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采用cDNA-PCR技术,从人胎盘cDNA文库DNA中克隆了人碱性成纤维在子(hbFGF)基因,用PCR突变法对其5&端序列进行修饰,奖天然和修饰后的hbFGF基因分别克隆至表达载体pBV221,免疫抑迹和SDS-PAGE结果证明,经修饰后的基因在大肠杆菌DS5α中获得了表达,表达量占菌体总蛋白9%。 相似文献
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低氧对肺动脉内皮细胞PDGF—B链释放及平滑肌细胞生长的影响 总被引:3,自引:0,他引:3
应用蛋白dotblot技术检测了低氧内皮细胞条件培养液(HECCM)和常氧内皮细胞条件培养液(NECCM)内PDGF相对含量,并利用[3H]-TdR掺入法和流式细胞术观察了HECCM和NECCM及加入特异PDGF抗体对肺动脉平滑肌细胞(PASMC)生长的影响。结果表明,HECCM中的PDGF含量明显高于NECCM;HECCM能明显增强PASMC内DNA合成,促进PASMC从Go/G1期进入S期;当预先加入PDGF-B链抗体时,则会明显地抑制HECCM对PASMC的DNA合成,阻止PASMC从Go/G1期进入S期。结果提示,低氧时PASMC增殖与肺动脉内皮细胞分泌释放PDGF增加有关 相似文献
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化学修饰对反义寡核苷酸稳定性及抗流感病毒活性的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
为了探讨 A S O D N 化学修饰形式与 A S O D N 稳定性,体外细胞毒性以及抗流感病毒活性之间的关系,合成了 7 种不同化学修饰形式的 A S O D N:硫代 A S O D N 及其 3′端分别磷酸化和胆固醇修饰;3′与 5′端硫代,中间为天然结构的混合骨架 A S O D N;天然结构 A S O D N 及其 3′端分别磷酸化和胆固醇修饰等.测定了 7 种修饰体在小鼠血清, M D C K 细胞裂解液,含 2% 胎牛血清的 D M E M培养液以及水中的稳定性,体外细胞毒性和在细胞水平抗流感病毒活性.结果表明,混合骨架 A S O D N,硫代 A S O D N 及其 3′端接磷酸和胆固醇的修饰形式在小鼠血清, M D C K 细胞裂解液与含2% 胎牛血清的 D M E M 培养液中稳定性相对较高,作用 24~48 h 仅混合骨架 A S O D N 与硫代 A S O D N 发生部分降解;天然结构 A S O D N 及其 3′端接磷酸和胆固醇修饰体在 24 h 内大部分降解.所有 A S O D N 修饰体在水中具有很高稳定性,48 h 内未见降解作用.7 种 A S O D N 修饰形式在 M D C K 细胞中未表现明显的细胞毒性.硫代 A S O D N 及其 3′端接磷酸和胆 相似文献
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通过培养的人主动脉平滑肌细胞(hASMC)及脐静脉内皮细胞(hUVEC),应用3H-TdR参入、Northernblot分析、逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、放射免疫分析(RIA)、和紫外比色法等技术观察了人主动脉中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)对hASMC和hUVECDNA合成的作用及对血小板源生长因子(PDGF)、PDGF受体、转化生长因子β(TGF-β)、内皮素-1(ET-1)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因表达和肾素-血管紧张系统(RAS)的影响,结果显示,HSPG明显抑制培养的hASMC基础的DNA合成(cpm值为:10385±3263vs,25541±6421,P<0.01)及外源性PDGF诱导的DNA合成(cpm值为:9878±1947vs.13481±44l0,P<0.05);抑制PDGFA链、TGF-Bp和ET-1mRNA表达,提高PDGFa和β受体mRNA的表达;显著降低hASMC培养液中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的浓度和血管紧张素转换酶(ACE)的活性,推测HSPG抑制PDGFA链、TGF-β及ET-1mRNA表达,降低ACE活性及AngⅡ浓度是其抑制hASMC增殖的重要机 相似文献
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含人IL—2基因的真核表达质粒的构建及其在真核细胞… 总被引:4,自引:0,他引:4
本工作用PCR由人的外周血单个核细胞cDNA中获取了带有信号肽的IL-2全cDNA克隆,并构建了不同的表达质粒:带有SV40启动子的以质粒为载体的pSVK3-IL2和以逆转录病毒为载体的pLN-IL2系列?pLNCIL2,pLNSIL2,pLIL2SN,它们分别带有CMV、SV40和LTR启动子。用DEAE-Dextran法、SA-脂质体法和电穿孔等方法分别将这些IL-2表达质粒转染入COS-7及 相似文献
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利用COS7细胞暂时表达系统,研究转译起始序列对EPO-cDNA表达的影响。通过DNA重组技术,构建了原EPO-cDNA表达载体pCSV-EPO(1),其转译起始序列为5'AATTCATGG3'。同时通过定点突变技术,将起始序列改变成5'CCACCATGG3',而构建了另一表达载体PCSV-EPO(2)。后经序列分析证明无误后和前均通过DEAE-dextran法转染COS7细胞上清,测定结果为 相似文献
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LIF基因转染的ES细胞生长与分化特性的研究 总被引:11,自引:0,他引:11
我们将人D型LIFcDNA以正反两种方向分别克隆到载体PKCR3,并引入neo基因,构建成pSVLD和PSVLD质粒,按磷酸钙沉淀法分别转染ES-5胚胎干细胞,,经G418和没浓度LIE条件培液共同筛选,,Northern和Southern分析以及ES-5细胞集落分化抑制能力测定,建立了过度表达分泌LIF的ESL(+)细胞株和表达外源反义LIFRNA的ESL(-)细胞株。我们发现,我们发现,ESL 相似文献
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报道了内皮素A型受体反义寡聚核苷酸(ODNs)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及内皮素受体基因表达的影响.~3H-TdR参入结果显示,内皮素A型受体反义ODNs处理细胞可显著抑制内皮素诱导的VSMC的DNA合成,反转录-PCR及受体结合实验结果表明,ODNs的上述作用与降低VSMC内皮素A型受体基因表达活性有关. 相似文献
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抑瘤素M cDNA的克隆及表达研究 总被引:1,自引:0,他引:1
抑瘤素M是一种我功能的细胞生长调节因子,从PMA刺激后的U937细胞系提取总RNA,采用逆转录-PCR方法分离到了抑瘤素M的CDNA;将抑瘤素M的CDNA克隆到质粒PUC19中,筛选三个阳性克隆进行序列分析,与国外报导序列完全一致;将抑瘤素M的CDNA克隆到质粒PBV220后再转化DH5α进行模拟表达,SDS-PAGE分析表明有OSM表达,表达量约占细菌总蛋白5%,经过初步纯化的OSM能明显抑制A 相似文献
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福尔马林固定云南鲴的DNA提取及其细胞色素b基因序列分析 总被引:12,自引:0,他引:12
福尔马林固定云南鲴的DNA提取及其细胞色素b基因序列分析DNAEXTRACTEDFROMFORMALIN-FIXEDXenocyprisyunnanensisANDSEQUENCEANALYSISOFITSCYTOCHROMEBGENE关键词福尔马林... 相似文献
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辣椒疫霉产毒共分离RAPD标记的研究 总被引:9,自引:0,他引:9
辣椒疫毒(Phytophthora capsici)毒素的产生是由一个不完全显性基因所控制,通过RAPD/BSA分析证明,用OPW12扩增得到一条约1300bp的RAPD标记带,该带与辣椒疫霉产毒共分离。纯化回收OPW121300DNA,共转化感受态E.coli DH5α,筛选出3个白色阳性克隆,序列分析发现该标记DNA为1291bp。这一标记DNA序列的阐明为进一步分析产毒遗传机理提供了新的信息 相似文献
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对酵母NMT基因在大肠杆菌中表达进行较详细的研究,进而构建了复制子为p15A并含卡那霉素抗性基因的相容性表达质粒pKZMT,将其与表达质粒pCZmCα1共转化进大肠杆菌BL21(DE3)F′,进行双质粒表达偶联加工修饰研究,其中pCZmCα1表达底物蛋白小鼠cAMP依赖的蛋白激酶催化亚基α(PKA-mCα)。SDSPAGE及Westernblot分析表明,双质粒表达系统中,PKA-mCα都得到了稳定的高表达,尤其在23℃低温诱导表达时,表达产物的可溶性部分明显增多;而酵母NMT被控制在有利于活性功能的可溶性低水平表达。[3H]myristicacid标记测定及放射自显影的结果显示,在大肠杆菌中表达的重组PKA-mCα被豆蔻酰化修饰。 相似文献
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MAPK对胰岛素介导的人血管平滑肌细胞PKCα的影响 总被引:7,自引:0,他引:7
目的:在胰岛素的干预下,观察MAPK反义寡核苷酸(ODNs)对人血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及PKCα表达的影响。方法:3HTdR掺入法检测VSMC增殖,逆转录PCR、免疫组织化学法检测PKCα表达。结果:反义ODNs 处理的细胞可显著抑制胰岛素诱导的VSMC的DNA合成,ODNs 的上述作用与降低VSMC内PKCα基因表达有关。结论:胰岛素刺激人VSMC增殖可被MAPK反义寡核苷酸所抑制,可能存在有关胰岛素PKCMAPK激活途径 相似文献
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以对硝基苯糖苷基为底物,测定了慈菇的12种糖苷酶,其中α-甘露糖苷酶、α-和β-半乳糖苷酶活力较高;经硫酸铵分级沉淀,SephadexG-150分子筛层析,ConASepharose4B亲和层析,DEAE-SepharoseCL-6B离子交换层析,从慈菇抽提液纯化了α-半乳糖苷酶。纯化酶的比活提高1072倍,活力回收15.6%,在圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-PAGE上均显示1条蛋白质带,在α-半乳糖苷酶浓度为150mU/ml的溶液中测不到其他糖苷酶的活力。慈菇α-半乳糖苷酶的分子量用SephadexG-100凝胶过滤柱测定或在SDS-PAGE上测定均为60kD,酶反应的最适pH在5.8附近,最适温度为60℃。该酶分解对硝基苯基-α-半乳糖苷的K_m值为3.7×10 ̄(-4)mol/L,V_m值为2.1×10 ̄(-4)mol/L。银离子、汞离子显著抑制酶活力,D-半乳糖和密二糖均竞争性地抑制该酶水解对硝基苯基α-D-半乳糖苷的活力,根据Dixon作图求得其K_i值分别为0.92×10 ̄(-3)mol/L和1.98×10 ̄(-3)mol/L。2-脱氧-D-半乳糖和L-岩藻糖为酶活力的非竞争性抑制剂。化学修饰 相似文献
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反义凝血酶受体基因的表达对人ASMC增殖的影响 总被引:3,自引:0,他引:3
介入治疗后再狭窄的发生严重降低了该治疗手段的最终疗效.为探讨再狭窄的发生机理、寻找有效的预防手段,利用反义RNA技术构建了含有部分反义凝血酶受体(ATR)cDNA片段的真核表达质粒pcDNA3/ATR,并观察了其对培养的人主动脉平滑肌细胞(ASMC)增殖的影响.结果表明pcDNA3/ATR的瞬时转染即能显著抑制人ASMC的3H-TdR参入量,且该作用与导入的DNA量呈剂量依赖性.说明部分反义凝血酶受体基因的表达可以抑制ASMC的增殖 相似文献