六种检测猪瘟病毒方法的比较

【目的】本研究旨在比较6种检测猪瘟病毒方法的优缺点。【方法】应用病毒分离、胶体金免疫层析试纸条、抗原捕捉ELISA、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、TaqMan荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)和反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP)等6种方法,分别对50份疑似猪瘟病料中的猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)进行检测。【结果】结果表明:RT-qPCR和RT-LAMP方法检出阳性样品数为13份,RT-PCR为11份,病毒分离为10份,抗原捕捉ELISA为9份,胶体金试纸条为8份;6种方法均检测为阳性8份,均为阴性37份。【结论】结果提示,在对猪瘟病毒进行检测时,RT-qPCR、RT-LAMP和RT-PCR由于其灵敏性高,可作为首选检测方法,但操作时需要避免假阳性的出现;病毒分离方法虽然操作繁琐,但结果准确,是确诊猪瘟必不可少的检测方法;抗原捕捉ELISA和胶体金试纸条检测时间较短,由于其敏感性较低所限,主要用于对畜群进行检测,不适合个体检测。     

新疆伊犁2005年甲型肝炎病毒流行株基因分型研究

为了解2005年新疆伊犁甲型肝炎病毒(甲肝病毒)流行株分子流行病学特征,收集了部分甲肝病人血清标本,用国际上通用的甲肝病毒结构区基因VP1-2A分型引物,经核酸提取,做RT-PCR,序列测定,对甲肝病毒基因进行分型研究,并对甲肝病毒在甲型肝炎(甲肝)病人血清中存在的时间进行了探讨.结果显示,甲肝病毒核苷酸序列变异在0～3.2%之间,分为不同的基因簇,但都属于1A亚型(同一基因亚型间核苷酸序列变异小于7.5%);氨基酸序列几乎相同.甲肝发病8周后的病人血清中仍能检测到甲肝病毒.结果说明该流行区有多株甲肝病毒存在,其传染源可能有多个传播途径,当人群免疫水平较低时,可引起甲肝流行.甲肝病毒在病人血液中可存在较长时间.这些工作为今后进一步开展甲肝病毒溯源研究及有效控制甲肝病毒流行提供了理论和技术支撑.     

细胞培养结合实时荧光RT-PCR法快速检测甲肝病毒滴度的研究

目的建立一种细胞培养与实时荧光RT-PCR相结合的快速检测甲肝病毒滴度的方法。方法根据甲肝病毒(HAV)L-A-1株5'端基因组序列,设计了2条基因特异性引物及一条探针,建立实时荧光RT-PCR法,结合细胞培养检测甲肝病毒滴度,并与ELISA检测法进行比较。结果实验中建立的方法能特异检测甲肝病毒,细胞培养8d检测病毒滴度为lg107.0CCID50/mL。同一样本重复检测3次,批内样本Ct值的变异系数最大为0.89%,批间样本Ct值变异系数最大为1.66%。建立的细胞培养结合实时荧光RT-PCR法(细胞培养8 d)与细胞培养ELISA法(细胞培养28 d)检测甲肝病毒滴度结果差异无统计学意义(P0.05)。结论该方法具有快速、灵敏、特异等优点,应用于疫苗常规检测有良好前景。     

辽宁发现库蚊黄病毒

2011年从辽宁省丹东地区蚊虫样品中分离到6株病毒,采用逆转录-聚合酶链式扩增(RT-PCR)检测方法,结果黄病毒属通用引物和库蚊黄病毒特异性引物均为阳性。6株病毒核苷酸序列经基因库(GenBank)比对后,证实6株病毒为库蚊黄病毒,为我国首次报道。将病毒NS5基因和E基因核苷酸序列与GenBank中10株库蚊黄病毒参考毒株核苷酸序列进行比较,并构建遗传进化树,结果显示本次分离的6株病毒与美国和日本的毒株亲缘关系较近。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和盖他病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

盖他病毒(Getah virus,GETV)可感染猪并引起和猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)相类似的临床表现,且两者可混合感染而难以区分。我国检测PRRSV和其他诸多病毒的多重PCR文献已比比皆是,但尚无同时检测PRRSV和GET V方法的报道。为此,作者根据GenBank中公布的PRRSV和GETV全基因序列,设计了两对分别扩增PRRSV ORF7基因和GETV Cap基因片段的引物,通过反应条件的优化及特异性、灵敏性和重复性试验,首次建立了可同时检测PRRSV和GETV的双重RT-PCR方法。结果显示,该方法可以同时扩增出PRRSV 633 bp和GETV 316 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒等其他相关病毒扩增结果均为阴性。对GETV和PRRSV的cDNA最低检测量分别为2.48×10~(-4)ng和2.50×10~(-5)ng。用建立的双重RTPCR方法对河南15个地市92个猪场的136份临床疑似PRRS发病猪样品进行检测,共从58个猪场检出PRRSV单一阳性样品44份,阳性率为32.4%;GETV单一阳性样品7份,阳性率为5.15%;GETV和PRRSV混合感染样品8份,阳性率为5.88%。检测结果与单一RT-PCR结果吻合率达100%。该方法为GETV和PRRSV的快速检测、鉴别诊断和分子流行病学研究等提供了新的技术手段。     

超声波介导铁蛋白基因转化苹果的研究

以嘎拉苹果的叶片为转化受体,应用超声波法将菜豆铁蛋白基因导入受体中.实验表明,以0.5 W/cm2的声强、25℃、20 min超声波处理的转化效果最佳,抗性愈伤组织的比例高达24%.抗性愈伤组织经诱导获得了16个苹果抗性植株,有11株表现出GUS阳性,阳性比率为2.75%.经PCR检测,11株GUS阳性植株中有6株能扩增出目的条带;而Southern blotting实验表明,菜豆铁蛋白基因仅在2个苹果转基因株系的基因组中实现了完整插入,并且杂交的信号较强;进一步RT-PCR检测实验显示,外源菜豆铁蛋白基因在上述2株转基因植株中并未转录,发生了基因沉默.     

应用多重RT-ORC技术检测食管癌患者外周血多种肿瘤基因标志物的研究

目的:建立多重RT-PCR同步检测技术,联合检测黑色素瘤抗原MAGEA3基因、人类斯钙素hSTC1基因、上皮细胞角质蛋白CK20、CK19基因及癌胚抗原CEA基因mRNA在食管癌患者外周血中的表达.方法:在分析MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19、CEA和B-actin六种基因mRNA全长序列资料的基础上,自行设计并筛选出6对引物及6条寡核苷酸探针,利用多重RT-PCR技术并结合基因芯片对样本进行检测.结果:全部样品均可检出B-actin,55例食管癌患者外周静脉血中MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA的阳性表达率分别为25.45%、47.27%、49.09%、34.55%和52.73%;多重RT-PCR技术同时检测MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA基因,如果至少表达其中一种即可作为阳性表达者,其阳性表达率可达72.73%.而10例食管癌组织中均为阳性,28例正常健康捐献者的外周血中有2例CEA表达阳性,27例非肿瘤病人的外周血中有3例CK20阳性,3例CK19阳性,3例CEA阳性.测序结果证实RT-PCR产物确为MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA基因.结论:联合检测MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA可以增加外周血循环癌细胞检测的敏感性,本研究建立的多重RT-PCR技术可以做为一种快速、灵敏的检测手段.     

四种常见猪肠道病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用

【背景】猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)是当前导致猪群发生病毒性腹泻的4种主要病原,并且常发生混合感染。【目的】建立一种可鉴别诊断这4种腹泻病毒病的检测方法,对于临床诊断具有重要意义。【方法】针对PEDV的M蛋白基因、TGEV的N蛋白基因、PDCoV的N蛋白基因和PoRV的VP7蛋白基因分别设计特异性引物,进而构建相应的重组质粒标准品。通过对PCR反应条件优化,建立可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的多重RT-PCR检测方法。随后通过敏感性、特异性和重复性试验对该方法的有效性进行验证。【结果】敏感性试验结果显示,对PEDV-M、TGEV-N、PDCoV-N和PoRV-VP7重组质粒标准品的最低检测下限分别为1.75×10²、1.5×10³、1.6×10²和1.6×10²copies/μL;特异性试验结果显示,仅可检出本研究中的4种靶病毒,而猪群常见病毒CSFV、PRRSV、PCV2和PRV未能检出。重复性试验结果显示,选取10⁸、10⁶和10⁴copies/μL 3个不同浓度的重组质粒作为模板,其他条件不变,分别进行5次重复试验,5次试验均扩增出清晰、均匀的条带。对山东各地区送检的52份临床腹泻样品通过建立的四重RT-PCR方法进行检测,发现PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的阳性率分别为37%(19份)、6%(3份)、10%(5份)和25%(13份)。其中PEDV和PoRV混合感染2份(4%),PEDV和TGEV混合感染2份(4%),PEDV和PDCoV混合感染1份(2%)。通过单重RT-PCR对该多重RT-PCR临床样品检测结果进行重复验证,结果显示多重RT-PCR与常规单重RT-PCR结果符合率为100%。最后随机挑选5个检测为阳性的临床样本进行测序验证,结果均为相应病毒的基因片段。【结论】本研究建立了可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的四重RT-PCR检测方法,研究结果为临床4种猪腹泻病毒病的鉴别诊断及流行病学调查提供了技术手段。     

应用多重RT—PCR技术检测食管癌患者外周血多种肿瘤基因标志物的研究

目的:建立多重RT-PCR同步检测技术,联合检测黑色素瘤抗原MAGEA3基因、人类斯钙素hsTC1基因、上皮细胞角质蛋白CK20、CK19基因及癌胚抗原CEA基因mRNA在食管癌患者外周血中的表达。方法:在分析MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19、CEA和β-actin六种基因mRNA全长序列资料的基础上,自行设计并筛选出6对引物及6条寡核苷酸探针,利用多重RT-PCR技术并结合基因芯片对样本进行检测。结果:全部样品均可检出β-actin,55例食管癌患者外周静脉血中MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA的阳性表达率分别为25.45%、47.27%、49.09%、34.55%和52.73%;多重RT-PCR技术同时检测MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA基因,如果至少表达其中一种即可作为阳性表达者,其阳性表达率可达72.73%。而10例食管癌组织中均为阳性,28例正常健康捐献者的外周血中有2例CEA表达阳性,27例非肿瘤病人的外周血中有3例CK20阳性,3例CK19阳性,3例CEA阳性。测序结果证实RT-PCR产物确为MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA基因。结论:联合检测MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA可以增加外周血循环癌细胞检测的敏感性,本研究建立的多重RT-PCR技术可以做为一种快速、灵敏的检测手段。     

狂犬病病毒TaqMan qRT-PCR检测方法的建立

建立狂犬病病毒TaqMan qRT-PCR检测方法,并进行评价和初步应用。针对狂犬病病毒L基因保守区域设计特异性引物、探针,建立PCR反应体系并评价检测体系的扩增效率、灵敏度、特异性和准确性等指标,灵敏度评价结果与现有巢式RT-PCR和基于N基因qRT-PCR检测方法相比较。结果显示本研究建立的基于L基因qRTPCR检测体系扩增效率高于90%;最小检测病毒滴度为2.7×10~(-3)FFU/mL,灵敏度高于基于N基因qRT-PCR和巢式RT-PCR 100倍;最小检测核酸拷贝数为100拷贝,建立了基于目的基因RNA标准品的标准曲线,可用于定量检测;对于我国的狂犬病病毒流行毒株检测范围较广,动物样本检测结果与金标准DFA检测结果相一致,准确性较高。本研究建立的狂犬病病毒qRT-PCR可用于狂犬病病毒实验室检测。     

中东呼吸综合征冠状病毒多重荧光定量RT-PCR检测技术的建立

建立中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染的筛查与诊断应用的核酸检测方法。本研究建立了基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重的三种荧光定量RT-PCR检测技术方法,分别与前期建立的单重荧光定量RT-PCR(upE或N2)检测方法做了比较,并且采用MERS-CoV病毒毒株、上海提供的口岸发烧病人样本以及由首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品和全血的样品做了临床验证。结果显示:采用MERS-CoV病毒毒株作为模板,三种新建立的多重检测方法与单重荧光定量RT-PCR检测方法最低检测限均能达到10PFU/mL,且与其他常见呼吸道病毒的阳性样本均无交叉反应,特异性良好。对临床样品的验证中,上海病人咽拭子样本均为阴性,而中国首例MERS输入病例的急性期咽拭子样品均为阳性,而全血样的检测结果显示N2靶标有较高检出率,明显优于基于upE单一靶标。本研究所建立的基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重荧光定量RT-PCR检测技术方法用于MERS-CoV感染的实验室诊断,具有较高灵敏度与特异性及适用性。     

基于Qβ噬菌体的甲肝病毒装甲RNA标准参考样品的研制

【背景】目前食品中甲肝病毒分子的检测缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,影响了检测结果的科学性与准确性。【目的】基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含甲肝病毒检测靶标的装甲RNA (Hepatitis A virus armored RNA,AR-HAV),并开展初步定值、均匀性、稳定性研究,为HAV分子检测提供标准参考样品。【方法】人工合成包含Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、HAV检测靶标cDNA序列的核酸片段QGBHAV,并亚克隆到pET-28a(+)中构建重组质粒pET-QGBHAV,转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,利用超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析柱纯化AR-HAV后电镜观察。通过实时荧光RT-PCR对AR-HAV进行初步定值及均匀性和稳定性研究。【结果】SDS-PAGE结果表明重组质粒在大肠杆菌中有约14.1 kD的目的蛋白表达;纯化后的AR-HAV无杂蛋白和残留质粒;电镜下可见结构完整、大小约为25nm的病毒样颗粒;定值结果显示,AR-HAV中检测靶标RNA的含量为(2.57±0.12)×107 copies/μL;均匀性分析结果为F=1.23F0.05 (9,20),证实AR-HAV的均匀性良好;稳定性结果表明,AR-HAV在可37°C保存9 d,25°C保存25 d,4°C保存40 d,-20°C保存180 d,-80°C至少保存360 d。【结论】基于Qβ噬菌体制备的AR-HAV拷贝数高,具有良好的均匀性和稳定性,可为HAV的分子检测提供安全、稳定的标准参考样品。     

构建皮肤组织中特异表达HPV16-E6基因的小鼠模型

目的:构建特异在皮肤表达乳头瘤病毒(HPV16)E6基因的真核表达载体,并鉴定其在转基因小鼠体内的表达。方法:通过PCR方法扩增皮肤特异启动子p INV及HPV16-E6,将以上片段通过酶切连接,插入去掉CMV启动子的pc DNA3.1(-)载体,获得dpc DNA3.1(-)-p INV-E6载体;并显微注射制备其转基因小鼠,利用RT-PCR、Western blot及免疫组化技术检测获得的阳性小鼠体内E6的表达水平。结果:dpc DNA3.1(-)-p INV-E6载体测序正确;经鉴定31只实验小鼠中,有2只小鼠携带外源基因,将其与野生型小鼠交配获得的F1代中又有2只阳性小鼠;且在获得阳性小鼠的皮肤组织中RT-PCR检测有E6的转录本,Western blot检测有E6蛋白表达,且免疫组化检测结果显示有E6在皮肤表达且引起皮肤微增生。结论:成功构建了p INV-E6转基因模型小鼠,HPV16-E6基因在小鼠皮肤中特异表达,为进一步研究HPV16-E6在癌症中的作用奠定了基础。     

逆转录-聚合酶链式反应检测果树RNA病毒

为调查主要果树携带苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)和李属坏死环斑病毒(PNRSV)的情况,以指示植物为试材,优化了四种病毒的逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测体系.使用该优化体系检测了苹果树、樱桃树、桃树中携带上述四种病毒的情况.结果:建立了特异性强、灵敏度高、成本低的RT-PCR检测体系;同时又证明主要果树被这几种病毒单独感染和复合感染的程度均较高.     

圈养小熊猫几种病毒的PCR检测

本文采用巢式PCR/ RT-PCR 方法,对我国10 个动物园中无临床症状的圈养小熊猫的71 个肛拭子和61 个唾液拭子样品,进行犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬腺病毒(CAV)和犬疱疹病毒(CHV)的检测,以评估我国圈养小熊猫是否面临这几种病毒的威胁。对阳性PCR 结果进行测序分析,并与GenBank 上的序列进行比较。结果,在肛拭子样品中检测到3 个CPV 和6 个CCV 阳性结果,经测序后,与GenBank 上序列的同源性分别达99% 和100% 。而在唾液拭子样品中没有检测到任何阳性结果,且CDV、CAV和CCV 的检测结果均为阴性。从阳性CPV 的肛拭子样品中分离到一株细小病毒毒株,表明圈养小熊猫已受到细小病毒和犬冠状病毒的感染,今后应加强这两种病毒的预防工作。本文所采用的PCR 方法检测病毒性疾病,能检测到微量的病毒模板,可对小熊猫病毒性感染进行早期诊断。     

Hendra病毒一步法Real-time RT-PCR检测方法的建立

目的 建立针对Hendra病毒N基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于Hendra病毒感染样本的快速检测和准确定量.方法 针对Hendra病毒的保守基因N设计引物和探针,构建体外转录的RNA片段作为标准品,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性.结果 所设计的引物经Blast检索可以用于检测所有已知的Hendra病毒株.本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出Hendra病毒,不与Nipah病毒产生交叉反应.检测灵敏度为2.6×100～2.6×101copies/μl.标准曲线的线性范围为2.6×101～2.6×107copies/μl.结论 本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于Hendra病毒感染样本的检测.     

SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法检测贝类中的诺如病毒

针对诺如病毒II型的保守区域设计引物,建立了SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的反应体系。此方法的病毒检测下限达到102拷贝,标准曲线的线形范围为102~106拷贝,相关系数为0.9952,斜率为?2.982,截距为35.84。对诺如病毒II型检测特异,与轮状病毒、腺病毒、甲肝病毒、星状病毒无交叉反应。针对质粒标准品检测的批内试验变异系数(CV)为0.95%~1.69%(n=5),批间试验CV为0.87%~1.24%(n=3)。运用此方法随机检测30份贝类水产品,检测出2份阳性样品。结果表明,SYBR Green I荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的方法灵敏、特异、重复性好,可应用于贝类水产品的快速检测。     

SYBR Green I荧光RT-PCR法检测贝类中的诺如病毒

针对诺如病毒II型的保守区域设计引物,建立了SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的反应体系。此方法的病毒检测下限达到102拷贝,标准曲线的线形范围为102~106拷贝,相关系数为0.9952,斜率为?2.982,截距为35.84。对诺如病毒II型检测特异,与轮状病毒、腺病毒、甲肝病毒、星状病毒无交叉反应。针对质粒标准品检测的批内试验变异系数 (CV) 为0.95％~1.69％ (n=5),批间试验CV为0.87％~1.24％ (n=3)。运用此方法随机检测30份贝类水产品,检测出2份阳性样品。结果表明,SYBR Green I荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的方法灵敏、特异、重复性好,可应用于贝类水产品的快速检测。     

Nipah病毒一步法Real-time RT-PCR检测方法的建立

目的建立针对Nipah病毒N基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于Nipah病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对Nipah病毒的保守基因N设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果所设计的引物经Blast检索可以用于检测所有已知的Nipah病毒株。本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出Nipah病毒,不与Hendra病毒产生交叉反应。检测灵敏度为1.1×100～1.1×101copies/μl。标准曲线的线性范围为1.1×102～1.1×106copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于Nipah病毒感染样本的检测。     

H7亚型禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

通过分析流感数据库45个H7亚型禽流感病毒的HA序列,在保守区内设计并合成引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,扩增片段大小为501bp。通过对H7亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液不同滴度检测,证实病毒尿囊液最低检出量为105.5EID50/mL;阳性棉拭子最低检出量为103EID50/mL。用该方法检测H1～H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原进行检测,仅有H7亚型AIV有特异性目的条带,与其他均无交叉反应。从脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品的病毒分离和RT-PCR方法比较,表明在10-1的样品浓度下,两者可以达到相同的检出量。表明该一步法RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高和准确率高的特点。