同时利用AOX1和GAP启动子表达SAM合成酶促进重组毕赤酵母中S-腺苷甲硫氨酸积累

利用重组毕赤酵母(Richia pastoris)强化表达S-腺苷甲硫氨酸(S-adenvylmethionine,SAM)合成酶(SAM synthetase,SAMS),发酵生产SAM时,胞内SAMS活性和ATP水平是影响SAM合成的重要因素.为了同时保持较高的SAMS活性和ATP供应,我们构建了一株既含有AOX1诱导型表达单元,又含有GAP组成型表达单元的双SAMS表达单元P.pastoris重组菌株Gd.它既能受甲醇调控表达SAMS,又能以甘油为碳源表达SAMS.在培养过程中,先是以甲醇诱导SAMS表达,得到较高的酶活,然后在发酵中后期再将碳源换为甘油.这样不但可以维持较高的酶活,而且可以提高胞内ATP含量.实验结果显示,对于同时利用AOX1和GAP启动子表达SAMS的重组菌,可采取甲醇和甘油两阶段补料,该重组菌的SAMS比产率高于组成型重组茵Xg,Gd进入甘油补料期后胞内ATP含量高于诱导型重组菌Ga.双表达单元菌株Gd的SAM产量达到1.41 g/L,比诱导型表达SAMS的重组菌株提高了76.3%,比组成型表达SAMS的重组菌株提高了60.2%,.     

琼胶酶AgaD在大肠杆菌中的高效表达

摘要:【目的】构建琼胶酶AgaD的高效表达体系,优化发酵条件提高重组酶的表达量。【方法】首先根据大肠杆菌(E.coli)密码子偏好性,优化并合成AgaD的基因,使其适合E.coli表达系统;考察了不同的E.coli表达宿主;根据N端法则构建了突变体;评价了培养基中添加CaCl2和甘氨酸(Gly)对重组酶表达的影响。【结果】成功构建了琼胶酶AgaD 的高效表达体系,确定了E.coli AD494(DE3)为最适表达宿主;利用N端法则提高了重组酶的稳定性,缩短了发酵时间;通过在培养基中添加CaCl2和甘氨酸(Gly)进一步提高了胞外酶产量。最终,发酵上清中重组酶的活力由20 U/L提高至11300 U/L,比优化前提高了500余倍。【结论】构建了琼胶酶AgaD的高效表达体系,为GH96家族琼胶酶的深入研究奠定了基础。     

耐碱性木聚糖酶基因在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究

从木聚糖酶高产短小芽孢杆菌 (Bacilluspumilus)BP5 1中克隆得到木聚糖酶基因xynA ,将其构建在芽孢杆菌表达载体pWH1 5 2 0中得到重组质粒pWSX1 1。xynA由木糖诱导xylA启动子调控xynA表达。采用同源高效表达策略 ,以原生质体转化方法将pWSX1 1转回原始菌株BP5 1中 ,获得重组菌株BPX1 1。通过木糖诱导重组菌株中的xy nA基因高效分泌表达 ,使木聚糖酶产酶活力比原菌株BP5 1提高了 87% ,同时对重组表达的木聚糖酶的酶学性质进行了初步研究     

Pfu酶原核的高效表达及其活性分析

目的:在大肠杆菌中高效表达重组Pfu酶.方法:将pfu基因构建于载体pET28a上,重组质粒pET28a-pfu转化DH5α,获得了含pET28a-pfu重组表达菌株.在重组菌株OD600为0.2时,经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达10～12 h后,菌体超声波破壁后,80℃条件下热变性30 min去除部分杂蛋白;粗酶液再经Ni离子亲和层析进一步纯化.结果:获得了高纯度的重组Pfu酶,利用该酶成功扩增出目的基因片段.结论:纯化的Pfu酶具有较高的活性,比活性为62 500 U/mg,该研究表达的重组酶完全可以替代商用Pfu酶.     

重组α-环糊精葡萄糖基转移酶表达条件的优化及其产物专一性的分析

将来源于Bacillus sp 602 -1的α-环糊精葡萄糖基转移酶(ot-CGT)基因(cgt)插入到表达载体PQE30中,构建重组质粒PQE30/cgt,成功转化宿主菌E coli M15后,得到重组菌株E coli M15 (PQE30/cgt).在IPTG的诱导下得到酶表达的最适条件:TB培养基,0.01 mmol/L IPTG,诱导温度16℃,胞内酶比活力最高可达5 209 U/mL;加入IPTG 24 h后,添加甘氨酸和甘露醇会促使酶向胞外分泌.酶蛋白自诱导表达的适宜条件为在TB培养基中添加乳糖3.0 g/L,葡萄糖1.2 g/L,16℃培养96 h,酶比活力达到8 635 U/mL,明显高于IPTG诱导的效果.通过SDSPAGE验证了上述结论.酶催化转化实验表明:重组酶转化质量分数为1％可溶淀粉24h后,α-环糊精(α-CD)转化率可达38.2％,α和β的峰面积比约为3.4:1,α-CD具有较高的专一性,因此该重组α-CGT酶具有较好的工业化应用前景.     

斑马鱼尿酸氧化酶基因的克隆与原核表达

目的探讨斑马鱼尿酸氧化酶基因的克隆与原核表达的方法,研究重组斑马鱼尿酸氧化酶(ZUO)的理化性质与生物学功能。方法用PCR的方法克隆斑马鱼尿酸氧化酶基因,用pET28a质粒进行原核表达。结果成功克隆了斑马鱼尿酸氧化酶基因并完成了测序鉴定,该基因在大肠杆菌表达系统中得到有效表达且具有体外氧化尿酸的生物学功能。目的蛋白为胞内可溶性蛋白,占可溶蛋白总量的50%左右。最佳诱导条件为27℃16 h,粗酶最佳溶解pH为9.16,在此缓冲液溶解条件下,粗酶比活性为1.94 U/mg。获得的重组ZUO产量达64.8 U/g湿菌,高于直接从动物肝脏组织萃取的尿酸氧化酶。结论斑马鱼尿酸酶基因能在大肠杆菌表达系统中表达,其溶解pH比基因工程表达的重组猪尿酸氧化酶略低,对后续开发痛风治疗新药有利。     

Thermus thermophilus HB8葡萄糖异构酶在大肠杆菌中表达

为了增加高热稳定性的葡萄糖异构酶的得率,采用PCR技术扩增得到Thermus thermophilusHB8葡萄糖异构酶基因xylA,连接到表达载体pET-22b( )上,获得重组质粒pET-22b( )-xylA。将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导后,通过半胱氨酸-咔唑法测葡萄糖异构酶酶活。重组菌经诱导培养,SDS-PAGE电泳结果显示出明显的分子量约为44 kD特异性蛋白质条带,比酶活约为18.562 U/mg,比野生型菌株提高了2倍。     

粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中组成型表达及分离纯化

将粪产碱杆菌青霉素G酰化酶基因构建重组表达质粒pKKFPGA ,pKKFPGA再转化宿主菌DH5α,所得重组菌不需诱导便能高效表达青霉素G酰化酶 ,表达量达 2590u L ,比野生型粪产碱杆菌表达量高432倍 ,其菌体比活力达300 (u L) A₆₀₀。菌体破碎后的上清液经DEAE-SepharoseCL 6B离子交换层析和Butyl-SepharoseCL 4B疏水层析 ,即可得纯度提高 20倍、比活为 686u mg的青霉素G酰化酶 ,两步纯化的总收率达 91%。Western印迹分析表明5%的原前体青霉素酰化酶在胞内形成了包涵体 ,说明其成熟的限速步骤在胞内的运输阶段.     

葡萄糖脱氢酶高产工程菌的构建及融合蛋白的一步纯化

PCR扩增葡萄糖脱氢酶基因(glucose dehydrogenase, gdh),连接到测序载体pUC19,转化大肠杆菌JM109,测序(GenBank登录号:EF626962)后,亚克隆到表达载体,转化大肠杆菌M15,筛选得到GDH高产工程菌M15/pQE31-gdh8.工程菌经IPTG诱导表达,超声波破碎,粗酶液比活力高达15 U/mg.镍凝胶柱亲和层析纯化表达蛋白,超滤、冻干后,比活力达360 U/mg.重组质粒pQE31-gdh8在E .coli M15中稳定程度高达99.8%.工程菌M15/pQE31-gdh8诱导表达的重组酶活力高,易纯化,重组质粒稳定程度高,具有良好的工业应用前景.     

氨基脱氧分支酸合成酶对Corynebacterium glutamicum SYPS-062积累L-丝氨酸的影响

为阐明氨基脱氧分支酸合成酶(ADC合成酶)在Corynebacterium glutamicum SYPS-062体内积累L-丝氨酸过程中的作用,通过交叉PCR以及同源重组的方法敲除叶酸途径关键酶ADC合成酶的编码基因pabAB,构建了叶酸缺陷型菌株Corynebacterium glutamicum SYPS-062△pabAB,同时构建pabAB基因增强表达重组菌C.glutamicum SYPS-062(pJC Ⅰ-pabAB).分别考察了ADC合成酶对菌株生长的影响、对L-丝氨酸降解途径关键酶丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的影响以及其对L-丝氨酸积累的影响.结果表明,与出发菌株相比,增强表达基因pabAB重组菌的ADC合成酶的酶活力提高了33%.SHMT酶的酶活力提高了30%,其最大比生长速率(μm)提高了48%,单位细胞产酸率(Yp/x)降低了36.2%;而敲除基因pabAB重组菌的ADC合成酶的酶活力降低了61%.SHMT酶的酶活力降低了20%,最大比生长速率降低了32%,单位细胞产酸率提高了12%.     

生产疫苗的植物表达系统

综述了近些年来转基因植物作为疫苗表达系统的新进展,比较了植物表达系统相对其他表达系统的优点,介绍了不同介导方式的植物表达系统,包括农杆菌介导的转化和重组植物病毒表达疫苗,讨论了提高表达效率的载体构建策略,对其应用前景提出了展望。     

A hormone response element in the human apolipoprotein CIII (ApoCIII) enhancer is essential for intestinal expression of the ApoA-I and ApoCIII genes and contributes to the hepatic expression of the two linked genes in transgenic mice

We have generated transgenic mice carrying wild-type promoters of the human apolipoprotein A-I (apoA-I)-apoCIII gene cluster or promoters mutated in their hormone response elements. The wild-type cluster directed high levels of apoA-I gene expression in liver and intestine, moderate expression in kidney, and low to minimal expression in other tissues. It also directed high levels of chloramphenicol acetyltransferase (CAT) expression (used as a reporter for the apoCIII gene) in liver, low levels in intestine and kidney, and no expression in other tissues. Mutations in the apoCIII promoter and enhancer abolished the intestinal and renal expression of the apoA-I gene, reduced hepatic apoA-I expression by 80%, and abolished CAT expression in all tissues. A similar pattern of expression was obtained by mutations in the apoCIII enhancer alone. Mutations in the proximal apoA-I promoter reduced by 85% hepatic and intestinal apoA-I expression and did not affect CAT expression. The findings suggest that a hormone response element within the apoCIII enhancer is essential for intestinal and renal expression of apoA-I and apoCIII genes and also enhances hepatic expression. The hormone response elements of the proximal apoA-I promoter or the apoCIII enhancer can promote independently low levels of hepatic and intestinal expression of the apoA-I gene in vivo.     

肾细胞癌CD15和BCL—2的表达及临床意义

为了探讨评估肾细胞癌（RCC）预后指标,应用免疫组化法研究60例RCC中细胞粘附分子CD15和Bcl-2蛋白表达及其相关关系。结果表明,在RCC中CD15和Bcl-2表达阳性率分别为70.0%和61.7%。CD15高表达与RCC分级、分期和淋巴结转移有关。Bcl-2低表达与RCC分级有关,与其分期和淋巴结转移无关。CD15表达与Bcl-2表达呈负相关。结果提示,CD15表达是RCC发生、发展和转移的指标,Bcl-2是RCC发生的早期事件。     

蛋白核酸合成抑制剂和蛋白磷酸化对基因表达的调节

环己酰亚胺和放线菌素D明显降低小麦幼苗中BADH基因的表达,表明BADH基因表达在转录和转译水平上受到调控。氯霉素则有增加表达的效应。线粒体可能形成阻遏蛋白参与调节。H7和甘露糖降低BADH基因表达,相应地冈田酸(Okadaic acid)明显增加表达,说明蛋白磷酸化积极参与小麦幼苗中BADH基因表达的调节。     

235例浸润性乳腺癌中P53、ER的表达及其相关性探讨

目的:分析浸润性乳腺癌中P53和雌激素受体(estrogen receptor,ER)的表达及其与患者临床病理特征的关系和二者之间的相关性,探讨其在浸润性乳腺癌发生发展中的作用。方法:收集我院2008年至2013年6月收治的原发浸润性乳腺癌手术病例235例,采用免疫组化SP法检测乳腺癌组织标本中P53与ER的表达,分析其与患者临床病理特征的关系及二者之间的相关性。结果:本组乳腺癌组织中P53与ER的阳性表达率分别为31.9%及56.6%,均显著高于癌旁正常组织(P0.05)。乳腺癌组织中ER的表达仅与患者的年龄有关,与TNM分期无关;而P53的表达与患者的年龄和TNM分期均无关,但P53与ER的表达呈显著负相关(P0.05,r=-0.174)。结论:P53与ER在浸润性乳腺癌中均呈高表达,且二者呈显著负相关。     

抑制Dicer基因对shRNA功能发挥的影响

本文将Dicer基因的RNA酶III结构域作为靶区,设计并构建了两个抗Dicer基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,将其转染2215、结肠癌TC细胞和基因组中整合有绿色荧光蛋白基因(GFP)的HepG2A9细胞,通过RT-PCR评价RNA干扰抑制Dicer基因表达的效率;当HepG2A9细胞Dicer基因表达被上述RNA干扰抑制时,再转染抗GFP的shRNA表达载体,通过RT-PCR和荧光显微镜观察GFP表达水平。结果显示,在不同细胞系中,这两个抗Dicer基因shRNA表达载体,均能明显抑制Dicer基因的表达;当Dicer基因受抑时,后续转染抗GFP的shRNA表达载体不能有效抑制GFP的表达。结果表明,抗Dicer基因shRNA表达载体,能够明显抑制Dicer基因的表达;shRNA表达载体的功能发挥需要Dicer酶的直接参与。     

利用RNA干扰抑制具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的表达

目的:构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白(RBPMS)基因siRNA的真核表达载体,观察其对RBPMS表达的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对RBPMS基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上。将重组质粒和带FLAG标签的RBPMS共转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检验RNAi效应。结果:测序证明成功构建了RBPMSsiRNA真核表达载体;Western印迹表明构建的siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。结论:构建了RBPMSsiRNA的真核表达载体,该siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。     

The expression of chicken NOV, a member of the CCN gene family, in early stage development

The nephroblastoma overexpressed gene, NOV, is a member of the CCN gene family. We investigated the NOV gene expression pattern in the chicken during early stage embryogenesis. Several embryonic structures showed a distinct expression pattern. The initial expression was detected in Hensen's node (Hamburger and Hamilton stage (HH) 5). The expression was noted in the presumptive notochord and floor plate forming cells. The expression on the left side was more elongated posteriorly, a type of left-right asymmetry. Chicken NOV gene expression in the forming notochord and floor plate was observed until HH 18. The expression was also detected in the ventral area of the mesencephalon and isthmus at HH 14-16.     

NP c 1L l 在高脂血症和动脉粥样硬化中的表达分析

目的：研究NPC1L1（Niemann-Pick C1 Like 1）mRNA在单纯高脂血症大鼠和动脉粥样硬化大鼠小肠组织中的表达与差异,探讨其与脂质代谢和动脉粥样硬化之间的关系。方法：通过半定量RT-PCR方法分别检测正常普食组、单纯高脂饲养组和动脉粥样大鼠组小肠组织中NPC1L1 mRNA的表达差异。结果：三个组别大鼠小肠组织中均存在NPC1L2 mRNA,单纯高脂饮食和动脉粥样大鼠小肠组织中NPC1L1 mRNA表达明显高于正常对照大鼠（P〈0．01）;单纯高脂饮食和动脉粥样大鼠小肠组织中NPC1L1 mRNA表达之间无明显差异（P〉0．05）。结论：血脂代谢紊乱与小肠组织中NPC1L1的高表达有关,NPC1L1可能参与了血脂紊乱的病理生理过程;NPC1L1与促成动脉粥样硬化的发生无明显相关性。