站对互作蛋白进行gene ontology(GO)注释分析。结果表明:玉米全株幼苗的cDNA文库库容量达到2.56×107 CFU,文库滴度5.36×108 CFU/mL,符合建库要求。经检测诱饵载体无毒性也无自激活功能,所筛选的cDNA文库经测序和Blast比对分析以及共转验证,最终得到28个与诱饵蛋白ZmCEN互作的蛋白质。GO注释显示互作蛋白参与的生物过程有21种。BiFC结果显示,蛋白TON1b与ZmCEN在拟南芥原生质体细胞内互作而形成互补,从而产生黄色荧光,进一步证实了两者存在互作关系。酵母双杂交系统cDNA文库的成功构建与筛选,为进一步研究玉米ZmCEN及其与互作蛋白的作用机制奠定了基础。     

羽衣甘蓝柱头酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

目的:构建应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝柱头cDNA文库。方法:以羽衣甘蓝S13-bS13-b自交不亲和系为材料,提取柱头的总RNA,用亲和层析法分离纯化mRNA,利用CytoTrapXR建库试剂盒构建羽衣甘蓝柱头cDNA文库。结果:羽衣甘蓝柱头cDNA原始文库的库容量为2.5×105;扩增后文库的库容量约为4×108,重组率为96%,插入片段大小为0.4～3kb,平均长度在0.8kb左右。结论:构建了应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝自交不亲和系柱头的cDNA文库,为探讨芸苔属植物自交不亲和的分子机理奠定了基础。     

应用酵母双杂交技术寻找与GGNBP相互作用的蛋白质

生殖细胞缺陷症(gcd)小鼠突变体是20个世纪90年代初发现的一种不育突变小鼠,其不育原因是由于其胚胎期原始生殖细胞的数目低于正常。FancL(也叫Pog)的缺失是引起gcd突变小鼠的原因,FancL基因缺失后可能影响了小鼠胚胎期原始生殖细胞的增殖／存活和成年期小鼠精母细胞的减数分裂。FANCL是一种含有PHD结构域的泛素E3连接酶,是Fanconi贫血复合物的组分之一。在生殖细胞中,FANCL与GGN1和GGN3相互作用,GGN1和GGN2又与一种新的蛋白质GGNBP特异作用。但GGNBP蛋白的功能还不清楚。为了研究GGNBP的功能以及揭示更多的参与该过程的蛋白质,运用Clontech公司新开发的第3套酵母双杂交系统,以GGNBP为诱饵从成年小鼠睾丸cDNA库中筛选与其相互作用的蛋白质基因,发现了一个主要在睾丸中表达的新的基因,其编码的蛋白质产物在酵母系统中与GGNBP特异作用。     

利用酵母双杂交系统在人脑cDNA文库中筛选与禽流感病毒核蛋白相互作用的蛋白质

禽流感病毒核蛋白 (NP) 在病毒的转录、复制以及决定病毒的宿主特异性方面都具有重要作用。通过酵母双杂交系统筛选与核蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解NP蛋白与细胞内蛋白质的相互关系以及流感病毒与宿主的相互关系奠定基础。应用酵母双杂交系统,构建NP诱饵质粒,进而筛选人脑cDNA文库,寻找可能与禽流感病毒NP相互作用的蛋白质。经过酵母双杂交共验证,得到7个与NP相互作用的阳性克隆。该结果为深入了解病毒复制的分子机理及其在蛋白质水平上与宿主蛋白的相互作用关系提供了线索。     

中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交文库的构建

【目的】本研究旨在利用位点特异性重组技术(FullCoV)将中华蜜蜂 Apis cerana cerana 幼虫膜蛋白cDNA连接到pPR3-N载体上,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库。【方法】提取2-3日龄中华蜜蜂工蜂幼虫总RNA;分离mRNA后,在反转录酶的作用下合成幼虫膜蛋白cDNA第1链,并合成双链cDNA。在双链cDNA的5′端加上带有重组序列的接头后,通过FullCoV技术与载体pPR3-N进行连接,然后将连接产物电转化到DH10B感受态细胞,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并对该文库插入片段大小和文库滴度进行检测。【结果】通过FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,经检测,中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库的总库容量为1.5×10^7 cfu,文库滴度为3×10^6 cfu/mL,重组率达到100%。【结论】本研究利用FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库,为进一步探究感染中华蜜蜂的病原微生物与宿主蛋白互作研究奠定了基础。     

斜纹夜蛾酵母双杂交文库的构建及其在蜕皮激素受体互作蛋白筛选中的应用

【目的】蜕皮激素在昆虫变态发育中起着关键的调控作用。蜕皮激素活化为20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)后与蜕皮激素受体二聚体〔蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle protein,USP)〕结合,启动20E诱导的级联反应。本研究旨在从互作蛋白角度探究EcR/USP自身调控的分子机理。【方法】以重要农业害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura为研究对象,通过构建酵母双杂交筛选系统分别筛选了与EcR和USP相互作用的蛋白。【结果】文库转化效率达到3.0×106cfu/μg,文库滴度达到1.3×108cfu/m L,文库插入片段大小在500~2 000 bp之间。4种诱饵质粒(EcRA/p GBKT7,EcRB1/p GBKT7,USP1/p GBKT7和USP2/p GBKT7)对酵母细胞无毒性,并且无自激活性,说明构建的酵母双杂交文库质量可靠。用以上4种诱饵质粒筛选酵母双杂交文库,共得到110个互作蛋白,其中与EcRB1,USP1和USP2互作的蛋白分别有26,52和32个,未筛选到与EcRA互作的蛋白。随后,从中挑选了Dna J-5(Hsp40 homolog 5,一种热激蛋白分子伴侣),MBF2(mediator of Bm FTZ-F1 type 2,一种转录共激活子),polyubiquitin(多聚泛素类蛋白),esr16(ecdysteroid regulated 16k Da protein,一种蜕皮激素调控蛋白)和NEDD8-like(neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated protein 8,一种泛素调节相关蛋白)5种蛋白,利用酵母双杂交和Far-Western印迹法进一步验证了蛋白间的互作关系。【结论】分子伴侣和泛素化修饰等在蜕皮激素受体调控中可能起着重要作用。本研究对深入理解昆虫变态发育的分子机理具有重要意义。     

酵母双杂交筛选与GsCBRLK相互作用的蛋白质

GsCBRLK(calcium/calmodulin-binding receptor-like kinase from Glycine soja)在ABA及盐胁迫诱导的钙离子信号通路中起到关键的调节作用。为深入研究GsCBRLK蛋白的作用机制, 文章采用膜酵母双杂交系统, 以GsCBRLK为诱饵蛋白, 筛选与其相互作用的蛋白质。通过构建野生大豆盐胁迫条件下的cDNA文库、膜酵母双杂交系统筛选、复筛、回转验证、生物信息学分析以及酵母体内互作验证等手段, 最终获得2个(SNARE 和 14-3-3 蛋白)与GsCBRLK诱饵蛋白相互作用的蛋白质。     

Screening of proteins that interact with human thrombopoietin receptor c-Mpl using yeast two-hybrid system

Thrombopoietin (TPO) is the major cytokine involved in platelet production and exerts its effects via the receptor c-Mpl. The yeast two-hybrid system has been used to screen the proteins interacting with c-Mpl. First, the cDNA fragment of c-Mpl intracellular domain was cloned into two-hybrid vector pAS2, and the resulting plasmid is designated as pASMM. Then a human placenta cDNA library was screened using the pASMM as a target plasmid. Seven positive clones were isolated from 150 000 independent transformants. Sequence analysis of one of the positive clones demonstrates that a part of coding sequence of vimentin from 611 bp to 3′ end and flanking non-translation region was obtained. Therefore, there is an interaction between vimentin and TPO receptor. The results suggest that cytoskeletal protein may play an important role in TPO signal transduction pathway.