卷曲螺旋结构蛋白8(CCDC8)功能研究进展

卷曲螺旋结构蛋白8(coiled-coil domain containing 8,CCDC8)是一个由CCDC8基因编码目前功能未知的蛋白质。已有的证据表明,CCDC8是一个膜蛋白,与细胞骨架蛋白Obsl1(Obscurin-like protein1)、泛素E3连接酶Cul7(Cullin 7)在一个信号通路。CCDC8、Obsl1或者Cul7基因突变可以引起身材矮小的3-M综合征(3M syndrome)。CCDC8与锚蛋白ANKRA2(ankyrin-repeat family A protein 2)、p53通路相关的细胞凋亡有关;CCDC8与乳腺癌、肺癌等癌症有关;CCDC8还可与艾滋病毒(HIV-1)结构蛋白Gag相互作用,诱导Gag的内化、多泛素化和降解。     

马传染性贫血病毒Gag p9蛋白功能研究进展

对病毒复制机制研究的一个重要方面是病毒的组装和从细胞表面出芽。过去的 2 0年大量研究证实反转录病毒Gag蛋白对病毒的组装和出芽起着决定性作用。Gag蛋白的多个功能域已经被证明在病毒组装的不同时期发挥作用。马传染性贫血病毒 (equineinfectiousanemiavirus,EIAV)p9是Gag蛋白C端的一个小蛋白 ,在其之上的L域是与病毒释放直接相关的蛋白功能区域 ,L域的核心基序YPDL可与特异的病毒或细胞蛋白相互作用共同介导病毒粒子的组装和出芽作用 ,核心基序YPDL对病毒的复制能力有一定的影响。就近年来对p9功能区与病毒组装和释放关系的研究进展进行综述。     

泡沫病毒Gag蛋白的研究进展

Gag蛋白在逆转录病毒复制周期的许多阶段中发挥重要作用。泡沫病毒基因组结构与其它逆转录病毒类似,但它们的基因组成分和生活周期存在明显差异,这在一定程度上是由其Gag蛋白的结构和功能所决定的。本文对18种不同株型的泡沫病毒gag基因序列进行进化树分析,探究不同来源的泡沫病毒的亲缘关系;并以典型的原型泡沫病毒为代表,阐述泡沫病毒Gag蛋白的结构和功能以及对病毒复制不同阶段的影响。     

HIV-1 Gag多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的抗体制备

旨在通过构建Gag的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达,为HIV诊断及可能的疫苗制备提供试验基础。选定HIV-1 Gag基因中3个片段包含较多抗原表位的区域,设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这3个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性,SDS-PAGE和Western blotting测定融合蛋白的表达,并免疫动物制备相应抗体。结果显示,构建的HIV-1 Gag多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长576bp。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白分子量为27kD,以包涵体的形式存在。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体IgG。ELISA和免疫荧光方法检测显示制备的多克隆抗体能具有特异性反应。成功构建和高表达了HIV-1 Gag多表位融合蛋白,纯化蛋白制备的抗体与HIV-1Gag有特异性结合。为进一步研究HIV-1奠定了试验基础。     

HIV-1结构蛋白在重组痘苗病毒中的高效表达研究

HIV-1粒子中含有3类结构蛋白,即核心蛋白(Gag)、聚合酶(pol)和外膜蛋白(Env)。Gag蛋白既具有诱导体液免疫和细胞免疫的抗原决定簇,又能够自我装配成病毒样粒子     

HIV-1 Gag p17-p24在痘苗病毒中的表达及性质研究

研究了重组痘苗病毒表达的HIV-1核心蛋白(Gag)p17-p24蛋白的一些生物学及免疫学特点。间接免疫荧光、Dot ELISA及Western blot结果表明,构建的两株重组病毒分别表达了HIV-1 Gag p24及p17-p24融合蛋白。电镜观察证实,Gag p24及p17-24重组蛋白均可形成病毒样粒子。重组病毒可诱导小鼠产生抗HIV-1 Gag p24抗体。重组病毒感染BHK21细胞后,可见由于细胞凋亡而致的染色体DNA断裂“梯子”电泳图。     

HIV-1 Gag蛋白在大肠杆菌表达系统中诱导和纯化条件的优化

为探讨诱导温度对于HIV-1 Gag在大肠杆菌中表达产物状态以及尿素浓度对蛋白纯化效果的影响, 将30oC和37oC诱导表达的包涵体分别溶于不同浓度的尿素, 比较溶解性的差异, 并比较复性的不同。将30oC诱导的目的蛋白分别用2 mol/L和8 mol/L尿素溶解后做层析分离, 比较两者的分离效果。结果发现, 与37oC相比, 30oC诱导表达的蛋白能有效溶于低浓度尿素, 并且更容易复性。与8 mol/L尿素溶解相比, 30oC诱导的包涵体用2 mol/L尿素溶解后通过凝胶过滤和离子交换层析纯化能得到更好的分离效果。这提示低温诱导的Gag包涵体中可能含有更多类似天然态构象的蛋白, 而低浓度尿素有利于保持包涵体中蛋白的天然态构象。从而为包涵体蛋白的诱导表达和分离纯化提供了参考。     

重组痘苗病毒表达人免疫缺陷病毒中国株B'亚型Gag蛋白及免疫效果观察

为筛选用于我国HIV疫苗的候选基因,利用痘苗病毒载体构建表达HIV-1 B′亚型中国流行株RL42的Gag蛋白的重组病毒rVV-RL42gag,并免疫BALB/c小鼠,检测其诱导的特异性抗体及中和抗体,同时检测其诱导的特异性CTL及与中国流行株C(B′/C重组)亚型和国际流行株A亚型之间的CTL交叉反应.结果显示:重组病毒能很好地表达Gag蛋白,它具有与7株单克隆抗体结合的抗体表位;电镜下可观察到Gag蛋白形成的颗粒.rVV-RL42gag免疫小鼠后能诱导产生高滴度的特异性抗体和CTL,抗体具一定的中和活性,且检测到与C(B′/C重组)亚型和国际流行株A亚型之间的CTL交叉反应.这些结果表明,rVV-RL42gag具有良好的免疫原性,可进一步构建表达HIV B′亚型中国流行株RL42的Gag蛋白的重组痘苗病毒作为候选疫苗.     

多种HIVB′/C亚型基因在复制型DNA疫苗中表达及免疫效果研究

为了解多种HIVB′/C亚型基因在复制型DNA疫苗中表达水平及对免疫效果影响,使用复制型DNA疫苗载体pSCK2,分别构建了7种含单种或多种HIVB′/C亚型基因gagpol、gp160和rtn(rev、tat和nef融合基因)的DNA疫苗质粒。免疫荧光检测表明,Gag、Gp160、Rev、Tat和Nef蛋白均能从相应7种DNA疫苗中表达,单基因表达质粒中的基因表达水平和双基因表达质粒中IRES上游的基因表达水平普遍较好。小鼠免疫后,Gag能诱发较高的抗体滴度,Gp160、Pol和RTN的抗体滴度很低;比较研究显示,Gag单独表达和Gag与RTN双表达的质粒均能诱发较好的Gag抗体反应,但Gag与Gp160双表达质粒免疫或含Gag、Gp160和RTN质粒联合免疫的Gag抗体反应均较弱。ELISPOT检测表明,7种DNA疫苗单独或不同组合方式免疫均能诱发针对Gag、Pol、Gp160、Tat和Nef的细胞免疫反应;单基因表达质粒单独免疫诱发的细胞免疫反应最好,含gagpol和gp160双基因表达质粒单独免疫或与含其它基因质粒联合免疫诱发的Gag、Pol和Gp160细胞免疫明显低于含Gagpol或Gp160单基因质粒诱发的相应免疫反应,但诱发的Tat和Nef细胞免疫与相应单基因质粒免疫组无明显差别。本研究结果显示,不同表达构建体的多种HIVB'/C亚型的基因gagpol、gp160和rtn均能从pSCK2质粒中较好地表达;不同基因结构和不同组合免疫的优化,特别是含gag和gp160基因疫苗联合免疫程序的进一步优化对提高其免疫效果是必要的。     

利用酵母双杂交技术筛选人PROKR2蛋白C端相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交技术从人c DNA文库中筛选人前动力蛋白受体2(hPROKR2)C端相互作用蛋白。方法:复苏酵母菌Y2HGold-hPROKR2-C,与人c DNA文库杂交,计算杂交效率;筛选相互作用克隆并测序,寻找hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白;通过在DDO/X、QDO/A/X平皿上划线,对筛选到的人c DNA文库质粒的自活性进行验证;采用GST pull down进一步验证两者之间的相互作用。结果:酵母双杂交实验的杂交融合效率为1.375×10~8;在人cDNA文库中筛选出hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白SNAPIN,GST pull down实验证实两者之间存在相互作用。结论:SNAPIN可与hPROKR2蛋白C端结合。     

减毒痢疾菌为载体的HIV gag DNA疫苗的免疫原性

最近有报道指出,减毒侵袭性活菌可作为DNA疫苗的载体而被应用。在本研究中,我们将血清型为2a rfbF志贺氏菌属福氏痢疾杆菌变异株用于编码HIV-1 SF2 Gag蛋白的DNA疫苗的免疫。重组的细菌载体将gag DNA递呈给哺乳动物细胞,实现了Gag蛋白的表达,     

1型和2型外壳蛋白构建的AAV载体携带HIV-1 gag诱导免疫反应的比较研究

比较两种血清型的腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体携带HIV-1gag基因肌肉注射诱导小鼠免疫反应的特点。分别制备携带EGFP和HIV-1gag基因的重组AAV2/1(AAV1)和AAV2载体。小鼠肌肉注射rAAV1-EGFP和rAAV2-EGFP,观察注射局部EGFP的表达。将rAAV1-gag和rAAV2-gag分别以0、3周初免/加强方式肌肉注射免疫BALB/c小鼠以及新西兰白兔。ELISA法检测抗HIV-1 Gag P24蛋白的特异性抗体,细胞内细胞因子染色法检测Gag特异性的CTL反应。结果表明,rAAV1-EGFP在小鼠肌肉的表达强度显著高于rAAV2-EGFP;用Western blot法和间接免疫荧光法检测rAAV1-gag和rAAV2-gag体外转染的293细胞,均可检测到HIV-1 Gag蛋白的表达;在小鼠体内rAAV1-gag和rAAV2-gag组均可检测到特异性P24抗体,抗体滴度rAAV1-gag组显著高于rAAV2-gag组;而无论rAAV1-gag组还是rAAV2-gag组,特异性CTL反应均较低,与阴性对照组相比均无显著性差异;两种载体免疫兔子也都可检测到特异性P24抗体,同样地,rAAV1-gag组显著高于rAAV2-gag组。结论:携带HIV-1gag基因的rAAV1或rAAV2以肌肉注射方式免疫小鼠主要诱导特异Gag的体液免疫反应;且rAAV1可诱导很强的抗HIV-1 Gag特异性抗体,抗体水平显著高于rAAV2。     

HIV-1 Gag蛋白的高效表达调控研究

LTR位于HIV前病毒同DNA基因组的两末端,Gag基因位于5′端LTR的下游。LTR对转录的调控作用主要是由5′端LTR进行的。LTR具有启动子的作用,在结构上具有真核启动子的典型特征。另外,HIV-1 Gag蛋白还有能够自我装配成病毒样粒子(virus like particle,VLP)并从细胞中释放出来的重要特性。 我们利用痘苗病毒表达系统,探索了在细胞质环境中LTR中的多种功能结构对Gag蛋     

原癌基因LMO3相互作用蛋白的筛选及鉴定

目的 通过筛选LMO3的相互作用蛋白,进一步了解LMO3的作用及可能机制。方法酵母双杂交方法筛选LMO3相瓦作用蛋白,并通过酵母结合试验、免疫共沉淀及荧光共定位等进行验证。结果在初步获得相互作用蛋白：钙-整合素结合蛋白（Calcium—and integrin—binding protein,CIB）的基础上,在酵母中证实了LMO3与CIB的相互作用,并通过酵母结合试验确定了CIB与LMO3的相互作用位点,发现CIB可与LMO3的第一个LIM结构域（LIMI）及全长LMO3结合,免疫共沉淀试验确证了它们可以在真核细胞内结合,荧光共定位表明与CIB的相互作用可使LMO3在C8细胞中的定位由细胞核移到细胞质。结论LMO3可以与CIB在真核细胞中发生相互作用,提示LMO3可能通过与CIB的相互作用参与细胞相关功能的调节。     

基于BLI技术的脂多糖转运蛋白LptA/LptC相互作用检测方法的建立

革兰阴性菌脂多糖转运蛋白 (Lipopolysaccharide transport,Lpt) LptA和LptC通过稳定的相互作用对脂多糖装配起到重要作用,它们相互作用的阻断会导致脂多糖层缺损和菌体死亡,因此具备成为抗菌药物筛选靶标的可行性。文中应用生物膜干涉 (Biolayer interferometry,BLI) 技术对LptA/LptC相互作用进行检测,为建立体外的LptA/LptC蛋白相互作用阻断剂筛选方法奠定基础。首先在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中进行大肠杆菌LptA全长、LptA去信号肽和LptC蛋白的表达;纯化的蛋白使用生物素标记后结合到预先稀释液封闭的超级链霉亲和素 (Super streptavidin,SSA) 生物传感器,然后再检测与未标记蛋白之间的结合信号,同时做无蛋白的稀释液对照;使用同样的方法检测生物素化蛋白与小分子的结合以及相互作用的阻断;空白对照采用未结合生物素化蛋白的传感器,检测上述系列稀释样品。响应信号采用稳态分析 (Steady state analysis) 方式拟合,计算样品平衡常数 (KD) 值。本研究成功获得高纯度的LptA和LptC蛋白,并且检测到结合传感器的LptC蛋白与LptA全长蛋白和LptA去信号肽蛋白均具有良好的结合活性,KD值分别为2.9e–7±7.9e–8、6.0e–7±2.8e–8;结合传感器的LptA去信号肽蛋白与LptC蛋白具有良好的结合活性,KD值为9.6e–7±7.2e–9;所有结合曲线呈现出明显的快结合-快解离形态。小分子化合物IMB-881能够与LptA结合来阻断LptA/LptC之间的相互作用,与LptC之间无结合活性。文中首次建立了基于BLI技术的LptA/LptC相互作用检测方法,并且证实该方法能够用于小分子阻断剂阻断活性的评价,为后续的LptA/LptC蛋白相互作用阻断剂筛选奠定了基础。     

植物ATG8结合蛋白

ATG8（自噬相关蛋白8）结合蛋白通过ATG8相互作用基序（ATG8 interaction motif,AIM）或泛素相互作用基序（ubiquitin interaction motif,UIM）与ATG8相互作用,在自噬、选择性自噬和非自噬过程中起关键作用。ATG8结合蛋白在酵母和哺乳动物研究中取得了巨大进展,但在植物领域仍然滞后。本文首先概括了植物ATG8蛋白结构及特征,其次,重点阐述了作为植物选择性自噬受体的ATG8结合蛋白的结构和功能,最后,总结了参与自噬小体闭合、转运和人工合成ATG8结合蛋白研究状况。本文结合最新研究,系统总结了目前发现的植物ATG8结合蛋白结构和功能,以期为植物选择性自噬和自噬的研究提供新思路。     

FHL2通过相互作用抑制分化抑制蛋白家族成员的转录抑制活性

目的：探讨FHL2与Id（分化抑制蛋白）家族蛋白之间的相互作用及FHL2对Id蛋白功能的调控效应。方法：用GST-pulldown与免疫共沉淀（CoIP）方法检测FHL2与Id家族蛋白成员之间在体内外的相互作用;用共转染与报告基因驱动的萤光素酶方法检测FHL2对Id蛋白介导转录抑制效应的调控作用。结果：FHL2与Id家族的4个蛋白均存在直接的相互作用关系,表位分析结果显示FHL2蛋白中的第2个LIM结构域在FHL2/Id相互作用中是必需的,Id蛋白N端结构域在介导FHL2/Id相互作用中是必需的,FHL2/Id相互作用不依赖于Id蛋白中的螺旋-环-螺旋结构;通过相互作用,FHL2阻止了Id蛋白对碱性螺旋-环-螺旋转录因子E47转录活性的抑制作用。结论：FHL2是一个新识别的Id蛋白广谱的相互作用因子,通过对Id蛋白功能活性的抑制效应,FHL2可能参与Id介导的多种生物学效应以及肿瘤发生与进展。     

TSG101在病毒出芽过程中的作用及其机制

TSG101基因是新发现的抑癌基因候选者,定位于人类 11号染色体 p1511-p1512,其编码产物TSG101蛋白N端区域与泛素结合酶(UBC)同源。近年来研究发现,TSG101基因具有多种重要的功能,与多种病毒出芽密切相关,所以TSG101可作为一个新的抗病毒靶点。本文主要从TSG101在多种病毒（HIV、IAV、MARV、ASV等）出芽过程中扮演的角色,TSG101与多种蛋白(泛素、Nedd4、ARMMs、Tom1、Gag、VP40、NP等)的相互作用进而辅助病毒出芽的机制,以及TSG101抑制剂的研究等方面进行阐述。     

ORP8与SPAG5相互作用并影响细胞周期

目的：筛选与氧化固醇结合蛋白相关蛋白8（Oyxterol binding protein related protein 8,ORP8）相互作用的蛋白质,为揭示ORP8在细胞中的功能及其机制提供线索,并根据相互作用蛋白质初步探索ORP8的功能。方法：构建重组诱饵质粒pGBKT7-ORP8m,利用GAL4酵母双杂交系统筛选人Universal cDNA文库,筛选出与ORP8相互作用的蛋白质,通过GSTPull-down以及免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）验证蛋白质相互作用,并通过流式细胞仪检测过表达ORP8对HepG2细胞周期的影响。结果：酵母双杂交筛选得到了精子相关抗原5（Homo sapiens sperm associated antigen 5,SPAG5）,体外GSTpull-down和Co-IP实验确证了ORP8-SPAG5的相互作用,流式细胞术显示ORP8过表达后与空载体相比,人肝癌细胞系HepG2的S期细胞数增加,G1期细胞数减少。结论：SPAG5是与ORP8相互作用的蛋白质,ORP8过表达影响人肝癌细胞系HepG2的细胞周期,可能通过SPAG5起作用。ORP8-SPAG5的相互作用为进一步研究ORP8在肝细胞中的功能及其机制提供了有用的线索     

ORP8 与SPAG5 相互作用并影响细胞周期

目的:筛选与氧化固醇结合蛋白相关蛋白8(Oyxterol binding protein related protein 8,ORP8)相互作用的蛋白质,为揭示ORP8在细胞中的功能及其机制提供线索,并根据相互作用蛋白质初步探索ORP8的功能.方法:构建重组诱饵质粒Pgbkt7-ORP8m,利用GAL4酵母双杂交系统筛选人Universal Cdna文库,筛选出与ORP8相互作用的蛋白质,通过GST Pull-down以及免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)验证蛋白质相互作用,并通过流式细胞仪检测过表达ORP8对HepG2细胞周期的影响.结果:酵母双杂交筛选得到了精子相关抗原5(Homo sapiens sperm associated antigen 5,SPAG5),体外GST pull-down和Co-IP实验确证了ORP8-SPAG5的相互作用,流式细胞术显示ORP8过表达后与空载体相比,人肝癌细胞系HepG2的S期细胞数增加,G1期细胞数减少.结论:SPAG5是与ORP8相互作用的蛋白质,ORP8过表达影响人肝癌细胞系HepG2的细胞周期,可能通过SPAG5起作用.ORP8-SPAG5的相互作用为进一步研究ORP8在肝细胞中的功能及其机制提供了有用的线索