基于MS2噬菌体病毒样颗粒的RT-PCR检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)质控品制备*

目的: 制备热稳定性好、耐RNase攻击及可全程监控操作的核酸检测新型冠状病毒阳性质控品。方法: 分别扩增MS2噬菌体外壳蛋白CP(含PAC位点)基因以及成熟酶蛋白A基因序列(含核糖体结合位点),先后插入质粒pET28a多克隆位点不同位置,构建通用重组载体pET28a/CP-A。合成包含ORF1ab基因、N基因和E基因三个靶标的特定核酸序列,插入到重组载体pET28a/CP-A中PAC位点的下游,构建包含靶序列的重组载体pET28a/CP-A/S。通过原核表达系统表达目的蛋白,采用硫酸铵和凝胶过滤层析进行纯化,利用透射电镜和动态光散射对蛋白质进行物理表征。全能核酸酶消化形成的盔甲RNA,通过RT-PCR检测其残余核酸和热稳定性。结果: 成功构建包含MS2噬菌体外壳蛋白CP基因、成熟酶蛋白A基因和外源靶核酸的重组载体,目的蛋白在25℃、IPTG 0.3mmol /L、诱导14h时以可溶性形式得到高效表达,纯化后,得到了大小均一、直径为23~28nm的病毒样颗粒,经核酸酶消化后RT-PCR检测,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的盔甲RNA。加速破坏试验表明该盔甲RNA无菌过滤后可在37℃稳定保持10天。结论: 在体外,利用MS2噬菌体外壳蛋白和成熟酶蛋白自组装包封外源靶序列制备的盔甲RNA,其热稳定性好,可全程监控整个检测过程,可作为核酸检测SARS-CoV-2的定性或定量质控品。     

基于MS2噬菌体病毒样颗粒的RT-PCR检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)质控品制备*

目的: 制备热稳定性好、耐RNase攻击及可全程监控操作的核酸检测新型冠状病毒阳性质控品。方法: 分别扩增MS2噬菌体外壳蛋白CP(含PAC位点)基因以及成熟酶蛋白A基因序列(含核糖体结合位点),先后插入质粒pET28a多克隆位点不同位置,构建通用重组载体pET28a/CP-A。合成包含ORF1ab基因、N基因和E基因三个靶标的特定核酸序列,插入到重组载体pET28a/CP-A中PAC位点的下游,构建包含靶序列的重组载体pET28a/CP-A/S。通过原核表达系统表达目的蛋白,采用硫酸铵和凝胶过滤层析进行纯化,利用透射电镜和动态光散射对蛋白质进行物理表征。全能核酸酶消化形成的盔甲RNA,通过RT-PCR检测其残余核酸和热稳定性。结果: 成功构建包含MS2噬菌体外壳蛋白CP基因、成熟酶蛋白A基因和外源靶核酸的重组载体,目的蛋白在25℃、IPTG 0.3mmol /L、诱导14h时以可溶性形式得到高效表达,纯化后,得到了大小均一、直径为23~28nm的病毒样颗粒,经核酸酶消化后RT-PCR检测,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的盔甲RNA。加速破坏试验表明该盔甲RNA无菌过滤后可在37℃稳定保持10天。结论: 在体外,利用MS2噬菌体外壳蛋白和成熟酶蛋白自组装包封外源靶序列制备的盔甲RNA,其热稳定性好,可全程监控整个检测过程,可作为核酸检测SARS-CoV-2的定性或定量质控品。     

含口蹄疫病毒IRES RNA病毒样颗粒表达载体的构建

利用PCR技术扩增大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,将其克隆到pET32a中构建中间载体pET32a-CP。将FMDV的内部核糖体结合位点（IRES）保守序列连接到中间载体噬菌体基因的下游,构建原核表达载体pCPES。将重组质粒pCPES转化宿主菌BL21(DE3),1 mmol/L IPTG诱导表达。蔗糖密度梯度离心纯化表达产物。透射电镜观察到直径大约26 nm的圆形病毒样颗粒。检测病毒样颗粒的稳定性并进行RT-PCR鉴定。结果表明该病毒样颗粒含口蹄疫病毒IRES RNA序列,并且稳定性良好,本研究构建的病毒样颗粒可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品使用。     

MS2噬菌体衣壳蛋白与包装位点结合特异性及其生物学应用进展

MS2噬菌体为正义单链RNA噬菌体,基因组含有3569个核苷酸,编码成熟酶蛋白、衣壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白。MS2噬菌体复制酶编码基因5'端一个由19个碱基组成的茎环结构(又称包装位点)是衣壳蛋白二聚体与RNA相互作用的部位,二者相互作用形成的复合物是启动噬菌体自我包装的信号。MS2噬菌体衣壳蛋白与包装位点结合的特异性已被应用于RNA病毒核酸检测的标准物质、校准品和质控品的研究,实时动态监测活细胞内RNA的运动,以及RNA体内递送载体的研究等领域。     

戊型肝炎病毒Ⅳ型ORF2蛋白在汉逊酵母中的表达

为了寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗,利用甲基营养型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)系统表达戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)Ⅳ型结构区ORF2编码蛋白第112-607氨基酸片段。为实现目的基因在汉逊酵母中的高效表达,根据汉逊酵母偏爱密码子优化设计目的基因,用搭桥PCR法合成优化后的基因序列,并克隆到多拷贝表达载体上,转化汉逊酵母营养缺陷宿主菌ATCC26012(Ura3-),在选择培养基上培养,运用PCR法筛选得到携带外源基因的重组菌株,然后用含甲醇的培养基诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE、ELISA和Westernblot检测和鉴定。SDS-PAGE实验结果表明目的蛋白分子量约为56kD,表达量占菌体总蛋白的12%;ELISA检测结果表明表达产物为具有免疫反应性的HEVORF2蛋白,ELISA效价最高可达1∶2048,目的蛋白表达量随着基因拷贝数的增加呈升高的趋势;Westernblot鉴别实验结果证实表达产物与HEV多抗有特异性抗原抗体结合反应。HEV结构区ORF2蛋白在汉逊酵母中的成功表达,为研制基因工程戊型肝炎疫苗奠定了基础。     

猪瘟病毒衣壳蛋白靶向核酸酶表达系统的建立及鉴定

根据猪瘟病毒衣壳蛋白(C)基因序列设计一对引物,RT-PCR扩增获得编码猪瘟病毒衣壳蛋白的C基因,将其插入到含有葡萄球菌核酸酶(SN)基因的真核表达载体pcDNA-SN中,筛选获得重组质粒pcDNA-C-SN。脂质体转染猪肾细胞(PK-15),并经G418稳定筛选,通过RT-PCR、免疫印迹和间接免疫荧光鉴定表达的融合蛋白,体外DNA消化试验检测核酸酶活性。结果表明融合蛋白C-SN在PK-15细胞中获得了稳定表达,能够被兔抗猪瘟病毒衣壳蛋白多抗所识别,并具有良好的核酸酶活性,能够对DNA进行切割。同时,稳定表达融合蛋白C-SN的PK-15细胞系中能够有效抑制猪瘟野毒的增殖,使其感染性降低102～103倍。这些结果为进一步将衣壳蛋白靶向病毒灭活策略应用于抵抗猪瘟病毒感染奠定了基础。     

RGD序列修饰的MS2噬菌体样颗粒的构建及表达

目的:构建并表达衣壳蛋白表面展示有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的MS2噬菌体样颗粒,以期获得肿瘤细胞靶向性RNA递送载体。方法:用分子克隆技术将RGD4C编码序列插入MS2衣壳蛋白编码基因,然后构建到p ETDuet-1质粒多克隆位点MCS1上;将含有MS2噬菌体包装位点的pre-let-7编码基因构建到p ETDuet-1质粒多克隆位点MCS2上;重组质粒转化大肠杆菌,表达产物纯化后经琼脂糖凝胶电泳、电子显微镜鉴定。结果和结论:采用分子克隆技术和原核细胞单质粒双表达系统获得表面展示有RGD序列,内部包装有pre-let-7 RNA的MS2噬菌体样颗粒,为体内和体外研究其肿瘤细胞靶向递送和功能奠定了基础。     

携带EGFP基因的戊型肝炎病毒重组质粒的构建及其感染性的验证

为了构建携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组质粒,转染人肺癌细胞A549细胞验证其感染性,PCR法分两段扩增HEV全基因组序列和EGFP基因序列,将EGFP报告基因插入到HEV ORF2基因下游,并克隆到体外转录表达载体pGEM-7Zf(+)上。然后利用脂质体转染法将重组质粒转入A549细胞,24h后在荧光显微镜下观察EGFP的表达;转染72h后,利用免疫荧光法检测HEV ORF2蛋白的表达。转染7d后将发生病变的A549细胞收集作为接种物,接种A549细胞验证携带EGFP的HEV-EGFP重组病毒的感染性。结果显示经酶切和测序鉴定携带EGFP的HEV重组表达质粒pGEM-HEV-EGFP构建成功;EGFP基因与HEV在A549细胞中可融合表达;携带EGFP的HEV重组表达质粒转染A549细胞7d后出现病变,并且连续传代3代仍具有感染性。本研究成功构建了携带EGFP的HEV全基因组重组质粒pGEM-HEV-EGFP,并成功感染A549细胞,为进一步研究HEV的复制机制及致病机理奠定基础。     

猪盖他病毒衣壳蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

原核表达猪盖他病毒(Getah virus)衣壳蛋白(Cap)并制备多克隆抗体。设计一对特异性引物,从含有Cap基因的pT-Cap质粒中扩增全长Cap基因,克隆至携带有His标签的原核表达载体pColdⅠ中,通过PCR、酶切鉴定和序列测定后,重组质粒pCold-Cap转化大肠杆菌Rosetta 2,IPTG诱导后SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白;蛋白经镍柱纯化后切胶免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体。实验表明:经终浓度0.1mmol/L IPTG 15℃诱导24h后,Cap基因在Rosetta 2中获得高效表达,表达量占菌体蛋白的40.2%,SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量为32.3kD。Western blot显示制备的鼠源抗血清可以与融合蛋白发生反应,有明显的特异性条带。猪盖他病毒衣壳蛋白原核表达成功,制备的多抗可以识别Cap蛋白。     

大学新生戊型肝炎病毒现/近期隐性感染的筛查

为了解大学新生戊型肝炎病毒(HEV)现/近期隐性感染的状况,探讨引起隐性感染与急性戊型肝炎(HE)的HEV毒株间有无差异,本实验利用ELISA一步法检测了正常大学新生血清标本中抗-HEV IgM,对抗-HEV IgM阳性者检测抗-HEV IgG,并进行HEV逆转录-巢式PCR(RT-nPCR). 结果2223份血清中抗-HEV IgM阳性18份,阳性率0.8%,P/N值在2.0~3.0之间.17份标本抗-HEV IgM、IgG同时阳性,1份抗-HEV IgM单独阳性,但用RT-nPCR检测抗-HEV IgM阳性标本, HEV RNA均阴性.提示正常大学新生中存在HEV现/近期隐性感染,应注意感染者作为传染源的可能性;HEV隐性感染时,产生的抗体滴度或亲和力较低,病毒血症时间短,病毒滴度低,或毒株的基因序列与引起急性HE的毒株的序列有一定差异.     

呼肠病毒BYD株吸附蛋白σ1的原核表达及其抗原性鉴定

将呼肠病毒BYD株S1片段编码的细胞吸附蛋白基因连接至pET-28a( ),构建表达载体pET-28a( )-S1,转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3),分析表达载体能否表达预期大小的重组σ1,并进一步鉴定重组σ1的抗原性。SDS-PAGE实验表明,经IPTG诱导后,表达载体能表达53kD左右蛋白质,与重组σ1的预期大小相符;免疫印迹分析表明重组σ1有较好的抗原性和特异性,可用于呼肠病毒诊断试剂的制备。     

HPV16 L2肽段偶联AP205 VLP的原核表达及免疫原性分析

目的:将编码HPV16衣壳蛋白L2的65～71、112～120免疫优势表位连接到RNA噬菌体衣壳蛋白AP205氮端,组装形成病毒样颗粒,通过在大肠杆菌中实现表达及纯化,对其免疫原性进行研究。方法:合成编码AP205衣壳蛋白基因和HPV16 L2的65～71、112～120位氨基酸表位的基因序列,PCR连接并克隆至pET30a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET30-AP205-HPV16ΔL2,转化大肠杆菌BL21(DH3)感受态细胞,IPTG诱导表达。表达蛋白经凝胶层析纯化及SDS-PAGE、Western blot等理化性质检测,免疫接种ICR小鼠,通过间接ELISA法检测其免疫原性。结果:成功构建重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性表达,透射电镜观察可见典型病毒样颗粒,该VLP在动物实验中表现出较好的免疫原性。结论:成功将HPV16 L2表位偶联AP205以形成VLP,在大肠杆菌中实现可溶性表达。     

基于Qβ噬菌体的甲肝病毒装甲RNA标准参考样品的研制

【背景】目前食品中甲肝病毒分子的检测缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,影响了检测结果的科学性与准确性。【目的】基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含甲肝病毒检测靶标的装甲RNA (Hepatitis A virus armored RNA,AR-HAV),并开展初步定值、均匀性、稳定性研究,为HAV分子检测提供标准参考样品。【方法】人工合成包含Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、HAV检测靶标cDNA序列的核酸片段QGBHAV,并亚克隆到pET-28a(+)中构建重组质粒pET-QGBHAV,转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,利用超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析柱纯化AR-HAV后电镜观察。通过实时荧光RT-PCR对AR-HAV进行初步定值及均匀性和稳定性研究。【结果】SDS-PAGE结果表明重组质粒在大肠杆菌中有约14.1 kD的目的蛋白表达;纯化后的AR-HAV无杂蛋白和残留质粒;电镜下可见结构完整、大小约为25nm的病毒样颗粒;定值结果显示,AR-HAV中检测靶标RNA的含量为(2.57±0.12)×107 copies/μL;均匀性分析结果为F=1.23F0.05 (9,20),证实AR-HAV的均匀性良好;稳定性结果表明,AR-HAV在可37°C保存9 d,25°C保存25 d,4°C保存40 d,-20°C保存180 d,-80°C至少保存360 d。【结论】基于Qβ噬菌体制备的AR-HAV拷贝数高,具有良好的均匀性和稳定性,可为HAV的分子检测提供安全、稳定的标准参考样品。     

装载RNA"病毒样"纳米颗粒表面巯基化表达载体的构建及荧光修饰

以本实验室构建的能够装载外源RNA片段的MS2噬菌体“病毒样”颗粒表达载体为基础,利用定点突变技术将衣壳蛋白基因的第15位密码子由编码苏氨酸突变为胱氨酸。表达产物在35％蔗糖密度梯度处有一目的产物,目的产物在透射电镜下呈球形,直径大小约为27nm。用马来酰亚胺-5’-荧光素对表达产物进行化学修饰,经光谱分析、SDS-PAGE分析和MALDI-TOF MS鉴定,证明巯基在表达产物的外表面,并能与马来酰亚胺-5＇-荧光素进行反应。这种携带外源RNA片段的荧光修饰的天然纳米颗粒为制备各种功能性纳米材料提供了新途径。     

含组氨酸标签的甲/乙型流感嵌合体假病毒颗粒的构建和表达

为了获得内含甲/乙型流感病毒部分序列的病毒样颗粒,本研究通过定点突变技术将6个组氨酸插入MS2噬菌体包膜蛋白的β-发夹环结构中,建立通用表达载体D-pET32a-CP-his。并采用聚合酶链反应扩增甲/乙流病毒cDNA的部分保守区域,将两种病毒的嵌合体基因序列连接到表达载体,转化BL21细胞。经诱导表达和镍柱亲和层析纯化,获得了含有甲/乙型流感病毒部分序列的高浓度和纯度的病毒样颗粒。该病毒样颗粒在4℃和-20℃条件下可稳定保存。本研究构建带有组氨酸纯化标签假病毒的通用表达载体,可以作为以后构建和制备耐RNase的mRNA标准品和质控品的平台;构建的甲/乙型流感嵌合体假病毒可为实验室流感病毒的检测提供新的标准品及质控品。     

猪流行性腹泻病毒S基因片段的克隆及原核表达

为研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus PEDV)S基因片段的原核表达产物是否具有抗原性,分析S基因抗原位点后,用PCR技术扩增S蛋白主要抗原区的核酸序列,经克隆后将目的片段连接到原核表达载体pET-28a(+)中,成功构建了重组质粒pET-28a-PEDV-Sp,其重组菌于37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导表达4 h后进行SDS-PAGE分析,在分子质量约为29 kDa处出现一新蛋白带,与预期相符。质谱鉴定表明,已成功表达了目的蛋白。纯化后的重组蛋白免疫兔制备多克隆抗体,抗体效价检测结果显示该蛋白具有良好的抗原性。该研究为猪流行性腹泻基因工程疫苗的研制奠定基础。     

登革病毒衣壳蛋白靶向核酸酶表达系统的建立及应用

根据登革 2型病毒衣壳蛋白C基因和葡萄球菌核酸酶SN基因序列设计引物 ,从构建的原核表达载体pLEX D2C SN中扩增获得编码登革病毒衣壳蛋白和葡萄球菌核酸酶的融合基因D2C SN ,将其插入到真核表达载体pcDNA6 V5 His中 ,筛选获得重组质粒pcDNA D2C SN .电穿孔转染BHK细胞后 ,5mg Lblasticidin压力筛选 ,通过RT PCR、间接免疫荧光和免疫印迹鉴定表达的蛋白 ,体外DNA消化试验检测核酸酶活性 .结果表明 ,融合蛋白D2C SN在BHK细胞中获得了稳定表达 ,表达的融合蛋白能够被抗登革病毒衣壳蛋白的单克隆抗体特异识别 ,并具有良好的核酸酶活性 ,能够对DNA进行切割 .同时 ,BHK细胞中稳定表达的融合蛋白D2C SN能够有效抑制登革病毒的增殖 ,使其感染性降低 10 3 ～ 10 4倍 .这些结果为进一步将衣壳蛋白靶向病毒灭活策略应用于人类抗登革病毒感染奠定了基础     

小反刍兽疫病毒Ｍ基因的截短表达及 多抗血清的制备

目的截短表达小反刍兽疫病毒M蛋白基因并将其用于多抗血清的制备。方法之前有研究未能表达完整的M蛋白,而若在抗原性较弱的区域将其一分为二,以截短的形式进行表达,却能达到较理想的水平。因此根据GenBank上公布的PPRV M基因的序列,设计1对特异性引物,扩增出480bp的目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,得到重组表达质粒pET-32a-PPRV-M1,后转化至Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blot试验对重组蛋白进行鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清。结果经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明截短的M基因的蛋白主要以包涵体形式高效表达并具有良好的反应原性。结论成功克隆表达了截短的小反刍兽疫病毒M基因的蛋白并制备了多抗血清,为建立血清学相关的检测方法及临床治疗奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒M基因的截短表达及多抗血清的制备

目的截短表达小反刍兽疫病毒M蛋白基因并将其用于多抗血清的制备。方法之前有研究未能表达完整的M蛋白,而若在抗原性较弱的区域将其一分为二,以截短的形式进行表达,却能达到较理想的水平。因此根据GenBank上公布的PPRV M基因的序列,设计1对特异性引物,扩增出480bp的目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,得到重组表达质粒pET-32a-PPRV-M1,后转化至Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blot试验对重组蛋白进行鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清。结果经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明截短的M基因的蛋白主要以包涵体形式高效表达并具有良好的反应原性。结论成功克隆表达了截短的小反刍兽疫病毒M基因的蛋白并制备了多抗血清,为建立血清学相关的检测方法及临床治疗奠定了基础。     

新型多价大肠埃希菌噬菌体285P生物学特性研究

筛选多价大肠埃希菌噬菌体,确定其宽噬宿主谱、形态大小及核酸类型等基本特征,为应用于环境微生物消毒奠定基础。应用双层琼脂平板法确定多价噬菌体的宿主谱;透视电镜观察形态结构;提取核酸,并利用分光光度法和核酸酶(DNase、RNase A及S1)酶切的方法对核酸进行鉴定;SDS-PAGE电泳分析噬菌体膜蛋白。大肠埃希菌BL21、DH5α、JM109为噬菌体285P的宽噬宿主;电镜下呈微球型,边缘光滑,短尾,颗粒直径约81 nm;分光光度法及核酸酶切法均证实核酸为双链DNA;膜蛋白略小于43 ku。噬菌体285P对多株大肠埃希菌具有宽噬作用,对环境中微生物的控制具有潜在的应用价值。