2018年甘肃省平凉市流行性乙型脑炎病毒的分子特征

为研究甘肃省2018年蚊虫携带流行性乙型脑炎病毒(简称乙脑病毒)的分子特征,2018年7月上旬在甘肃省平凉市4个县采集蚊虫标本,采用实时荧光定量RT-PCR方法开展乙脑病毒筛查;通过高通量测序方法对乙脑病毒基因扩增阳性蚊虫标本进行深度测序研究.结果显示,本次调查在4个县共采集蚊虫1800只,均为三带喙库蚊,分36批研磨和检测.定量RT-PCR结果显示10批(27.8％)蚊虫样本呈乙脑病毒基因扩增阳性.对10批样本进行高通量测序共获得59.7 M读序,其中5.3 M(8.9％)条读序能够比对到病毒基因组数据库上,经注释属于14科15属28种病毒.在其中7批样本中检出乙脑序列共1357条,基因组覆盖度为9.5％-83.1％.系统进化分析显示甘肃省2018年采集的三带喙库蚊中乙脑病毒为基因Ⅰ型.     

龙岩市一起暴发性脑炎疫情分离的埃可病毒6型基因特征分析

对2010年福建省龙岩市长汀县埃可病毒6型(ECHO6)肠道病毒引起的暴发性脑炎,进行病原学分析,为该病的防控提供有价值的信息。对病例脑脊液标本进行荧光RT-PCR、病毒分离(RD细胞)、中和鉴定进行病原确认,再经PCR法对其中4株毒株进行VP1片段或全基因组核苷酸序列测定,用DNAStar软件中的MegAlign等软件进行同源性分析,Mega 4.0软件进行进化树分析。经病原学检测方法确认为ECHO6型肠道病毒,VP1片段核苷酸序列分析显示为C2亚型。全基因组序列共7 407个核苷酸,与其他ECHO病毒和CVB(Coxsackie virus B)病毒基因组构成相似,同源性为78.5%~87.3%。此次暴发性脑炎是由肠道病毒ECHO6C2亚型引起,病毒株全基因组序列长度与标准株(U16283)相近,同源性达80.4%。     

汉坦病毒的MRNA:编码策略、核苷酸序列和基因顺序

汉坦病毒的M基因组片段在分子水平上被克隆了。检测了CDNA的核苷酸序列。病毒的RNA是3616个碱基长,3′和5′末端的核苷酸序列由18个碱基互补。在病毒互补的有意义的RNA中,一条单股开放长链的阅读片段具有编译1,135个氨基酸或126,000道尔顿多肽的潜力。检测了分离的G_1和G_2被膜糖蛋白氨基酸序     

应用深度测序技术鉴定平菇球形病毒

旨在鉴定采集于北京顺义的畸形平菇样品中的病毒,提取总RNA,构建小RNA库,对小RNA库进行深度测序。测序结果表明,与平菇球形病毒(Oyster mushroom isometric virus,OMSV)基因组序列(NC_004560.1)匹配的小RNA共有3 075条,分布在OMSV基因组的不同位置,形成一些热点区域。经拼接,获得了3条长度大于500个核苷酸的序列。根据其中覆盖OMSV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因的序列(seq22)中相对保守区域,设计引物,利用RT-PCR扩增获得cp基因部分序列。序列比对表明,其与OMSV相应区域序列相似度为91%,证实了OMSV在畸形平菇样品中的侵染。同时,将深度测序结果与现有4种si RNA预测软件的预测结果进行比较,发现测序结果与软件预测结果之间存在差异,讨论了这一差异出现的原因。     

新疆奶牛戊型肝炎病毒RNA检测及序列分析

从新疆两个奶牛场的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)抗体检测阳性的奶牛中分别采集牛粪便或肛拭子样品,利用反转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)检测所采集样品中的HEV RNA,结果来自第一个奶牛场的7份牛粪便样品为阳性,阳性率11.67%,来自第二奶牛场的1份肛拭子样品为阳性,阳性率为3.23%。将PCR扩增产物克隆、测序并进行序列分析,结果表明,对应于HEV ORF2 189bp核苷酸序列的8个牛源HEV基因组扩增片段的同源性为96.3%~100.0%,应当属于相同的基因型;它们与HEV 1、2、3和4型ORF2 189bp核苷酸平均同源性分别为78.5%~86.4%,81.7%~83.8%,79.1%~85.3%和84.3%~95.8%,与4型的同源性最高达93.2%~95.8%。基于这些已测序核酸片段绘制的基因进化树显示:本研究中的8株牛源HEV ORF2 189bp核苷酸序列与HEV 4型人源C5株、猪源swC3与swXJ株位于同一进化枝上,同属HEV基因4型,提示新疆奶牛中可能存在HEV感染,并且奶牛可能是人类HEV传染源中除猪之外的新宿主。     

轮状病毒的LLR疫苗株全基因组克隆及结构蛋白VP6基因遗传特征

目的了解轮状病毒(RV)的LLR疫苗株全基因组基因和蛋白特征、完善关键基因遗传稳定性研究,为疫苗的质量控制和研发提供依据。方法将LLR株毒种第38代在原代牛肾细胞上连续传至49代,提取第38、43、44、49代病毒RNA。通过RT-PCR方法扩增LLR株(38代)全基因组11个dsRNA片段和传代病毒VP6基因,分别将其克隆到p GEM-T载体中,进行序列测定与分析。结果 LLR株全基因组11条RNA,由18 498个核苷酸组成,共编码5 796个氨基酸;全基因组研究表明,所克隆的LLR株属于G10P[15]/NSP4[A]/SGⅠ基因型。LLR株VP6基因全长1 356 bp,含编码397个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF)。各代次病毒的VP6基因核苷酸与推导的氨基酸变化完全一致,与Gen Bank中LLR参考株(L11595)同源性分别为99.9%和99.7%。与16株SGⅠ亚群RV代表株之间,核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为84.0%~99.7%和97.0%~99.2%;与不同亚群RV代表株之间,VP6基因核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为77.7%~82.2%和92.2%~93.5%;LLR株各代病毒VP6基因核苷酸、氨基酸序列高度保守,各关键功能区未发生变异。结论 LLR疫苗株关键基因遗传特性稳定,为在分子水平保证LLR株毒种及其生产疫苗的安全性提供了依据;其全基因组克隆,为进一步研究RV生物学、免疫学和确定该病毒的分类学地位提供了科学依据。     

狂犬病病毒aG株全基因组序列测定及遗传稳定性分析

目的探究狂犬病病毒(Rabies virus,RV)aG株全基因组序列特征及遗传稳定性。方法严格按疫苗生产工艺进行传代,提取主种子批、工作种子批及疫苗原液病毒RNA,通过RT-PCR技术扩增全基因组各片段基因,然后分别将其克隆到p GEM-T载体中,并进行序列测定;采用DNAStar软件包对aG株与Gen Bank中4aGV参考株(JN234411)以及18株基因1型RV参考株进行同源性分析。结果 aG株全基因组由11 925个核苷酸组成,共编码3 600个氨基酸。疫苗原液与主种子批全基因组核苷酸和氨基酸同源性均为100%,而工作种子批与主种子批的核苷酸与氨基酸同源性分别为99.97%和99.92%;aG株与4aGV参考株全基因组核苷酸与推导的氨基酸同源性均为99.9%,其与18株基因1型参考株核苷酸与氨基酸序列同源性分别为84.2%~97.6%和93.7%~98.3%;aG株传代病毒与4aGV参考株全基因组氨基酸序列高度保守,且各主要功能区未发生变异。结论狂犬病病毒aG株在实验室长期生产传代过程中,全基因组遗传特性稳定。     

森林脑炎病毒疫苗株的全基因组序列分析

实验设计针对森林脑炎病毒的特异性引物,以被森林脑炎疫苗株病毒感染的鼠脑组织中提取的总RNA为模板,用PCR方法分段逆转录合成、扩增序列并测序,应用DNASTAR软件比较分析。结果表明,该病毒疫苗株的全基因组由10782个核苷酸组成,编码3414个氨基酸。森林脑炎疫苗株病毒全基因序列的测定,为研究该病毒疫苗株的生物学特性提供了分子基础。     

蜱传脑炎病毒非结构蛋白NS2B-NS3与NS5的研究进展

蜱传脑炎病毒是引起严重的中枢神经系统疾病蜱传脑炎的病原体,每年在欧洲、俄罗斯远东地区、日本和中国北部报道的蜱传脑炎病例数约为10000-12000例,且在我国和多个欧洲国家的发病率逐渐增高,正成为人类健康的潜在危害。主动免疫是预防蜱传脑炎的有效措施,包括我国在内的多个国家已研制出安全性较高的疫苗,但在我国流行省份的疫苗接种较为有限,特异性抗病毒药物的研发或许是治疗蜱传脑炎病毒感染的研究方向之一。蜱传脑炎病毒非结构蛋白NS2B-NS3与NS5因为在病毒基因组复制、加帽和宿主免疫调节中的重要作用,成为关键的抗病毒药物研发靶点。本文综述了蜱传脑炎病毒非结构蛋白NS2B-NS3与NS5的三维结构和抑制剂研发工作,为深入探究该病毒感染的分子机制和抗病毒药物研发提供参考。     

最早传入北京地区的SARS冠状病毒S基因序列分析和克隆

SARS冠状病毒的spike(S)蛋白对病毒的致病力至关重要,也是机体特异性体液和细胞免疫主要针对的靶分子。从北京地区最早发现的SARS患者咽拭子细胞培养上清中提取病毒RNA,用反转录巢式聚合酶链式反应(RTPCR)分6个片段扩增出S基因全序列,用TA载体克隆后进行DNA序列分析,再通过重叠PCR将6个片段连接成一条完整的S基因并克隆测序。DNA测序结果表明病毒S基因序列与报告的BJ01株SARS冠状病毒S基因序列完全一致,用重叠PCR将6个S基因片段连接成了一条完整的S基因,插入到pGEMT载体后读序完全正确。上述结果表明最早传入北京地区的病毒与新近报告的BJ01株SARS冠状病毒在分子流行病学上具有同源特征,重叠PCR技术可以用于有效连接多个基因片段。S区全基因的克隆为进一步研究该基因的功能和DNA疫苗等研究提供了基础。     

猪瘟弱毒C81株全基因组测序及分子结构预测

参照已发表的猪瘟病毒弱毒株的序列,设计7对覆盖全长基因组的引物,通过RT-PCR从感染猪瘟病毒弱毒株的PK-15细胞中扩增得到7个cDNA片段,分别克隆到pMD18-T载体并测序,利用DNASIS软件获得猪瘟病毒C81株全基因组序列(GenBank:AY663656)。C81株基因组全长12310nt,只有一个大的开放阅读框,编码3898个氨基酸的聚蛋白。序列分析表明,C81株开放阅读框与其它各毒株核苷酸和氨基酸序列的同源性变化较大,分别为84.4%~99.6%和91.6%~99.4%。同时,我们绘制了26株CSFVORF的进化树,比较了CSFV5'非翻译区核苷酸序列并推测其二级结构,发现不同毒株之间存在较大的差异,另外对C81株聚蛋白的功能域和三维结构进行了预测。     

新型夹竹桃天蛾质型多角体病毒的分离与初步鉴定

为了开发新型的夹竹桃天蛾的生物杀虫剂,本文从自然死亡的夹竹桃天蛾幼虫分离到病原微生物。通过电镜观察、FLAC(Full Length Amplification of cDNAs)技术以及病原体的基因组S2和S10片段的同源性分析,初步确认该病原体是一种质型多角体病毒(Daphnis nerii Cypovirus,DnCPV))。该病毒基因组电泳分析显示病毒基因组由10条dsRNA组成,大小在89 2bp和(约)4 160bp之间,其条带大小与现有的22类型均不相同。采用FLAC技术克隆了一种该CPV的基因组cDNA,并完成了基因组S2片段和S10片段序列测定工作。测序结果显示,DnCPV基因组S2片段编码RNA聚合酶,S10片段编码多角体蛋白。两者末端保守序列相同,正链5’端和3’端分别存在末端保守序列5’AGUCAAA·AGC3’。基于RNA聚合酶和多角体蛋白的氨基酸序列的系统发育分析显示该质型多角体病毒与19型和5型质型多角体病毒有较近的亲缘关系,但是电泳型上存在明显差异。因此推测该病毒是一种多角体病毒新类型,暂命名为夹竹桃质型多角体病毒南昌株(DnCPV-NC)。     

我国肾综合征出血热疫苗生产株LR1株的全基因组序列分析

为测定我国肾综合征出血热疫苗生产株LR1株的全基因组序列 ,了解该株分子基础 ,从提取的细胞总RNA逆转录PCR扩增 ,产物纯化后克隆T载体纯化后测序 ,结果证明 ,LR1株全基因组序列由L6 5 33、M36 16、S片段的16 92个核苷酸组成 ,依各自读码框架分别编码 2 15 1、1135、42 9个氨基酸。序列同源比较分析表明 ,LR1毒株与国外HTN型毒株高度同源 ,属同一亚型 ,尤其与HTN代表株 76 - 1183个片段同源率高达 99 3%～ 99 8% ,而与国内的HTN型病毒差异较大 ,同源率仅为 79 4%～ 84 6 %。氨基酸比较也显示了同样的结果。     

我国肾综合出血热疫苗生产株LR1株的基因组序列分析

为测定我国肾综合征出血热疫苗生产株LR1株的全基因组序列,了解该株分子基础,从提纯的细胞总RNA逆转录PCR扩增,产物纯化后克隆T载体纯化后测序,结果证明,LR1株全基因组序列由L6533、M3616、S片段的1692个核苷酸组成,依各自读码框架分别编码21511、1135、429个氨基酸。序列同源比较分析表明,LR1毒株与国外HTN型毒株高度同源,属同一亚型,尤其与HTN代表株75－1183个片段同源率高达99．3％－99．8％,而与国内的HTN型病毒差异较大,同源率仅为79．4％－84．6％。氨基酸比较也显示了同样的结果。     

牛乳头瘤病毒基因2型新疆南疆Aks-01流行株全基因组序列测定及其特征分析

为从分子水平了解牛乳头瘤病毒(Bovine papillomavirus,BPV)新疆南疆Aks-01株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况。本研究选取新疆南疆患病牛皮肤肿瘤样物,以乳头瘤病毒L1基因的简并引物FAP59/FAP64进行PCR法基因分型鉴定并确定其基因型,根据GenBank中BPV参考株设计扩增引物和测序引物,对Aks-01株进行全基因组扩增、测序及序列分析。序列分析表明,新疆南疆Aks-01株为BPV-2基因型,其全基因组长为7944bp,具有BPV-2基因型的结构特征,与GenBank收录的BPV-2基因型参考株核苷酸比较,同源性高达98%。与BPV-1、BPV-13的基因型参考株进化关系最近,同属Delta属。该Aks-01株为新疆南疆地区首次检测确认并测定全基因组序列的牛乳头瘤病毒。     

上海出入境检验检疫局发现我国首例库波热病毒

针对西非安哥拉回国的不明原因发热病人,筛查其可能携带的传染病病原体。采用荧光PCR的方法对口岸重点关注的黄热病毒、寨卡病毒、登革病毒等病原体进行筛查;采用深度测序的方法,搜索病毒库、细菌库、寄生虫库,进行序列比对筛查各类病原体,采用全基因组测序的方法获得病原体全基因组序列。2017年1月2日凌晨1点,上海出入境检验检疫局国家国境口岸卫生监督检测重点实验室接到一份紧急样本,样本来自1名安哥拉回国的28岁男子。该男子在安哥拉当地医院初筛黄热病阳性,该男子要求自行回国治疗。针对病人的血液样本和尿液样本,开展黄热病毒、登革病毒、寨卡病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒、流行性乙型脑炎病毒、疟原虫等多种虫媒病原体的荧光PCR检测,结果显示阴性。通过对血液样本的深度测序发现,该病人感染了一种新型的弹状病毒,中文命名为库波热病毒,并获得了库波热病毒全基因组序列,与尼日利亚发现的库波热病毒比较,同源性为96%。     

天津市致病毒性脑炎柯萨奇病毒B组5型全基因组序列分析

肠道病毒是我国病毒性脑炎(Viral encephalitis,VE)的主要病原体。本文研究对4株引起VE的天津柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus B5,CV-B5)分离株进行Illumina MiniSeq高通量测序,并对其全基因组特征、进化及重组特点进行分析。结果提示,4株CV-B5天津分离株的全基因组核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.5%~100.0%和98.1%~100.0%,与国内流行株的全基因组核苷酸序列同源性为83.2%~96.5%,氨基酸序列同源性为96.4%~99.4%。基于全基因组的系统进化分析将CV-B5流行株分为A-D四个基因型,其中天津与国内流行株均属于C基因型。C基因型进一步分为3个进化分支,而天津分离株处在两个不同的分支上。基于基因组各区段序列的系统进化与SimPlot重组分析结果显示,天津分离株15-39N、15-41N与埃可病毒30型(Echovirus 30,E-30)原型株在P3区3B、3C、3D区域均检测到重组信号。本研究有助于了解CV-B5的全基因组特点和重组规律,为相关疾病的防控提供依据。     

茶尺蠖小RNA病毒全长cDNA克隆的构建

为了初步研究茶尺蠖小RNA病毒(Ectropis oblique picorna-like virus, EoPV)的复制机制,从被EoPV感染致死的茶尺蠖幼虫中分离并纯化病毒粒子,提取病毒RNA,根据已公布的EoPV核苷酸序列,利用基因组上单一的酶切位点,设计特异性引物,应用RT-PCR扩增出5个覆盖全长的片段。 随后采用融合PCR将5个片段拼接,最终将全长定向克隆到低拷贝质粒载体上,成功构建cDNA全长克隆p-EoPV。 双酶切及测序鉴定证明全长克隆构建成功。 与原序列比较发现,该克隆在氨基酸水平上有8个突变和1个缺失。 本研究为深入探讨EoPV病毒生物学特性、病毒复制机理等奠定了基础     

中国MERS输入病例病毒基因组测序及分析

为测定分析中国第一例输入性中东呼吸综合征冠状病毒基因组序列.采用PCR分段扩增、测序、拼接的方法,组装病毒基因组序列,应用BLAST,MEGA6.0,SIMPLOT,RDP等软件分析病毒序列的相似性、变异、进化、重组事件.结果发现,所完成的病毒序列长度为29928 bp,与韩国报道的序列最为接近.病毒核苷酸序列与近期中东地区分离到的病毒株序列相似性高达99.53%~99.92%;在多聚蛋白ORF1ab中有3个新发突变,而S,E,M,N蛋白未出现变异;核苷酸序列无明显的片段重组现象.本研究表明,中国广东第一例输入性MERS患者的序列没有出现明显的变异,一些位点突变后功能变化仍需进一步研究.     

新疆绵羊肺腺瘤病理学诊断与全基因组序列分析

为了完成新疆绵羊肺腺瘤病毒诊断及全基因组序列测定,本研究采用兽医临床病理学和组织病理学观察疑似患病羊,并提取病毒悬液进行透射电镜观察,从患病绵羊的肺脏组织中提取基因RNA反转录为cDNA。参照GenBank中外源性绵羊肺腺瘤病毒美国株基因序列(AF105220)设计六对引物,对病料样品进行RT-PCR扩增和测序分析。结果表明,"小推车试验"时有鼻液流出,显微镜下观察,患病羊的肺脏有大小不一的腺瘤灶,且肺泡上皮细胞呈乳头状增生,肺泡腔内充满巨噬细胞,病灶中央的细胞核溶解。透射电镜观察到病毒颗粒直径大小约为88nm~125.4nm。RT-PCR扩增病毒基因组片段,获得完整的基因组序列全长7 456bp。与美国代表株(AF105220)和英国代表株(AF357971)BLAST在线比对核苷酸同源性结果分别为96%和95%,与内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)内蒙株(DQ838493)和美国株(EF680300)的核苷酸同源性分别为89.8%和89.9%。获得的全基因组序列的TM区的氨基酸序列中具有外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)特有的致病性"YXXM"序列。说明此基因序列具有致瘤作用,这是我国新疆首次报道的外源性绵羊肺腺瘤病毒的全基因组序列,为更深入的研究新疆绵羊肺腺瘤病毒的生物学特性和致病机理奠定基础。