EV-A71感染导致的重症手足口病的机制及防控研究进展

手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种具有高度传染性的病毒性传染病,通常夏秋季高发于幼儿和儿童;若患儿并发呼吸和循环功能障碍、神经系统受累等临床症状称为重症HFMD。少数重症病例可出现肺水肿、脑炎和急性弛缓性麻痹等罕见的神经或循环系统并发症,甚至导致患儿死亡。引起HFMD最常见的病原是肠道病毒A71型(EV-A71)和柯萨奇病毒A16型(CV-A16),而EV-A71是引起重症HFMD的主要病原体。EV-A71导致的重症HFMD已成为全球重要的公共卫生问题,减少EV-A71流行范围和预防EV-A71重症HFMD非常重要。EV-A71疫苗是目前最有效的预防重症HFMD发生的措施;中国已经批准了三个厂家的灭活EV-A71疫苗上市并已开展适龄儿童接种,以期预防EV-A71感染引起的重症HFMD,但这种疫苗不能预防其它肠道病毒如CV-A16,CV-A6和CV-A10等引起的HFMD。据文献报道,小分子抑制剂芦平曲韦可以通过阻止EV-A71的3C pro蛋白活性来抑制EV-A71复制;小干扰RNA和单克隆抗体也可抑制EV-A71复制。研制EV-A71和CVA16双价灭活疫苗是防控HFMD的策略之一,而小分子抑制剂、小干扰RNA和单克隆抗体的研制和应用等也是临床防治HFMD的探索。     

CV-A16和EV-A71感染对肠道上皮细胞间连接分子排布和表达的影响

柯萨奇病毒A组16型(Coxsakievirus A 16,CV-A16)与肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV-A71)是引发手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)的两种主要病原体,然而两者的致病机理仍未完全被阐明。病毒感染对肠道上皮细胞间连接分子排布和表达直接与病毒感染造成的后果相关。本研究通过右旋糖苷穿透实验、免疫荧光以及蛋白免疫印迹等技术检测了CV-A16和EV-A71感染对肠道上皮细胞系(Intestinal epithelial celDFHC后细胞通透性的变化以及细胞间连接分子排布和表达情况。研究结果表明,CV-A16和EV-A71感染FHC可导致其通透性显著增强、连接分子Nectin1、Claudin4、Claudin5、ZO-1以及E-Cadherin的排布被破坏,且表达量显著性降低。这一结果提示了CV-A16和EV-A71感染肠道FHC细胞并在细胞中复制引起肠道上皮细胞损伤,导致肠道上皮细胞间连接分子排布的改变和表达量的减少。     

安徽省2017-2018年手足口病柯萨奇病毒A6型基因进化特征分析

人肠道病毒A组71型(Enterovirus A71,EV-A71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)是引起手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)的主要病原体.近年来非EV-A71和非CV-A16的其他肠道病毒(Enterovirus,EV)已成为HFMD流行或暴发疫情的优势病原体.安徽省HFMD监测数据显示,2017-2018年HFMD样本非EV-A71和非CV-A16其他EV核酸阳性率超过50％,其中大部分为柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6).为了解安徽省2017-2018年HFMD其他肠道病毒构成和CV-A6基因进化特征,本研究收集2017-2018年HFMD咽拭子EV核酸阳性标本,采用人横纹肌肉瘤(RD)细胞进行病毒分离培养,对分离到的CV-A6毒株VP1全长序列基因扩增及核苷酸序列测定.从NCBI GenBank数据库下载CV-A6原型株和代表性毒株基因参考序列,运用生物软件MEGA 6.0构建VP1基因序列系统进化树,分析其基因遗传特征.结果 显示,安徽省2017-2018年HFMD实验室确诊病例其他EV占66.1％,CV-A16占23.5％,EV-A71占10.4％.52株CV-A6毒株均为D3a基因亚型,其VP1区核苷酸序列间相似度为93.7％～100％,编码的氨基酸序列相似度为98.3％～100％;与CV-A6 Gdula原型株核苷酸相似度为78％～82.3％,氨基酸相似度为94.6％～96.3％.VP1区15个氨基酸位点有变异,氨基酸位点Q98L和G160S的变异发生率为100％.其他EV已成为安徽省引起HFMD流行的重要病原体,D3基因型CV-A6为优势流行毒株.持续加强其他EV的病原学监测与分析,对安徽省HFMD防控策略制定与疫情处置具有重要意义.     

肠道病毒A71型致人扁桃体上皮细胞系UT-SCC-60B凋亡和S期阻滞的研究

肠道病毒A71型(Enterovirus A71,EV-A71)是手足口病的重要病原体,为研究EV-A71感染人扁桃体上皮细胞后对细胞凋亡和细胞周期的影响,确定ERK1/2、JNK1/2、PI3K/Akt和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)的作用,本文以人扁桃体上皮细胞系UT-SCC-60B为细胞模型,CCK-8试剂盒检测EV-A71对UT-SCC-60B的抑制率、流式细胞仪检测EV-A71感染组和抑制剂处理组的凋亡和细胞周期、Caspase活力检测试剂盒测定Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活力。EV-A71以感染剂量和感染时间依赖方式抑制UT-SCC-60B增殖;EV-A71感染致UT-SCC-60B发生细胞凋亡,抑制ERK1/2、JNK1/2和PI3K/Akt能够降低UT-SCC-60B细胞凋亡比例;EV-A71感染UT-SCC-60B后发生S期阻滞,抑制ERK1/2、JNK1/2、PI3K/Akt和Caspase阻止UT-SCC-60B发生S期阻滞;EV-A71感染UT-SCC-60B能够活化Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9且ERK1/2、JNK1/2和PI3K/Akt调控Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活力。因此,EV-A71能够导致人扁桃体上皮细胞UT-SCC-60B发生凋亡和S期阻滞,并且ERK1/2、JNK1/2、PI3K/Akt和Caspase参与凋亡和S期阻滞的调控。     

CV-A16感染沙鼠细胞因子和趋化因子的动态变化分析

柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)是导致手足口病的病原体之一,CV-A16感染后宿主的外周血细胞的细胞因子表达变化的报道较少,也未见有关血清中细胞因子含量在感染前后的表达变化。为了分析CV-A16感染的不同严重程度的沙鼠细胞因子和趋化因子的动态变化。通过腹腔注射CV-A16构建CV-A16感染发病模型,应用流式细胞术、实时荧光定量RT-PCR和ELISA法检测病毒载量、血清炎症因子和趋化因子水平动态变化。CV-A16感染后重症沙鼠的临床症状,包括体重下降程度、临床症状分值以及死亡率均显著高于轻症沙鼠,并且重症沙鼠外周血白细胞比例和升高趋势总体上高于轻症感染沙鼠;重症感染沙鼠全血中细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-α的mRNA转录水平上调,IL-4、IL-10、IL-8和IP-10的mRNA转录水平下调;并且CV-A16感染后重症沙鼠血清中的TNF-α和IFN-γ含量显著上升,IL-8和IP-10的含量显著下降。结论为重症沙鼠全血和血清中存在多种趋化和炎症因子上调,可能与Th1炎症失调有关。     

TLR3和TLR4基因多态性与EV71感染手足口病严重性及易感性的关系研究

手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD)是5岁以下婴幼儿常见的病毒性肠道传染病,该病主要由人肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)型及柯萨奇A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)引起,但关于TLR3、TLR4基因多态性与EV71感染手足口病的报道较少。为探讨EV71感染手足口病患儿TLR3和TLR4基因多态性与EV71感染手足口病严重性及易感性的关系,本研究选择2016年8月至2017年8月就诊于安徽医科大学第一附属医院的EV71感染手足口病患儿166例,其中重症组76例,轻症组90例,并选择同期来院体检的健康者120例作为对照组。收集患者入院时的年龄、性别、发热天数等基线资料,采集血液检测白细胞计数(White blood cell count,WBC)、丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Glutamate transaminase,AST)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清C反应蛋白(C reactive protein,CRP)、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)水平;分离外周血单个核细胞提取DNA,琼脂糖凝胶电泳检测DNA情况;聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增TLR3c.1377C/T和TLR4-896A/G,限制性内切酶Tap I(TthHB8 I)、Nco I分别酶切TLR3、TLR4 PCR扩增产物,凝胶成像系统记录实验结果,对扩增产物进行测序,分析其基因多态性结果。结果显示,对照组与EV71感染组TLR3c.1377C/T位点的基因型分布与C、T等位基因频率均无显著统计学意义(P0.05);EV71感染组中重症组TT基因型较轻症组显著升高(P0.05);重症组T等位基因频率显著高于轻症组(P0.05),C等位基因频率显著低于轻症组(P0.05);EV71感染组中,TLR3c.1377C/T位点不同基因型患儿在年龄、性别及ALT、AST、CKMB水平上无显著差异(P0.05);TLR3c.1377C/T位点TT型患儿的发热时间及WBC、CRP水平显著高于CT和CC型,CT型患儿的发热时间及WBC、CRP水平显著高于CC型(P0.05);CC型患儿的IFN-γ水平显著高于CT和TT型(P0.05);TLR4-896A/G基因电泳条带为140bp的特异性扩增产物,为野生型Asp/Asp基因型,对照组和EV71感染组均未出现A→G的突变。本研究得出结论,TLR3c.1377C/T位点有CC、TT、CT三个基因型,且携带T等位基因EV71感染手足口病患儿进展为重症的风险较高;TLR4-896A/G基因无突变,与EV71感染手足口病患儿疾病严重性和易感性无关。     

肠道病毒A组71型在人脐静脉血管内皮细胞中的增殖及对细胞骨架的影响

目的研究肠道病毒A组71型(Enterovirus group A type 71,EV-A71)在人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中的增殖及对细胞骨架造成的影响,初步探讨其与病毒血症发生的关系。方法采用qRT-PCR技术及免疫荧光技术检测EV-A71在HUVECs中的复制和增殖,用免疫荧光双染色技术观察三种细胞骨架在EV-A71感染后的变化。结果 EV-A71能够有效感染HUVECs,且感染后24 h在细胞内复制达到高峰。病毒感染后微丝骨架完全解聚,微管骨架排列方式发生改变,而中间纤维结构模糊不清;同时检测到微管及中间纤维与病毒抗原共存。结论 EV-A71可以感染HUVECs并在其内有效复制增殖,同时诱导HUVECs三种细胞骨架发生改变,提示细胞骨架可能参与EV-A71感染HUVECs的过程。     

全球EV-A71的基因型分布

肠道病毒A组71型(EV-A71)是引起手足口病暴发流行的主要病原体,也是除脊髓灰质炎病毒以外最为重要的人肠道病毒病原体。截止2017年2月,全球报道的EV-A71共包括7个基因型(A~G)和14个基因亚型,其中B基因型和C基因型是目前全球流行的优势基因型,目前已鉴定B基因型有8个基因亚型(B0~B7),C基因型有6个基因亚型(C1~C6)。C4基因亚型中C4a进化分支是引起中国大陆近年手足口病大规模暴发流行的主要病原之一,也是引起手足口病重症和死亡的绝对优势病原体。本文对全球流行的EV-A71基因(亚)型的地理和年代分布、新基因型的发现进行了系统的归纳分析,为中国检测和监测引起HFMD流行的EV-A71基因型或亚型的动态变化提供基础数据。     

肠道病毒71型感染机制研究进展

重症手足口病及其死亡病例多由肠道病毒71型(Enterovirus A71,EV-A71)感染引起,且近年来在亚太地区广泛流行。由于EV-A71具有严格的宿主细胞寄生性,需依赖细胞的能量和代谢系统完成其复制过程。因此研究该病毒在进入、脱衣壳等感染早期过程中病毒与宿主相互作用的机制,不仅有助于理解其致病机理,同时可为建立相应预防和治疗的策略提供科学依据。为此,就EV-A71感染早期的致病机制的研究进展进行了综述。     

肠道病毒A71型3C蛋白结构、功能及抗3C蛋白药物的研究进展

肠道病毒A71型(Enterovirus A71,EV-A71)可引起手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD),严重者伴有神经系统并发症,如无菌性脑膜炎、神经源性肺水肿等。EV-A71引起的HFMD自2007年以来在全世界,尤其是亚太地区多次暴发,已成为亚太地区公共健康的主要威胁之一。目前尚无有效的抗病毒药物或疫苗。EVA71的致病机制尚未完全研究清楚,而非结构蛋白3C在病毒的复制和抑制天然免疫方面发挥了不可替代的作用。EV-A71 3C蛋白的研究在进一步了解EV-A71的致病机制以及研制抗病毒药物方面发挥着重要的作用。本文将对EV-A71 3C蛋白的结构、功能以及抗3C蛋白病毒药物的研究进展做出综述。     

基于反向遗传学技术获取具有精确末端的EV-A71

目的基于反向遗传学技术,设计可获取具有精确末端的肠道病毒A71(enterovirus A71, EV-A71)的方法,并在病毒感染能力研究和抗病毒药物筛选中进行应用。方法利用同源重组方法,在病毒基因组5′末端,引入具有顺式酶切活性的锤头状核酶(cis-active hammerhead ribozyme)序列;在病毒3′末端的poly(A)尾后,引入限制性核酸内切酶NsiⅠ酶切位点(ATGCA↓T),构建含有EV-A71全长感染性克隆的质粒(pBR322-EV-A71)。pBR322-EV-A71经体外转录获得EV-A71感染性RNA,用该RNA转染横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyo-sarcoma cells, RD),以获取具有精确末端的EV-A71颗粒。通过检测病毒RNA拷贝数、病毒蛋白的表达量等指标,验证拯救病毒的感染能力和抗病毒药物的抑制作用。结果 pBR322-EV-A71经体外转录所得RNA,在转染进入RD细胞后,观察到细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)并检测到病毒负链RNA,表明成功合成了EV-A71颗粒;拯救病毒颗粒在连续传代过程中,病毒增殖能力得以逐步提升,第4代病毒(R4 EV-A71)的感染能力强于第1、2、3代病毒(R1、R2、R3 EV-A71)(P<0.001),且已趋近于野毒株(wild-type EV-A71, wt EV-A71)水平(P>0.05);U0126和sorafenib两种ERK通路抑制剂可以有效抑制R4 EV-A71的增殖(P<0.001),且R4 EV-A71与wt EV-A71表现出同等程度的抑制作用。结论 pBR322-EV-A71可拯救出具有精确末端的EV-A71病毒颗粒,且其子代病毒可代替wt EV-A71进行病毒感染能力的评价和抗病毒药物的筛选。     

细胞膜转运分子ABCC3和SLC7A7在肠道病毒A71型感染中作用的初步研究

肠道病毒A71型(enterovirus A71,EV-A71)是导致手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病原体之一,目前对其治疗尚无特异高效的抗病毒药物.研究表明,细胞膜转运相关分子参与病毒的入侵、复制以及感染性子代病毒颗粒的释放.为寻找宿主中可有效抑制EV-A71感染的细胞膜转...     

柯萨奇病毒A组16型分子流行病学和疫苗研究进展

柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)是引起手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)的重要致病原,常与另一重要病原体肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV-A71)共同或交替流行。该病毒在世界多个国家和地区引起过暴发流行,成为重要的公共卫生问题。CVA16可分为A和B两个基因型;其中基因型B可以分成B1和B2两个基因亚型;B1亚型又可进一步分成B1a、B1b和B1c三个进化分支。基因型A与B2在世界范围内已不再流行;我国大陆分离到的CVA16毒株均属B1a和B1b进化分支。CVA16感染多为自限性轻症,但亦可引起严重的并发症,甚至引起患者死亡。目前尚无针对该病毒的有效药物或治疗手段,研发安全有效的疫苗成为控制该病毒的重要措施。随着EV-A71疫苗三期临床试验的成功完成,CVA16疫苗的研究也显得更加迫切。多家机构正在研究各种类型的CVA16疫苗,包括灭活疫苗、基因工程疫苗及DNA疫苗等。本文就CVA16的分子流行病学及其疫苗研究进展进行了综述。     

EV-A71感染小鼠巨噬细胞诱导促炎细胞因子和趋化因子反应

为初步探索EV-A71在小鼠巨噬细胞中的复制情况和抗病毒的固有免疫应答,本文以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为细胞模型,通过建立EV-A71绝对定量qPCR方法检测EV-A71病毒载量;EV-A71和紫外灭活的EV-A71感染RAW264.7,不同时间点提取总RNA,RT-qPCR检测促炎细胞因子、趋化因子和模式识别受体的mRNA表达变化水平。本研究成功建立了EV-A71的绝对定量qPCR检测方法,并发现EV-A71感染RAW264.7后随着感染时间的延长,EV-A71病毒载量呈递减趋势;EV-A71和紫外灭活的EV-A71可以引起IL-1β、IL-6、TNF-α促炎细胞因子和IP-10、MCP-1、MIP-1α趋化因子反应,上调TLR2、TLR1、TLR6、MDA5和RIG-I mRNA表达。研究结果显示,EV-A71在小鼠巨噬细胞中具有较低水平的复制,同时产生促炎细胞因子和趋化因子反应。     

肠道病毒71型(EV-A71)感染ICR小鼠模型的建立

为研究肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV-A71)经不同攻毒方式感染不同日龄ICR乳鼠的感染情况,了解EV-A71在小鼠体内的动态分布和感染机制,为建立EV-A71感染动物模型,本研究采用分离自重症手足口患儿的EV-A71毒株,分别通过肌肉注射(Intramuscular injection,IM)、腹腔注射(Intraperitoneal injection,IP)以及脑内注射(Intracerebral injection,IC)的方式感染3日、5日和9日龄ICR乳鼠,感染后定期采集血液和各组织,通过Realtime PCR追踪各组织中病毒载量变化,并且通过切片制作和免疫组化对感染乳鼠进行病原学和病理学分析。结果显示:对于低日龄(≤5日龄)乳鼠,注射剂量在104.5 TCID50/g·体重时IM、IP及IC均为较好的感染方式,都会出现神经症状,且有极高的致死率。随着日龄增长,感染后症状有所减轻,但IM和IP感染途径对大日龄乳鼠仍具有良好的致病性,且IM和IP死亡率显著高于IC死亡率。经IM、IP和IC注射感染病毒的3日龄乳鼠在6dpi体重相对于各对照组分别下降了1.54g(31.43%)、1.31g(15.06%)和2.52g(44.28%),而经IM和IP感染的5日龄乳鼠6dpi体重相对于各对照组分别下降了0.605g(8.95%)、0.886g(15.51%),经IC感染的5日龄乳鼠6dpi体重相对于对照组上升了0.904g(14.70%),感染组体重均显著低于对应的同期对照组(P0.05)。经IM、IP和IC感染病毒的3日龄乳鼠9dpi均死亡,而5日龄乳鼠9dpi存活率分别为42.8%、25%和87.5,14dpi存活率分别为0%、0%和25%,9日龄乳鼠9dpi存活率分别为70%、84.62%和100%。病理学及免疫组化检查显示EV-A71病毒具有强烈的嗜神经性及嗜骨骼肌的特性,可导致病毒血症、脑神经元及骨骼肌坏死、心肌间质水肿及多脏器炎症反应。我们系统地研究了不同攻毒方式感染不同日龄的ICR乳鼠后的病毒动态分布及免疫病理损伤,发现经肌肉注射或腹腔注射5日龄乳鼠能够建立理想的EV-A71感染动物模型。     

2013年至2018年辽宁省柯萨奇病毒A10型分离株VP1区基因特征分析

为了解辽宁省地区手足口病患者中分离到的柯萨奇病毒(Coxsackievirus) A10型VP1区基因特征,收集了2013年至2018年辽宁省14个市送检的手足口病患者非EV-A71和非CV-A16肠道病毒的阳性标本,通过细胞培养法分离肠道病毒,提取病毒RNA;通过RT-PCR法进行肠道病毒VP1区基因扩增和序列测定;...     

柯萨奇病毒A组16型研究进展

柯萨奇病毒A组16型(CA16)是引起手足口病(HFMD)的主要病原体,与肠道病毒71型(EV71)交替或共同流行;特别是近年在西太平洋地区呈现流行强度高、重症和死亡人数多的特点,已成为该地区的重大公共卫生问题。研发安全有效的疫苗是控制HFMD流行的有效手段。由于EV71所致疾病在重症和死亡病例中所占比例高,对其疫苗研发得到了广泛关注,全病毒灭活疫苗已进入III期临床,有望即将应用于婴幼儿HFMD的防控。EV71疫苗的顺利研发随之也增加了对CA16疫苗研发的迫切性。近年来日本、新加坡以及中国台湾地区逐渐开始关注CA16相关的研究,我国也有多家企业开展CA16疫苗的研发。本文就CA16的病原学,流行病学,实验室诊断,治疗和预防等方面进行了综述。     

呼吸道合胞病毒感染不同气道上皮细胞的病变特点及易感性分析

为了比较几种不同气道上皮细胞对呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）感染后病变特点及易感性。采用RSV A2株感染Hep-2、A549、16HBE、BEAS-2B细胞后,奥林巴斯倒置免疫荧光显微镜观察细胞病变效应,免疫荧光检测RSV N蛋白表达及空斑实验测定细胞培养上清液中病毒滴度。结果显示RSV A2株感染Hep-2细胞后最早形成典型的合胞病变,A549细胞次之,16HBE及BEAS-2B形成病变的时间最晚。免疫荧光检测到RSV N蛋白表达特点与细胞病变特点一致。RSV A2在Hep-2上产生的病毒滴度最高,A549细胞次之,在16HBE上产生的病毒滴度最低。提示Hep-2、A549细胞对RSV具有高度易感性,以Hep-2最为敏感。而16HBE、BEAS-2B细胞对RSV感染不敏感,其中16HBE最不敏感。本研究可为选择合适的上皮细胞进行RSV相关研究奠定基础。     

肠道病毒A71型亚单位蛋白对RD细胞自噬活化的影响

肠道病毒A71型（Enterovirus-A71, EV-A71）能够活化宿主细胞的自噬并依赖自噬促进其复制,然而EV-A71的亚单位蛋白对自噬的活化目前仍不清楚。为探讨EV-A71亚单位蛋白对人横纹肌肉瘤（Human rhabdomyosarcoma, RD）细胞自噬活化的影响,将EV-A71的亚单位蛋白重组真核质粒转染至RD细胞,采用抑制剂MK-2206阻断PI3K/Akt途径,共聚焦显微镜和免疫印迹检测自噬活化。过表达EV-A71亚单位蛋白的RD细胞中PI3K/Akt途径、p38、JNK和ERK途径均呈现不同程度活化,同时RD细胞呈现出绿色荧光表明自噬发生活化,特别是EV-A71的VP2和2A。EV-A71亚单位蛋白使LC3-II/LC3-I的转化水平提升,EV-A71亚单位蛋白（VP2、VP3、VP4、2A、2B和2C）显著提升p62的表达水平,EV-A71 VP1显著下调p62的表达水平但显著上调LAMP-1和LAMP-2的表达水平。阻断PI3K/Akt途径后,过表达EV-A71亚单位蛋白的RD细胞绿色荧光强度显著减弱、自噬被阻断,同时LC3-II/LC3-I的转化水平显著降...