蚊浓核病毒介导的人工内含子在蚊体内外的初步应用

根据人β-球蛋白基因第一内含子5′-端供位序列与免疫球蛋白重链可变区基因3′-端受位序列构建人工内含子,将人工内含子插入重组蚊浓核病毒质粒载体p7NS1-GFP中GFP融合表达的病毒非结构蛋白NS1的编码框内,构建成载体p7NS1-Intron-GFP,与辅助载体pUCA共转染蚊C6/36细胞系,荧光显微镜下观察细胞内GFP的表达情况。纯化、回收共转染后形成重组病毒与野生病毒,共感染白纹伊蚊二龄幼虫并观察幼虫体内GFP的表达情况。结果在C6/36细胞与蚊幼虫体内均观察到GFP的高效表达,证实人工内含子无论在蚊细胞系内还是在活体幼虫内均可正常行使其自我剪切的功能,未影响到下游蛋白GFP的表达。本研究为人工内含子在蚊虫细胞内的应用奠定基础,为蚊虫及其病原体相关基因工程技术提供新的策略。     

登革Ⅱ型病毒在白纹伊蚊体内分布的研究

利用蚊虫连续石蜡切片免疫组织化学技术,对登革Ⅱ型病毒(DEN-2)感染白纹伊蚊Aedes albopictus后的散播时间、程度及组织器官的感染顺序进行监测,以了解DEN-2在媒介白纹伊蚊体内的分布规律。结果表明：大剂量感染登革Ⅱ型病毒后,在蚊虫消化道的主要部位以及大多数组织器官包括神经及内分泌系统在内,如涎腺、脑、神经节等亦检测到病毒抗原。登革Ⅱ型病毒一旦感染并逸出中肠会迅速侵染其它组织。从各组织感染率的高低推断,病毒逸出中肠后通过血淋巴传播到其它组织的顺序通常为：前肠、涎腺、咽部神经节、脑及食管下神经节、后肠及复眼的小眼等。     

白纹伊蚊对几种引诱物的行为和触角电位反应

【目的】了解引诱物对白纹伊蚊Aedes albopictus行为及触角电生理影响,以揭示白纹伊蚊吸血与传病的行为机制。【方法】采用行为学和触角电位学的方法分别测定了L-乳酸、氨、1-辛烯-3-醇对白纹伊蚊的行为反应和触角电位强度变化,并分析了几种引诱物对白纹伊蚊活性的影响及其规律。【结果】氨、L-乳酸和1-辛烯-3-醇3种引诱物的引诱效果和触角电位变化趋势相同,随着引诱物浓度的增加,对白纹伊蚊的引诱效果和触角电位强度也相应增强。同等浓度下氨对白纹伊蚊的引诱效果较另外两种引诱化合物更显著,且1-辛烯-3-醇的引诱效果相比L-乳酸要更强。当引诱化合物浓度在1 mg/L以上时,白纹伊蚊触角电位反应增幅随着浓度增大也逐渐增大;在引诱化合物浓度达1 000 mg/L时,白纹伊蚊对氨的触角电位反应最强烈。【结论】行为学和触角电位的研究手段相结合能更为全面地反映和评价不同引诱物对蚊虫的引诱效果。     

应用于miRNA靶标检测的双荧光素酶报告载体的构建及鉴定北大核心CSCD

以牙鲆空通气孔同源框2基因(empty spiracles homeobox 2,emx2)为例,构建包含emx2 3'UTR区的野生型和突变型双荧光素酶重组报告表达载体,以期应用于mi RNA靶标的检测。利用Trizol法提取牙鲆成鱼精卵巢混合组织总RNA,参照已克隆出来的emx2基因c DNA序列,设计并合成emx2 3'UTR片段的引物并进行PCR扩增,将得到的基因片段和psi CHECK-2载体双酶切后,用T4 DNA Ligase酶进行连接反应,并转化入DH5α感受态细胞,筛选后得到野生型重组质粒;同时采用定点诱变法对emx2基因进行体外定点诱变并采用同样的方法形成突变型重组质粒。对野生型和突变型重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。成功克隆了emx2 3'UTR区,并将emx2 3'UTR区的mi RNA靶点序列GACTTGA突变为AGTCCAG,成功构建了野生型和突变型包含emx2 3'UTR区的mi RNA靶标检测载体。通过RT-PCR、基因重组及定点诱变技术成功构建了应用于mi RNA靶标验证的野生型和突变型双荧光素酶报告载体psi CHECK-emx2-3'UTR和psi CHECK-mutated-emx2-3'UTR。     

迷迭香植物精油对白纹伊蚊的驱避作用及其化学成分

应用水蒸气蒸溜法和超临界二氧化碳萃取法提取生长于云南的迷迭香茎叶植物精油,测试2种精油对白纹伊蚊Aedes albopictus Skuse的驱避作用,并利用GC/MS联用仪分析2种精油的化学成分。结果表明:超临界二氧化碳提取的迷迭香精油对白纹伊蚊的驱避时间是(5.82±1.13)h,达到国标驱避剂评价的B级标准。2种精油化学成分中都含有驱纹活性物质:柠檬烯、樟脑、Eucalyptol、(+)-4-Carene、1-methyl-4-(1-methyle thylidene)-cyclohexene、Beta-pinene等,且驱蚊活性成分在挥发油中占有较高比例,显示该植物精油在驱蚊方面有一定开发价值。     

登革病毒转基因载体pB［PUBnls_EGFP_prM］的构建及其在C6/36细胞中整合作用的检测

利用转基因技术来探索新的蚊媒疾病防治方法,将登革病毒前膜蛋白基因prM重组入以转座子piggyBac因子为基础的载体,构建了昆虫转基因载体pB［PUBnls-EGFP-prM］,在辅助质粒的作用下共同转染白纹伊蚊Aedes albopictus C6/36细胞。PCR和Southern blot证明构建的转基因载体可以将EGFP-prM基因整合入蚊虫基因组中。验证了转座子piggyBac因子、启动子polyubiquitin可以在白纹伊蚊中发挥功能,为进一步构建不传播登革病毒的转基因白纹伊蚊奠定了基础。     

14-3-3σ 干扰逆转录病毒载体的构建及其稳定转染HaCat 细胞系的建立

目的:构建14-3-3σ干扰逆转录病毒载体,建立稳定转染的HaCat细胞系。方法:人工合成14-3-3σ基因干扰序列并定向插入到pSuper-retro-neo-EGFP质粒,并在STBL3菌内进行质粒扩增,刷选阳性克隆,酶切测序鉴定,转染293FT细胞进行病毒包装、扩增、纯化、获取逆转录病毒载体,将逆转录病毒载体感染HaCat细胞后Western免疫印迹法、Real-timePCR法检测14-3-3σ的表达情况。结果:连接重组后经酶切和测序筛选出pSuper-retro-neo-EGFP-si14-3-3σ;干扰质粒稳定转染的HaCat细胞系在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光,Western免疫印迹法和Real-timePCR法表明14-3-3σ表达明显抑制。结论:成功构建了14-3-3σ干扰的逆转录病毒载体,并构建了其稳定转染的HaCat细胞系。     

14-3-3σ干扰逆转录病毒载体的构建及其稳定转染HaCat细胞系的建立

目的：构建14-3-3σ干扰逆转录病毒载体,建立稳定转染的HaCat细胞系。方法：人工合成14-3-3σ基因干扰序列并定向插入到pSuper-retro-neo-EGFP质粒,并在STBL3菌内进行质粒扩增,刷选阳性克隆,酶切测序鉴定,转染293FT细胞进行病毒包装、扩增、纯化、获取逆转录病毒载体,将逆转录病毒载体感染HaCat细胞后Western免疫印迹法、Real-timePCR法检测14-3-3σ的表达情况。结果：连接重组后经酶切和测序筛选出pSuper-retro-neo-EGFP-si14-3-3σ;干扰质粒稳定转染的HaCat细胞系在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光,Western免疫印迹法和Real-timePCR法表明14-3-3σ表达明显抑制。结论：成功构建了14-3-3σ干扰的逆转录病毒载体,并构建了其稳定转染的HaCat细胞系。     

表达血管抑制因子的腺相关病毒载体的构建及其体内外活性

血管抑制因子(Vasostatin,VAS),为集钙蛋白N-末端180个氨基酸大小的蛋白,是一种内源性血管生成抑制因子,对多种肿瘤的生长具有很强的抑制作用.近期有研究显示,VAS可以促进神经内分泌肿瘤的恶化,提醒研究人员在开发该抗肿瘤药物时必须非常谨慎.将VAS cDNA插入腺相关病毒-2表达质粒pAAV-2,采用无辅助病毒参与的三质粒共转染法制备rAAV-VAS病毒.体外分别转染小鼠胰内皮细胞MS1和结肠癌细胞HCT-116,MTT法测定对细胞生长的影响,Western blotting方法检测VAS的表述.采用小鼠皮下移植瘤模型,验证VAS的表达对肿瘤生长、新生血管密度、以及细胞增殖的作用.结果证明构建的rAAV-VAS病毒载体,能抑制小鼠胰内皮细胞的生长,转染HCT-116后能有效表达VAS蛋白,但HCT-116的体外生长不受影响.瘤体注射rAAV-VAS后,HCT-116移植瘤在小鼠体内的生长速度明显减缓,肿瘤新生血管密度明显降低.结果显示,rAAV-VAS可以抑制HCT-116移植瘤的新生血管形成,但对其细胞增殖无明显作用.     

14-3-3θ基因过表达载体的构建及其过表达乳腺癌细胞株的建立

目的:为进一步研究14-3-3θ基因对乳腺癌生物学行为的影响,构建14-3-3θ基因真核细胞过表达重组载体并建立其过表达的乳腺癌细胞株。方法:合成的14-3-3θ基因重组在p ENTR 3C DUAL载体中,课题组采用DNA重组技术将14-3-3θ基因剪切分离后,插入真核表达质粒载体pc DNA4.0中,重组得到真核过表达载体pc DNA4.0-14-3-3θ,并用其转染293T细胞后用western blot进行验证,将经过验证的真核过表达载体pc DNA4.0-14-3-3θ转染乳腺癌细胞后用zeocin筛选,筛选出的乳腺癌细胞经过western-blot和PCR验证确为稳定过表达14-3-3θ的乳腺癌细胞。结果:成功构建14-3-3θ基因过表达真核载体并建立其过表达乳腺癌细胞株,揭示14-3-3θ基因可能在乳腺癌的早期诊断和预后预测中具有重要作用。     

TCRBV12—3重组载体构建及其抗肿瘤作用的初步研究

目的：构建pEGFP．C3-TCRBVl2—3表达载体并初步研究其抗肿瘤作用。方法：TCRBVl2—3基因片段从pGEM-T—TCRBVl2-3载体上酶切并克隆至pEGFP—C3载体中,通过脂质体将pEGFP—C3．TCRBVl2-3表达载体转染外周血单个核细胞（PBMCs）,48小时后荧光显微镜观察转染效率。PBMCs细胞、pEGFP-C3载体转染的PBMCs细胞、pEGFP—C3-TCRBVl2-3表达载体转染的PBMCs细胞分别与肝癌细胞BEL-7402和宫颈癌细胞HeLa共培养24h,显微镜观察肿瘤细胞的生长情况。结果：测序证实TCRBVl2-3基因片段成功亚克隆至pEGFP—C3载体中,荧光显微镜证实重组体转染PBMCs细胞48h后可有效表达绿色荧光。显微镜观察发现pEGFP—C3-TCRBVl2-3载体转染的PBMCs对肝癌细胞有杀伤作用．但对宫颈癌杀伤作用不明显。结论：成功构建pEGFP—C3一TCRBVl2—3表达载体,初步证实TCRBVl2．3对肝癌细胞有杀伤作用。     

重组禽腺联病毒介导的miRNA抑制传染性法氏囊病病毒在鸡胚内的复制

【目的】在鸡胚水平上探索VP1和VP2基因特异miRNA抑制传染性法氏囊病病毒(infectious bursaldisease virus,IBDV)复制的可行性。【方法与结果】将表达VP1基因特异miRNA重组载体pAITR-RFPmiVP1或VP2基因特异miRNA重组载体pAITR-RFPmiVP2E与禽腺联病毒(avian adeno-associated virus,AAAV)包装载体pcDNA-ARC和腺病毒辅助载体pHelper共转染AAV-293细胞,获得重组病毒rAAAV-RFPmiVP1和rAAAV-RFPmiVP2E,用同样方法获得不表达miRNA的rAAAV-RFP和表达对照miRNA的rAAAV-RFPmiVP2con。电镜观察显示重组病毒具有典型的AAAV颗粒形态;PCR检测结果表明其基因组中含miRNA表达盒;经poly(A)加尾RT-PCR检测证明重组病毒感染细胞能表达基因特异的miRNA。分别将重组病毒经卵黄囊途径接种8日龄SPF鸡胚,然后经绒毛尿囊膜途径用Lukert株IBDV攻毒,收获鸡胚进行IBDV组织细胞半数感染剂量(TCID50)测定。结果在攻毒后第3天,rAAAV-RFP和rAAAV-RFPmiVP2con接种组的IBDV TCID50为8.0 log10,rAAAV-RFPmiVP1和rAAAV-RFPmiVP2E接种组的IBDV TCID50分别下降到1.0和1.5 log10;在攻毒后第6天,rAAAV-RFP和rAAAV-RFPmiVP2con接种组的IBDV TCID50仍为8.0 log10,rAAAV-RFPmiVP1和rAAAV-RFPmiVP2E接种组的TCID50分别下降到0.8和2.0 log10。【结论】rAAAV是有效的miRNA鸡胚导入载体,表达的VP1和VP2基因特异miRNA能有效阻断IBDV复制。     

外泌体miRNA的生物学功能及其在肺纤维化疾病中的调控作用

外泌体是一种微型纳米级细胞外囊泡,由于能够直接参与细胞间信息的传递和物质的运输,被认为是细胞间通讯、免疫调节、疾病诊断和预后循环生物学标志物的重要载体,其携带的核酸和蛋白质等内含物能够影响受体细胞的生理状态.作为一种内源性非编码微小RNA,microRNA (miRNA)对疾病诊断和治疗有着重要的研究价值,有大量证据表明该类分子对肺部疾病的发病进程起着控制调节作用.本文聚焦于近年来细胞外泌体来源miRNA的生物学特性和功能领域,综述了近年来生物医学研究中的热点分子外泌体miRNA在肺部疾病尤其是肺纤维化中调控功能和机制的研究,因此不仅能为肺纤维化疾病的诊断提供新的标志物分子,并且还能够为肺纤维化的外泌体干预治疗建议新的干预策略.     

含14-3-3蛋白抑制肽R18重组腺病毒制备及其在心肌细胞中的表达

目的:构建并鉴定含14-3-3蛋白抑制肽R18的重组腺病毒,为研究14-3-3蛋白的功能提供基础工具。方法:用同源重组方法构建含14-3-3蛋白抑制肽R18的复制缺陷型腺病毒载体(AdR18),并加以鉴定、扩增,以获得高滴度AdR18病毒液,体外感染乳大鼠心肌细胞,检测目的基因表达。结果:将构建的重组腺病毒载体AdR18感染乳大鼠心肌细胞并表达48h后,蛋白印迹结果显示AdR18感染组有明显R18的表达,对照组无表达。结论:腺病毒载体可高效率导入外源基因在心肌细胞中高表达。     

TCR BV12-3重组载体构建及其抗肿瘤作用的初步研究

目的:构建pEGFP-C3-TCR BV12-3表达载体并初步研究其抗肿瘤作用。方法:TCR BV12-3基因片段从pGEM-T-TCR BV12-3载体上酶切并克隆至pEGFP-C3载体中,通过脂质体将pEGFP-C3-TCR BV12-3表达载体转染外周血单个核细胞(PBMCs),48小时后荧光显微镜观察转染效率。PBMCs细胞、pEGFP-C3载体转染的PBMCs细胞、pEGFP-C3-TCR BV12-3表达载体转染的PBMCs细胞分别与肝癌细胞BEL-7402和宫颈癌细胞HeLa共培养24 h,显微镜观察肿瘤细胞的生长情况。结果:测序证实TCR BV12-3基因片段成功亚克隆至pEGFP-C3载体中,荧光显微镜证实重组体转染PBMCs细胞48 h后可有效表达绿色荧光。显微镜观察发现pEGFP-C3-TCR BV12-3载体转染的PBMCs对肝癌细胞有杀伤作用,但对宫颈癌杀伤作用不明显。结论:成功构建pEGFP-C3-TCR BV12-3表达载体,初步证实TCRBV12-3对肝癌细胞有杀伤作用。     

慢病毒介导的小鼠PINK1基因RNAi载体的构建及在NIH3T3细胞中的筛选

目的:构建筛选靶向特异PINK1-siRNA慢病毒表达载体,感染小鼠胚胎细胞(NIH3T3)验证该病毒载体的敲减效率,为研究帕金森病的发病机制奠定基础。方法:构建2对靶向小鼠PINK1-siRNA序列(KD1和KD2),将这2对序列连接在GV118上,将重组载体和病毒包装的辅助质粒共转染293 T细胞,获得慢病毒颗粒,再将该病毒颗粒转染入NIH3T3细胞,用qRT-PCR验证细胞内PINK1 mRNA表达水平以验证敲减效果。结果:筛选出可以用于后续实验的高效靶向KD2序列,并成功转染到小鼠NIH3T3细胞中,在感染复数(MOI)为50时,KD2的沉默效果最好,敲减率达到66.4%。结论:成功构建了高效靶向小鼠PINK1-siRNA慢病毒载体,其可稳定转染小鼠NIH3T3细胞,可高效抑制PINK1 mRNA的表达。为下一步利用其感染神经细胞或注入动物脑内,进一步研究PINK1基因在帕金森病发病过程中的作用环节和机制提供了分子生物学的技术基础。     

逆转录病毒载体构建的hNT-3基因在大鼠成纤维细胞中的表达

为了检验重组逆转录病毒对体外培养细胞的感染能力和效率 ,用逆转录病毒载体构建的人神经营养因子 3(pLXSN NT3)感染大鼠原代成纤维细胞 ,经G4 18筛选获得了稳定整合有外源hNT 3的工程细胞株 .RT PCR证实了外源基因hNT 3已整合到宿主细胞基因组 ,并可合成其mRNA ;PCR检测方法证明细胞株不含具有感染能力的病毒 ;Western印迹证明了细胞能正确表达hNT 3;大乳鼠背根神经节检测了细胞上清液中的NT 3生物活性 .体外感染实验的成功为进一步进行基因治疗动物实验打下了基础     

PhaP介导EGFR靶向多肽修饰的肿瘤靶向PHBHHx纳米药物递送载体的构建

聚羟基脂肪酸(PHA)颗粒表面结合蛋白Pha P具有与疏水性高分子材料表面紧密结合的能力,本研究将EGFR靶向多肽(ETP)与PhaP进行融合表达,构建了ETP-PhaP融合蛋白表达的重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)(pPI-ETP-P)。经对工程菌株的诱导表达及ETP-PhaP融合蛋白的纯化后,通过PhaP蛋白介导能够有效地将ETP-PhaP融合蛋白修饰于3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯(PHBHHx)纳米微球表面,构建成为具有EGFR靶向作用的药物递送载体。分别检测宫颈癌细胞系SiHa(EGFR高表达)和CaSKi(EGFR低表达)对ETP-PhaP修饰的PHBHHx纳米药物载体和未经修饰的纳米药物载体的吞噬情况。结果显示,纯化的ETP-PhaP融合蛋白能够很好地吸附于PHBHHx颗粒的表面,经ETP-PhaP融合蛋白修饰的PHBHHx纳米药物载体对EGFR高表达的宫颈癌Si Ha细胞的靶向效果强于EGFR低表达的CaSKi细胞系。这一结果表明了PhaP介导的PHBHHx纳米微球表面EGFR靶向多肽修饰具有简便、高效的优势,为疏水性纳米药物载体表面功能多肽修饰提供了一种新策略。     

核转录因子TR3小干扰RNA载体的构建及其效果鉴定

目的：构建核孤儿受体TR3的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并进行沉默效果测定。方法：根据TR3 mRNA序列和载体psiSTRIKE的粘性末端,设计合成TR3的干扰RNA序列,退火后克隆至psiSTRIKE,经测序鉴定后用阳离子脂质体将重组子和TR3高表达载体TR3-pcDNA共转染至HEK293细胞中,以Western blotting检测干扰后HEK293细胞内TR3表达的变化。结果：Western blotting检测结果证实构建的TR3 siRNA表达重组载体可显著抑制HEK293细胞内TR3的高表达。结论：构建了核孤儿受体TR3 siRNA真核表达载体。