狂犬病病毒CVS-11核蛋白B细胞线性抗原表位研究

为阐明狂犬病病毒CVS-11核蛋白B细胞线性抗原表位,本研究通过合成肽模拟B细胞线性抗原表位,采用免疫学方法对生物信息学分析获得的狂犬病病毒CVS-11核蛋白潜在B细胞线性抗原表位进行验证。结果显示,狂犬病病毒CVS-11核蛋白355~369、385~400位氨基酸序列合成肽免疫小鼠血清经间接酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗多肽抗体效价达到1∶12 800以上;抗多肽抗体在免疫印迹试验(Western blot,WB)中识别变性狂犬病病毒CVS-11核蛋白抗原,在间接荧光抗体试验(Indirect fluorescent antibody,IFA)中识别感染BHK-21细胞的狂犬病病毒CVS-11核蛋白抗原。因此,狂犬病病毒CVS-11核蛋白355~369、385~400位氨基酸序列经证实为B细胞线性抗原表位。     

用免疫信息学技术设计新型H1N1流感神经氨酸酶抗原表位肽

神经氨酸酶(NA)是一种具有唾液酸酶活性的流感毒粒表面糖蛋白,切断病毒HA与细胞膜上神经氨酸残基之间的连接,使病毒能够从宿主细胞表面释放.检测了新型H1N1流感NA基因核苷酸序列,用免疫信息学方法预测、筛选和鉴定B细胞表位;人工合成NA抗原多肽SE8和RE6,并免疫新西兰兔制备抗血清.两种抗血清具有体外中和新型H1N1流感病毒能力(微量中和实验),而且还具有拮抗血凝释放作用.根据2009年全球毒株NA基因序列检测和比对结果,发现多肽SE8和RE6序列未变异.实验揭示,多肽SE8和RE6可以作为新型H1N1流感候选多肽疫苗.     

HIV-1辅助蛋白Vpr多肽抗体的制备与鉴定

预测Vpr蛋白的B细胞抗原表位,并利用合成的B细胞表位肽制备Vpr特异性抗体。应用生物信息学技术获得Vpr蛋白共享氨基酸序列并预测其潜在B细胞抗原表位,与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)偶联合成多肽并免疫家兔,鉴定及纯化获得的多肽特异性抗体。软件预测显示,Vpr蛋白N端的第3～19位(N)和C端的第82～95位(C)氨基酸序列为潜在B细胞抗原表位;ELISA检测抗血清中多肽特异性抗体的效价都达到1:105以上;Western-Blotting结果显示,无论对HIV-1B亚型还是CRF07_BC重组型的Vpr蛋白,其多肽N抗体和C抗体均能特异性识别;免疫沉淀结果显示,Vpr多肽N和C抗体也能特异性结合未变性的野生型Vpr或GFP-Vpr融合蛋白。利用生物信息学技术能成功预测Vpr蛋白B细胞抗原表位,免疫所获得的抗体具有较好的特异性和应用性。     

猪流感病毒抗原表位基因表达载体构建与免疫原性分析

根据猪流感病毒血凝素蛋白基因(Heamuglutinine, HA)的核苷酸序列, 设计、筛选HA蛋白氨基酸序列的主要表位多肽4个, 将4个片段以柔性连接串联成模拟蛋白, 核苷酸约为300 bp, 体外扩增该模拟蛋白基因, 插入到原核表达载体pET30a(+)中, 转染宿主菌诱导表达, 结果获得分子量为20 kD的表达蛋白, 该蛋白可与抗His-tag抗体、抗猪流感病毒H1N1、H3N2亚型高免血清发生免疫学反应。纯化后免疫小鼠, ELISA及血凝抑制(Heamuglutinine inhibitor, HI)试验检测, 小鼠产生针对多肽抗原的血清抗体, 同时还可检测到H1N1、H3N2亚型SIV血凝抗体。流氏细胞仪检测免疫组外周血淋巴细胞高于对照组, 说明该模拟蛋白具有与H1N1、H3N2亚型猪流感病毒相似的免疫原性及反应原性, 为H1N1、H3N2血清亚型猪流感病毒疫苗研制提供了新手段。     

猪流感病毒抗原表位基因表达载体构建与免疫原性分析

根据猪流感病毒血凝素蛋白基因(Heamuglutinine, HA)的核苷酸序列, 设计、筛选HA蛋白氨基酸序列的主要表位多肽4个, 将4个片段以柔性连接串联成模拟蛋白, 核苷酸约为300 bp, 体外扩增该模拟蛋白基因, 插入到原核表达载体pET30a(+)中, 转染宿主菌诱导表达, 结果获得分子量为20 kD的表达蛋白, 该蛋白可与抗His-tag抗体、抗猪流感病毒H1N1、H3N2亚型高免血清发生免疫学反应。纯化后免疫小鼠, ELISA及血凝抑制(Heamuglutinine inhibitor, HI)试验检测, 小鼠产生针对多肽抗原的血清抗体, 同时还可检测到H1N1、H3N2亚型SIV血凝抗体。流氏细胞仪检测免疫组外周血淋巴细胞高于对照组, 说明该模拟蛋白具有与H1N1、H3N2亚型猪流感病毒相似的免疫原性及反应原性, 为H1N1、H3N2血清亚型猪流感病毒疫苗研制提供了新手段。     

B型肉毒毒素重链抗原表位的预测及表位合成肽抗原性的检测

目的:预测B型肉毒毒素蛋白抗原表位,研究表位合成肽的生物学活性。方法:利用生物信息学,结合Anthwine分析软件及网络平台,预测B型肉毒毒素蛋白重链的B细胞抗原表位。人工合成4条(P1,P2,P3,P4)表位多肽,与抗B型肉毒毒素类毒素的马血清反应;采用腹腔注射的方式用合成肽免疫BALB/c小鼠,检测免疫血清与合成肽的结合;对免疫小鼠腹腔注射B型肉毒毒素。结果:合成的多肽能与抗B型肉毒毒素的类毒素的马血清结合;多肽免疫小鼠后能产生针对多肽的抗体,其中P1、P3、P4产生的抗体对受毒素攻击的小鼠具有保护作用。结论:成功预测了抗原表位,合成的表位多肽具有较好的抗原性。     

生长相关蛋白GAP-43多肽抗体的制备

目的对生长相关蛋白-43（growth associated proteins-43,GAP-43）进行抗原表位分析并制备兔多克隆抗体。方法通过对GAP-43 cDNA序列及氨基酸序列的结构进行生物信息分析,依据蛋白质的二级结构、亲水性、疏水性、抗原性及理化特性,经过同源性检索后,综合考虑抗体设计的其他因素,选出具有免疫活性的抗原决定簇多肽片段,采用有机固相多肽合成法合成了GAP-43的多肽片段,并与载体蛋白血蓝蛋白（KLH）偶联制备成抗原,免疫新西兰家兔。结果 ELISA测定GAP-43抗体效价为1∶32 000;Western blot检测结果显示：在分子量25kDa出现单一条带;免疫组织化学法检测显示：GAP-43蛋白在小鼠海马神经元中有表达;免疫细胞化学法检测显示：GAP-43蛋白在人神经母细胞瘤株SH-SY5Y中存在表达。结论利用生物信息学软件比较准确地预测GAP-43的抗原决定簇,并成功制备了高效价、高特异性的多肽抗体。     

睾丸特异抗原C_2B细胞抗原决定簇的定位

免疫性不育病人的血清（ＩＰＳ）能１００％地抑制人体外受精．用该血清筛选人睾丸ｃＤＮＡ基因表达文库,发现了一种新的睾丸特异抗原（称作Ｃ２）．通过ＤＮＡ顺序研究,并与基因库中的有关同源性基因数据进行比较,证实Ｃ２是一个新的特异蛋白．Ｃ２基因仅与睾丸组织的ｍＲＮＡ杂交．该克隆在大肠杆菌中所表达的融合蛋白能够被３个不同的不育病人血清识别．利用嵌套缺失和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹的方法研究其抗原决定簇定位,发现Ｂ细胞抗原决定簇在羧基端２９个氨基酸范围内．用ＧＣＧ软件分析该抗原的氨基酸的亲水性和疏水性以及其存在于蛋白表面的可能性,确定其中的１５个氨基酸为抗原决定簇所必需,并合成了多肽     

SARS-CoV推测N蛋白功能结构的生物信息学研究

目的:利用生物信息学方法理论分析不同地区来源的SARS冠状病毒(SARSCoV)推断N蛋白的基因组与氨基酸序列的差异及分子生物学特征以及基因突变对蛋白结构功能的影响。方法:针对GenBank上发布的来自不同国家地区的15条SARSCoV基因组序列,采用生物信息学软件分析其推测N蛋白的CDS和氨基酸序列,分别找出突变位点并预测其等电点及功能结构域。结果:SARSCoV推测N蛋白基因组序列存在5个变异位点导致蛋白序列有4个位点发生突变。在该蛋白上发现四个有意义的低成分复杂性区域;未发现卷曲螺旋、跨膜螺旋和信号肽序列。基因突变造成4条序列在功能位点数量上减少,但未影响抗原决定簇。预测发现两个保守的Domain和一个丝氨酸富集区。结论:不同地区来源的15条推测N蛋白序列的变异很少。基因突变导致部分序列功能位点数量发生改变,但未影响抗原决定簇的数量。     

鼠冠状病毒核衣壳蛋白的抗体制备与抗原决定簇分析

核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白有稳定病毒基因组、调控病毒复制及细胞状态的特殊作用。鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus,MHV)为乙型冠状病毒属的原型病毒,是研究冠状病毒N蛋白功能的经典模型。本研究用去污剂处理鼠冠状病毒粒子暴露N蛋白,另用原核表达纯化的重组N蛋白分别免疫小鼠,制备多克隆及单克隆抗体。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和蛋白免疫印迹分析结果显示两类抗体均具有高灵敏度和特异度,与甲型冠状病毒猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的N蛋白无交叉反应。原核表达缺失突变的N蛋白分析结果显示,多克隆抗体与单克隆抗体2E6识别的鼠冠状病毒N蛋白抗原决定簇完全一致,位于N端结构域(N-terminal domain,NTD)C端与SR之间的58个氨基酸残基内。此外,基于单克隆抗体2E6的ELISA及免疫荧光法能检测到感染细胞中和培养上清液中的N蛋白组分,且其含量与病毒复制的滴度一致。这些结果表明,鼠冠状病毒复制过程中粒子与细胞中的N蛋白可能维持相似的结构,使NTD与SR之间的部分氨基酸残基一直暴露在表面,从而形成了优势抗原决定簇。     

发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白特异结合宿主细胞60kD SSA/Ro

为了初步探索发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)核蛋白(nucleoprotein,NP)对宿主细胞免疫功能的影响。将SFTSV NP和NSs蛋白的编码基因插入真核表达载体VR1012中,通过免疫共沉淀(IP)、SDS-PAGE、质谱检测及蛋白质免疫印迹等方法寻找宿主细胞中与NP相互作用,同时又与免疫功能有关的蛋白质分子,并利用细胞免疫荧光方法检测SFTSV NP与该分子在细胞中的共定位情况。IP和质谱检测结果显示NP能与免疫功能相关的60kD SSA/Ro蛋白发生特异性结合,细胞免疫荧光试验进一步显示NP与60kD SSA/Ro蛋白在细胞质中存在共定位。提示SFTSV可能通过其核蛋白与免疫相关分子60kD SSA/Ro蛋白发生特异性结合,从而引起机体一系列的免疫反应和临床症状。     

发热伴血小板减少综合征病毒灭活病毒的纯化及免疫原性初步研究

为了解纯化后灭活发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)的免疫原性,本研究通过超滤浓缩和分子筛层析相结合的方法对灭活的SFTSV进行纯化,采用Western blot和SDS-PAGE对灭活病毒的纯化样品进行分析和鉴定,采用双抗夹心ELISA方法对其中糖蛋白(Glycoprotein,GP)和核蛋白(Nucleoprotein,NP)的抗原含量进行检测。浓缩纯化的SFTSV灭活病毒,经电镜观察并通过BCA法测定其总蛋白浓度。然后,将纯化的灭活SFTSV按两种不同的免疫程序免疫新西兰兔,评价免疫原性和比较免疫效果。结果显示,SFTSV灭活并超滤浓缩后,分子筛层析可观察到两个洗脱峰,其中之一为灭活病毒颗粒,SDS-PAGE、Western blot和ELISA法分析均可检测到GP和NP抗原,而另一洗脱峰主要成分则为NP。浓缩后的纯化病毒纯度达90%以上,总蛋白浓度约为1.1mg/mL,且具有典型的布尼亚病毒电镜形态。纯化的SFTSV灭活病毒免疫实验动物后,可在血清中检出高滴度病毒特异性IgG和中和抗体,但抗体滴度受免疫程序的影响,0d、14d和28d天三针程序免疫动物的效果明显优于0d、7d和28d免疫程序组。本研究显示了灭活SFTSV培养液中除完整病毒颗粒外,还含有大量游离的NP,经分子筛层析纯化可获得高纯度灭活病毒,同时明确了纯化的SFTSV灭活病毒具有良好的免疫原性,可诱导产生高滴度中和抗体和病毒特异IgG抗体,可为灭活病毒疫苗的进一步研究提供重要的线索。     

EB病毒潜伏膜蛋白1的B细胞表位预测

目的 预测EB病毒潜伏膜蛋白1(Latent Membrane Protein 1,LMPl)的B细胞表位.方法 基于EB病毒基因组序列,采用DNAStar Lasergene软件包中的Protean软件,对LMP1的亲水性,表面可能性,抗原指数及其二级结构中的柔性区域进行分析,并结合吴玉章的抗原指数预测法预测其B细胞表位.结果 B细胞表位最有可能位于潜伏膜蛋白N端第356-358,2-19,249-314区段或其附近,而潜伏膜蛋白N端第185-223区段内或附近也可能存在B细胞表位.结论 用多参数预测EB病毒LMP1的B细胞表位,为鼻咽癌的筛查及抗肿瘤转移靶向治疗的分子免疫学研究奠定基础.     

SARS-CoV-2 N蛋白不同片段制备及其在荧光层析中的应用

表达纯化新型冠状病毒核衣壳 (N) 蛋白不同片段,建立新冠病毒总抗体荧光免疫层析方法并评价不同蛋白片段对该方法的影响。利用生物信息学技术对N蛋白序列进行分析、合成及原核表达、纯化,制备不同N蛋白片段;采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺 (1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC) 法荧光微球偶联抗原建立夹心荧光层析抗体检测方法,并分别进行性能评价。在制备的4个N蛋白片段中优选出全长N蛋白 (N419) 包被,N412加入0.5 mol/L NaCl进行标记作为最优组合;删掉N抗原N端第91–120位氨基酸 (N412) 可减少87.5%的非特异性干扰;线性范围为0.312–80 U/L,最低检出限为0.165 U/L,准确度在95%以上。优选配对N蛋白片段建立的新冠病毒总抗体荧光免疫层析检测方法,与广州万孚试纸条对比总符合率为98%,有望用于新型冠状病毒的辅助检测,同时为新冠抗体检测试剂性能的提升提供实验依据和借鉴。     

SARS冠状病毒E、M基因序列比较及B细胞抗原表位预测

为了比较SARS冠状病毒分离株E、M基因序列及氨基酸序列之间的差异,分析E、M蛋白的可能B细胞抗原表位。利用Lasergene软件包中的Editseq将E、M基因从SARS-CoV全基因序列中截取出,再翻译成氨基酸序列,用Clustal X软件分析它们之间的异同,然后利用Protean软件进行氨基酸序列分析,预测E、M蛋白的B细胞抗原表位。结果证明SAPS-CoV的E、M基因序列相当保守,变异甚少,并分别预测出E、M蛋白有2段和7段可能为B细胞抗原表位。     

兼职蛋白热休克蛋白70与α-烯醇酶的人B细胞表位肽预测及其瓜氨酸化的血清学检定

目的 筛选与自身免疫病相关兼职蛋白的B细胞优势表位肽并进行血清学检定.方法 利用DNAMAN软件分析不同物种热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)和α-烯醇酶氨基酸序列同源性,IEDB数据库和瓜氨酸化在线平台预测线性B细胞表位和瓜氨酸化修饰位点;间接ELISA检测抗HSP70和α-烯醇...     

乙型肝炎病毒表面抗原多肽图谱与亚型关系

用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western吸印法分析乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)多肽组成,与蛋白标准品比较获得分子量23000～50000 8种多肽,用单一抗各亚型因子血清分析,证实a抗原决定簇存在于多种多肽中,d抗原决定簇主要由分子量23000的多肽组成,而y抗原决定簇则由分子量31000及34000的两种多肽组成。     

A(H3N2)亚型流感病毒血凝素基因特性及蛋白结构分析,以南宁市2009～2012年为研究案例

利用生物信息学软件和数据库研究南宁市2009~2012年度A(H3N2)亚型流感病HA基因的遗传变异规律及蛋白结构变化。通过RT-PCR扩增H3N2病毒HA基因并测序,同源比对统计毒株氨基酸位点的差异、构建系统进化树分析进化规律和同源建模分析蛋白结构的变化。系统进化树表明53株HA基因序列被分为4个类群,呈多侧支流行;所有毒株的二硫键和受体结合位点(RBS)高度保守;部分毒株HA在第45位点增加一个糖基化位点,在第144位点丢失一个糖基化位点;HA抗原决定簇氨基酸累计有30个位点发生变异,涉及5个抗原决定簇;HA晶体结构分析抗原决定簇突变位点主要发生在无规则卷曲处,大多数替换的氨基酸种类和性质相同或相似。南宁市A(H3N2)亚型流感病毒株变异活跃,2012年A(H3N2)亚型流感病毒与当年WHO推荐的疫苗株具有较远的进化距离,多数毒株具备了形成新变种的条件,是否形成新的流行株,有待深入研究。     

六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白抗原性初步研究

初步研究六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白(Nucleocapsid protein,NP)抗原的抗原性,为开发相应的血清学诊断试剂提供理论依据。利用原核表达系统表达纯化六种致病性白蛉病毒核蛋白,并分别免疫新西兰白兔。通过间接ELISA方法及Western-blotting方法对所获得的兔免疫血清进行交叉反应检测,确定其抗体ELISA滴度。此外,分别用上述六种致病性白蛉病毒NP抗原包被ELISA反应板并对发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)病人血清进行间接ELISA检测,确定其血清学交叉反应及IgG抗体滴度。通过原核表达系统表达并纯化的六种白蛉病毒NP抗原浓度及纯度均达到免疫和检测要求。ELISA及Western-blotting检测结果显示六种病毒NP抗原兔免疫血清中的每种血清与其余五种病毒NP抗原可能存在血清学交叉反应。SFTSV病人血清与除SFTSV-NP以外的五种NP抗原亦可能存在部分交叉反应。本研究初步评价了原核表达的六种致病性白蛉病毒核蛋白的抗原性和免疫反应性,为相应诊断试剂的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv0081基因编码蛋白的生物信息学分析

运用生物信息学分析软件预测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）Rv0081蛋白的生物学特征及筛选潜在的优势抗原表位。 从NCBI数据库获取Mtb Rv0081蛋白的氨基酸序列，利用生物信息学分析软件ProtParam、ProtScale及TMPRED分析Rv0081蛋白的理化性质及亲疏水性；TMHMM、SignalP-5.0 Server预测蛋白的跨膜区及信号肽；NetNGlyc-1.0 Server、NetPhos 3.1 Server分别预测蛋白的糖基化位点及磷酸化位点；STRING预测能与Rv0081相互作用的蛋白；分别运用SOPMA、SWISS-MODEL预测蛋白的二、三级结构；综合运用softberry、WoLF PSORT预测蛋白的亚细胞定位；运用DNAStar预测蛋白的B细胞抗原表位；综合运用SYFPEITHI、NetCTL 1.2 Server、Net MHC pan 4.1 server预测蛋白的CTL细胞抗原表位；综合运用SYFPEITHI、Net MHCII pan 4.0 server预测蛋白的Th细胞抗原表位。 结果表明，Rv0081蛋白由114个氨基酸组成，相对分子质量为12 356.32，亚细胞定位于细胞质中，为稳定的疏水性蛋白，无跨膜区和信号肽，含有1个糖基化位点及9个磷酸化位点；二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成，结构较松散；与hycE、hycP、Rv0088、Rv0083、hycD、hycQ、Rv0082、devR、Rv0080及Rv0079蛋白存在相互作用关系；综合分析各软件预测结果筛选出6个优势B细胞抗原表位、6个优势CTL细胞抗原表位及7个优势Th细胞抗原表位。Mtb Rv0081蛋白具有较多潜在的候选B、T细胞抗原表位，可作为研发新型结核疫苗的候选抗原。