双链核糖核酸免疫化学研究I．双链多聚[I]：多聚[c]的抗原性

用国产多聚肌苷酸和多聚胞嘧啶核苷酸(简称多聚[I]：多聚[c])制备成双链核糖核酸特异性抗血清,用环状沉淀和’H标记的番茄花叶病毒双链核糖核酸测得抗血清效价分别为1：128和1：6400。用免疫琼脂双扩散、对流免疫电泳和放射免疫测定可测定出多聚[I]：多聚[c]的最低浓度分别为391ng、12．2／ng和10pg／ml抗血清和酵母、TMV、P。X的单链核糖核酸、小牛胸腺DNA不反应。试验证明用国产多聚[I]：多聚[C]制备的抗血清,可有效地用于双链核糖核酸的免疫化学鉴定。由于在免疫双扩散和对流免疫电泳中抗血清能和微量双链核糖核酸反应并产生可见沉淀线,从而有可能利用这两种简便灵敏的方法测定病毒的双链RNA,单链RNA病毒的RF型RNA,以及双链RNA真菌病毒的筛选。     

双链核糖核酸的免疫化学研究 Ⅱ.几种真菌病毒双链核糖核酸的免疫化学鉴定

<正> 1969年以来曾陆续报道用人工合成的多聚[A]:多聚[u]或多聚[I]:多聚[C]和甲基化牛血清白蛋白混合制备成双链RNA抗血清。并用于鉴定RNA病毒的RF型RNA、呼肠孤病毒和真菌病毒双链RNA,以及真菌病毒的筛选。DERRICK,1978;FRANCKI,1972;梁平彦等,1981;MASATO,1973;MOFFITT,1975;SCHWARTZ,1969;STOLLAR,1970。本文报道应用前文制备的多聚[I]:多聚     

双链核糖核酸病毒的研究 Ⅱ.家蚕细胞质多角体病毒免疫学的研究

按前报用分子筛凝胶柱层析纯化家蚕细胞质多角体病毒(Cytoplasmic polyhedrosis virus,以下简称CPV)作为抗原制备了兔抗血清。对接种CPV后不同时间的家蚕中肠组织内CPV的增殖过程进行了观察,表明利用免疫对流电泳在CPV感染后的12～20小时(即病毒在病蚕中肠组织内增殖初期)就可检出。家蚕CPV的抗血清与其他几种昆虫的CPV有免疫交叉反应,但当家蚕CPV的抗血清经双链多聚核苷酸(肌苷酸/胞嘧啶核苷酸,即poly I/poly C)吸收后,则与其他几种昆虫CPV的交叉反应即行消失。     

马铃薯Y病毒普通系外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

将马铃薯Y病毒普通系(PVY0)的外壳蛋白基因克隆到表达质粒pMAL-c2中,构建这一基因在大肠杆菌中的表达载体pMAL-c2-PVY0CP.SDS-PAGE及Western blotting检测结果表明,这一表达栽体在E.coli DH5α中经IPTG诱导可表达分子量为71.8kDa的特异性融合蛋白.以amylose resin亲合柱层析纯化这一融合蛋白为抗原,免疫家兔制备了效价为1:1024的特异性抗血清.用该抗血清可通过对流免疫电泳、免疫双扩散及Western blotting对PVY进行检测.     

茶毛虫核型多角体病毒的血清学特性

用免疫双扩散、对流免疫电泳、酶联免疫吸附试验(ELISA),固相免疫电镜(SPIEM)等技术,对茶毛虫核型多角体病毒(EpNPV)的抗原特性及与其它10种核型多角体病毒的血清学关系进行分析。结果表明,EpNPV粒子的抗血清只能与EpNPV粒子起反应,不与EpNPV的多角体蛋白及其它10种昆虫核型多角体病毒(NPV)粒子发生交叉反应;EpNPV多角体蛋白抗血清除了和其同源的多角体蛋白起反应外,还能和其它两种NPV的多角体蛋白起反应。以上结果说明了EpNPV的结构蛋白具有较高的抗原特异性,而多角体蛋白则没有种间特异性。同时将固相免疫电镜技术应用到昆虫病毒的血清学检测中,取得了较为理想的结果。     

黑曲霉病毒的形态和特性及其在细胞内的表现

从产生糖化酶的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株中分离到一种等轴对称、衣壳表面有突起、内含双链RNA的病毒颗粒。病毒颗柱在电镜下直径为28—33nm,呈六面体晶格排列。病毒在蔗糖密度梯度离心中有三个分部,分析超离心所得沉降系数为161S,118S和94S。病毒在凝胶电泳中为一条带,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中外壳蛋白分子量为90,000、82,000、76,000、52,0000、42,000 道尔顿。提取的病毒与其抗血清在免疫双扩散实验中出现一条沉淀线。病毒核酸有5个组分,与聚肌苷：聚胞苷[poly(1)：poly?]抗血清反应中出现一条沉淀线。在早期菌丝细胞超薄切片中,病毒颗粒多近似球状紧密聚集,外被以膜结构,聚生或散生于胞质中;后期菌丝细胞中病毒颗粒则多散生于胞质中。     

水仙病毒血清学研究Ⅰ．水仙花叶病毒抗血清的制备及其应用

经人工接种分离纯化的水仙花叶病毒（NMV）,以表现局斑的苋色藜叶片为提纯材料,经聚乙二醇（PEG600）沉淀、差速离心和蔗糖密度梯度离心提纯后,进行6次家兔免疫注射制备抗血清。结果表明注射后3周左右效价最高,经毛细管沉淀方法测定可达1：5,000。用琼脂双扩散方法将此NMV抗血清与来自荷兰的NMV抗血清进行比较,结果发现二者的抗体性相同。应用此法制成的NMV抗血清,以琼脂双扩散、ELISA方法分别对30份水仙组培脱毒试管苗样本进行带毒率检测。结果表明所测得的平均带毒率分别为33．3％和80．0％,并用IEM测定方法验证了ELISA结果的可靠性和准确性。     

棉铃虫核型多角体病毒的血清学研究

用提纯的棉铃虫核型多角体病毒(NPV)的多角体蛋白和病毒粒子免疫家兔制备抗血清,用免疫扩散和对流免疫电泳对四林棉铃虫NPV的多角体蛋白和病毒粒于进行了血清学比较研究。四株棉铃虫NPV分为两个包埋类型：单粒包埋型和多粒包埋型。soI．{3株和H．M株属前者,VHA 273株和XIA 10株属后者。同一株NPV的多角体蛋白或病毒粒子只与它们同源抗血清有反应。它们之间无交叉反应,表明同一株NPV的多角体蛋白和病毒粒子各具有特异的抗原。四株NPV的多角体蛋白不仅与同源的多角体蛋白抗血清有反应,而且也与异 源的多角体蛋白抗血清有交叉反应,说明四株NPV多角体蛋白具有共同的抗原。而四株病毒粒子与同源的病毒粒子抗血清有反应,在它们之间无交叉反应,表明四株NPv病毒粒子各具有自己特异的抗原。     

马铃薯Y病毒普通系外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

将马铃薯Ｙ病毒普通系（ＰＶＹ０）的外壳蛋白基因克隆到表达质粒ｐＭＡＬｃ２中,构建这一基因在大肠杆菌中的表达载体ｐＭＡＬｃ２ＰＶＹ０ＣＰ。ＳＤＳＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测结果表明,这一表达栽体在Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α中经ＩＰＴＧ诱导可表达分子量为７１．８ｋＤａ的特异性融合蛋白。以ａｍｙｌｏｓｅｒｅｓｉｎ亲合柱层析纯化这一融合蛋白为抗原,免疫家兔制备了效价为１∶１０２４的特异性抗血清。用该抗血清可通过对流免疫电泳、免疫双扩散及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ对ＰＶＹ进行检测     

中华眼镜蛇蛇毒因子(CVF)对补体系统的作用及与人补体C[3]和其他蛇毒抗原性关系

中华眼镜蛇蛇毒经DEAE-Sepharose CL-6B、HPLC等多次柱层析分离出有抗补体及溶血活性的眼镜蛇蛇毒因子（Cobra venon factor,CVF)，纯化后的CVF在聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上呈单一区带，分子量为225000—230000，等电点为6.20。用二硫苏糖醇还原经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳得三类亚基，其分子量总和为237000。体外抗补体及溶血试验表明，CVF的作用是通过补体旁路途经使总补体活力下降。双向免疫电沪鉴定，发现CVF与人血清作用后，其中补体成分C[3]分子的抗原性发生改变，则表明CVF的作用是通过激活补体成分C[3]而发挥的。给豚鼠腹腔注射CVF（0.15 μg/g体重）后，其血清总补本水平下降到正常值的3%以下，7天后回升，13天后恢复到正常水平。单相免疫电泳表明，CVF与人补体C[3]抗血清间无任何交叉免疫反应，但人血清与CVF抗血清间有微弱的免疫沉淀反应。另外，CVF的氨基酸组成与人补体C[3]也较为相似。鉴定还表明眼镜蛇科中四种蛇毒与CVF抗血清有强烈的免疫沉淀反应，蝰蛇毒及海蛇毒也有免疫沉淀反应，但只有眼镜蛇毒具有抗补体活性。     

腮腺炎病毒抗血清的制备

以制备适用于疫苗生产检定中病毒鉴别试验和外源因子检查的高效价腮腺炎病毒抗血清为目的。用腮腺炎病毒接种SPF鸡胚尿囊腔,培养收取病毒尿液免疫SPF鸡,采集抗血清。腮腺炎病毒接种Vero细胞,培养病毒抗原经PEG沉淀,超速离心法纯化后免疫家兔采集抗血清。比较两种免疫方法所得病毒抗血清效价。结果显示SPF鸡抗腮腺炎病毒血清中和抗体GMT为1:1716,兔抗腮腺炎病毒血清中和抗体GMT为1:732。两种动物抗血清均适用于疫苗生产相关检定。免疫SPF鸡制备的病毒抗血清无特定病原及抗体污染,是毒种外源因子检测和疫苗鉴别试验的理想试剂。免疫SPF鸡制备病毒抗血清的程序简单,结果易于验证,有利于生物试剂标准化。     

瓯江2种(鱼骨)的ISSR分析优化和自然种群遗传多样性的研究

以唇[鱼骨]和花[鱼骨]为材料,对影响PCR反应的主要因子-模板DNA、引物、dNTPs、Mg2＋、Taq酶浓度进行优化,建立了适合唇[鱼骨]和花[鱼骨]基因组DNA的ISSR—PCR反应体系。25灿L的PCR反应液含有的组分和终浓度分别为：约60ng模板DNA、1．2UTaq酶、0．4μmol／L引物、2．0mmol／LMgCl,、0．2mmol／LdNTPs、2％甲酰胺。利用优化反应体系从60个ISSR引物中,筛选出18个稳定性高、重复性好的引物,对25个唇[鱼骨]个体和22个花[鱼骨]个体的DNA进行正式扩增,分别从两个种群分别扩增到168和156条扩增谱带,扩增片段长度在200--1500bp之间。根据扩增结果计算出两个种群的多态位点比例分别为67．52％和53．21％,Shannon多样性指数分别为0．3450和0．2749,Nei’s指数分别为0．2292和0．1837,平均有效等位基因数分别为1．3875和1．3169。两个种群内样本间的平均遗传距离分别为0．2129和0．1529,结果表明两个种群的遗传多态性较高,其中唇[鱼骨]的多样性明显高于花[鱼骨]群体。引物UBC845扩增的610bp带和UBC854扩增的1240bp带为唇[鱼骨]种的特异性谱带。[鱼骨]属鱼类基因组中均含有微卫星DNA序列：（AG）8、（GA）8、（CT）8和（GAA）8。本研究为唇[鱼骨]和花[鱼骨]的种质保护、合理开发利用以及选择育种提供了一些基础数据。     

马铃薯种薯生产的研究III．马铃薯Y病毒抗血清制备和诊断方法

用0.1 M Tris-Hcl(内含0.05M EDTA)或0．5M PB作提取液,以含0．5M,尿素的0.01 M PB回溶病毒沉淀,以防止病毒凝聚。通过PEG沉淀和反复两次差速离心,提取了由马铃薯“男爵”分离的阿Y分离物。电镜照片表明为形态均一的弯曲眭线状粒体。产量约为2毫克／100克鲜鼋叶片。以PVY—I抗原免疫家兔,用Frd全佐剂进行肌肉注射的方法,制备出PvY-I抗血清,其妓价在2560—5l 20。抗血清和PVx、rMV分离物,以及正常烟草叶片汁液无明显反应。应用PVY_I抗血清冻干剂,用微量凝聚和微量沉淀的方法鉴定马铃薯幼芽和感Y痫毒叶片汁液中的Y病毒,表明具有一定可靠性。由制备的抗血清提取免疫球蛋白致敏乳胶,可测出提纯的PvY抗原最低含量为L．52—2．2微克／毫升,可测出感染烟草叶片汁液的最高稀释度为I：100。制备的抗血清冻干粉和微量凝聚的血清学方法已用于1978和l 979年内蒙古自冶区乌盟后旗无病毒原种场的种薯田间鉴定。     

兔的一种新病毒 IlI.兔出血症病毒形态的超微结构和抗原性的研究

1986年春,武汉市第二制药厂(WSPMM)试验用家兔突然口鼻渗出鲜血,几乎全部猝死。作者观察了罹病死亡的症状,认为此病例与黄印尧等所报道的相同。湖北省中医药研究院(HTCMI)也发生此病的流行。作者对这两种不同来源的病料,进行相同的处理,提取病毒粗纯物,回接同种动物,可引起同样典型的发病症状。进一步将死亡兔的肝、睥等脏器组织匀浆。经低速、高速、超速和蔗糖密度梯度离心后制样,电镜观察可见典型的病毒柱子。以上两种病毒粒子制备的抗血清和南京农业大学的兔出血症病毒抗原在双扩散沉淀中,产生典型的沉淀反应,说明三种病毒抗原的一致性。但是湖北株、南京农业大学病毒株抗原和日本细小病毒的抗血清,在双扩散反应时均无沉淀反应。湖北株病毒的形态大小、超微结构、外壳蛋白的 多肽和血清学特性,均不同于标准兔细小病毒,可能是一新的病毒。     

水仙病毒血清学研究I.水仙花叶病毒抗血清的制备及其应用

经人工接种分离纯化的水仙花叶病毒（NMV）,以表现局斑的苋色藜叶片提纯材料,经聚乙二醇（PEG6000）沉淀、差速离心和蔗糖密度离心提纯后,进行6次家兔免疫注射制备抗血清。结果表明注射后3周左右效价最高,经毛细管沉淀方法测定了可达1：5,000。用琼脂扩散方法将此NMV抗血清与来自荷兰的NMV抗血清进行比较,结果发现二者的抗体性相同。应用此法制成的NMV抗血清,以琼脂双扩散、ELISA方法分别对30份水仙组培脱毒试管苗样本进行带毒率检测。结果表明所测得的平均带毒率分别为33．3×和80．0％,并用IEM测定方法验证了ELISA结果的可靠性和准确性。     

树[鼠句]的基本实验操作方法

目的对树[鼠句]抓取和保定、采血、灌胃基本实验技术方法进行探讨,逐步规范树[鼠句]实验技术。方法选用成年树[鼠句]进行抓取和保定,分徒于法和器具法（自制捕捉保定袋）,对130只树[鼠句]采用尾静脉、股动（静）脉两种采血方法;采取人用8号胃管可对树[鼠句]绎口灌胃给药。结果所采用徒手、器具的方法抓取和保定树[鼠句]均能有效地控制动物,不会发生动物死亡或很少逃逸;两种方法都顺利采集到所需血量,股动（静）脉单次最大采血量可达2mL而不损伤动物;12只树[鼠句]连续灌胃10d,成功率100％。结论自制的捕捉保定袋经济实用,摸索的几种树[鼠句]实验技术方法具有操作简便、安全、快捷等优点。     

马铃薯卷叶病毒的分离、提纯及抗血清制备

同马铃署品种“小叶子×多子白”和“米拉”分离了马铃薯卷叶病毒。用0．2M磷酸缓冲液榨汁,滤渣经液氮冷冻,捣碎,匀浆以代替加入酶制剂,在差速离心后,用Scpbadex G—200凝胶过尊和蔗塘密度梯宝离心,从蚜虫接种的马铃薯和洋酸浆的茎叶中提纯了PLRV。其紫外最大吸收在260nm,最低吸收在240 nm,0．D 260／280nm 比值为1．70。 提纯能病毒粒体在电镜下观察为等轴20面体,表面形态亚单位清晰可见。粒体平均直径为23．9 8nm。用提纯的 PLRV免疫啄鼠阳家兔,在国内首次制备出高效价特异性的PLRV抗血清。用对流免疫电泳测得抗血清最高效价为1／4096。应用适当稀释的抗血清,以对流免疫电泳的方法,可直接诊断感染卷叶病的马铃薯茎叶中的PLRV。     

滋养细胞胞内双链DNA感受器通过MAPK/IκB信号介导炎性细胞因子分泌

目的:探究滋养细胞能否感受胞内双链DNA刺激及其对炎性因子分泌的影响,揭示胎盘的免疫识别和免疫屏障功能,探讨妊娠期感染所致不良妊娠结局的发病机制。方法:利用人工合成的双链DNA模拟物poly (dA:dT)转染人滋养细胞系HTR-8/SVneo,Real-Time PCR方法检测滋养细胞胞内双链DNA识别受体的表达水平;Western Blot检测滋养细胞MAPK和IκB信号的活化情况;ELISA检测HTR-8/SVneo细胞培养上清中IL-6、IL-8、MCP-1、CXCL10的分泌水平。结果:Real-Time PCR结果表明,HTR-8/SVneo能够感受胞内双链DNA刺激并上调包括IFI16、AIM2、DHX36、DHX9、LRRFIP1、KU70、ZBP1/DAI和DDX41在内的多种双链DNA感受器的m RNA表达水平;Western Blot实验结果表明,滋养细胞识别双链DNA后能够促进MAPK和IκB信号通路活化,转染90分钟后ERK、JNK、p38和IκBα的磷酸化水平最高,其后随着时间逐渐减弱;加入IκB、p38和JNK特异性抑制剂能够抑制poly(dA:dT)介导的IL-8、IL-6和CXCL10分泌,但其分泌不受ERK抑制剂的影响;MCP-1的分泌能够被p38和JNK抑制剂阻断,但p38和ERK抑制剂不影响其分泌。结论:人滋养细胞存在功能性胞内双链DNA识别机制,活化的DNA识别信号能够激活MAPK和IκB信号通路,并通过IκB、p38或JNK信号介导IL-8、IL-6、MCP-1及CXCL10等细胞因子和趋化因子的分泌。     

高通量测序技术在可选择性多聚腺苷酸化研究中的应用

可选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)在基因表达调控中起着重要的作用。位于最后一个外显子的APA可以产生具有不同3'UTR长度的mRNA异构体,在细胞中可影响信使RNA(messager RNA,mRNA)的稳定性、翻译效率、转运及亚细胞定位等。随着第二代高通量测序技术的发展,研究人员近年来发展了许多高通量测序文库制备方法,对全基因组APA进行测序和分析。综述了当前研究全基因组水平APA的技术,并且总结了APA与一系列关键生物现象的关系,包括免疫应答、神经反应、胚胎发育和肿瘤发生等。随着APA研究的深入,APA越发成为新的基因转录与翻译调控的研究热点。     

维生素C多聚磷酸酯对小鼠肝脏抗氧化物酶基因转录的影响

为研究维生素C多聚磷酸酯对小鼠肝脏脂质抗氧化物酶基因转录的影响,将24只3-4周龄、体重为16-22g的健康雄性小鼠随机分为4组,分别在饵料中添加0、500、2500和5000mg/kg的35%维生素C多聚磷酸酯,喂食4周后取其肝脏,用Trizol法抽提总RNA,利用RT-PCR方法对小鼠肝脏超氧化物歧化酶基因、过氧化氢酶基因和谷胱甘肽过氧化物酶基因的mRNA进行分析。结果表明,维生素C多聚磷酸酯对小鼠肝脏抗氧化物酶基因的转录有显著性影响(P<0·05)。维生素C多聚磷酸酯添加量为2500和5000mg/kg的两组,过氧化氢酶基因的mRNA水平明显高于对照组;维生素C多聚磷酸酯添加量为2500和5000mg/kg的两组超氧化物歧化酶基因的mRNA水平明显高于对照组,其中5000mg/kg组的mRNA水平明显高于其它三组;维生素C多聚磷酸酯添加量为5000mg/kg组,谷胱甘肽过氧化物酶基因的转录活性明显高于其它三组(P<0·05)。研究结果表明:高剂量的维生素C多聚磷酸酯能促进小鼠抗氧化物酶基因的转录活性,但促进不同抗氧化物酶基因转录所需的维生素C多聚磷酸酯的量不同。